一種人羧酸酯酶hCE2的高特異性熒光探針及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及人羧酸酯酶亞型2 (hES2)的特異性熒光探針 及其應用。
【背景技術】
[0002] 羧酸醋酶（Carboxylesterase，CES)是機體內重要的I相水解代謝酶，催化多種 內源性和外源性化合物發生酯鍵斷裂，釋放出極性的醇和羧酸分子片段，后者進而被體內 CYP450或UGTs等其他代謝酶繼續催化代謝，使藥物分子更有效地被排出體外。多種結構中 含有酯鍵的藥物分子，如鹽酸伊立替康（11^11 〇仏(^11，0?1'-11)、奧司他韋（達菲）、氯吡格雷 等均被羧酸酯酶催化進行活化或代謝消除。
[0003] 人體內介導藥物代謝的羧酸酯酶主要分布在2個家族：hCEl和hCE2,其中hCEl又 可繼續被分為hCElb和hCElc兩種亞型。hCEl和hCE2具有不同的組織分布特異性及底物 選擇性，人的肝臟中主要分布表達hCEl，同時表達一定量的hCE2,而小腸中則基本以hCE2 亞型為主，只有極少量的hCEl分布。近年來發現多種腫瘤細胞中hCE2的表達水平上調，可 借助此特征設計經hCE2特異性水解的抗腫瘤前體藥物實現靶向選擇性殺傷腫瘤細胞的目 的。此外，多數口服前藥需先經過腸道才能被吸收進入血液循環，因此腸道中hCE2酶對酯 類藥物的代謝被認為是其首次代謝的重要組成部分，hCE2酶活性的差異對于前體藥物的生 物利用度具有十分重要的影響。此外，有些經靜脈給藥的前體藥物，如鹽酸伊立替康，會經 過膽汁排泄被分泌到腸道中，繼而被腸道中的hCE2催化水解釋放出毒性代謝產物SN-38， 后者被認為是導致伊立替康遲發型腹瀉副作用的主要原因。因而，建立基于探針的高通量 技術手段，對于篩選hCE2的高效抑制劑并將其應用于減緩伊立替康導致的遲發型腹瀉，以 及對hCE2功能的定量檢測都十分重要。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種人羧酸酯酶hCE2的特異性熒光探針及其應用，該底 物原型和水解產物的熒光屬性具有明顯差異，且產物更易檢測。利用該探針反應可對多種 生物體系中hCE2的分布和功能進行定量評價。
[0005] 本發明提供了一種人羧酸酯酶亞型2 (hCE2)的特異性熒光探針底物，該底物的酯 鍵在人源組織或細胞中可被hCE2特異性水解為相應水解產物并顯示與底物不同的發射波 譜；該底物是以4-三氟甲基-7-羥基香豆素類化合物為原料，通過酯化反應獲得相應7-羥 基酯類衍生物，其結構通式如式（1)所示，其中，R為苯基、對甲基苯基、對乙基苯基、對丙基 苯基、對己基苯基、對硝基苯基、對氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、 4-乙氧基苯基取代基中的一種。
[0006]
【主權項】
1. 一種人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針，其特征在于：該探針的底物的醋鍵可被 hCE2特異性水解為相應水解產物并產生產物對應的巧光； 該底物為4-S氣甲基-7-哲基香豆素醋類衍生物，其結構通式如式（1)所示，其中， R為苯基、對甲基苯基、對己基苯基、對丙基苯基、對己基苯基、對硝基苯基、對氯苯基、1-奈 基、2-快喃基、2-唾吩基、（4-苯基）苯基、4-己氧基苯基取代基中的一種。
2. -種權利要求1所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應用，其特征在于：該 探針底物作為hCE2的特異性底物，可利用其水解反應活性，通過定量檢測單位時間內水解 產物的生成量來測定不同酶源中hCE2的活性。
3. 根據權利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應用，其特征在于：所 述酶源為重組表達的hCE2單酶、人或動物組織制備液或各類組織細胞生物樣品。
4. 根據權利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應用，其特征在于：所 述水解反應體系抑介于5. 5?10. 5之間；探針底物的濃度介于1/10?lOKm之間；解育體 系反應溫度介于20?60°C之間，同時水解產物的轉化率應介于0. 1%?20%之間。
5. 根據權利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應用，其特征在于：該 探針底物不具備巧光而其水解產物具有巧光屬性，可采用巧光檢測器實現產物及底物的快 速靈敏檢測；巧光檢測條件為：激發波長330?400nm，在420?660nm進行巧光發射譜的 檢測。
6. 根據權利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應用，其特征在于：該 特異性探針底物及其水解反應可用于hCE2抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。
【專利摘要】一種人羧酸酯酶hCE2的高特異性熒光探針及其應用，該特異性探針底物是4-三氟甲基-7-羥基香豆素類化合物酯類衍生物，可用于檢測不同生物樣品中hCE2的存在與否及其活力的定量測定。酶活性具體測定流程如下：選擇4-三氟甲基-7-羥基香豆素酯類衍生物水解反應為探針反應，選擇適宜底物濃度在線性反應區間內通過定量檢測單位時間內水解代謝產物4-三氟甲基-7-羥基香豆素的生成量來測定各生物樣品、細胞、載體及整體器官中hCE2酶的實際活性。本發明不僅可用于不同來源生物樣本中hCE2酶活性的定量評估，此外借助該探針反應還可用于體外快速篩選hCE2的抑制劑。
【IPC分類】C12Q1-44, C09K11-06, C07D407-12, C12Q1-04, C07D409-12, C07D311-16
【公開號】CN104592985
【申請號】CN201410836704
【發明人】崔京南, 馮磊
【申請人】大連理工常熟研究院有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月29日