Xten綴合組合物和制造其的方法

Xten綴合組合物和制造其的方法
【專利摘要】本發明涉及延伸重組多肽(XTEN)組合物、包含XTEN和連接到適用于與藥理活性的有效負載綴合的交聯劑的XTEN的綴合組合物、制造高度純化的XTEN的方法、制造XTEN-接頭和XTEN-有效負載綴合物的方法，以及使用XTEN-交聯劑和XTEN-有效負載組合物的方法。
【專利說明】XTEN綴合組合物和制造其的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年2月27日提交的美國臨時申請序號61/634, 312、2012年6月 18日提交的美國臨時申請序號61/690, 187和2012年10月4日提交的美國臨時申請序號 61/709, 942的優先權益，這些申請以引用的方式并入本文中。
[0003] 發明背景
[0004] 延長治療劑（不管是治療性蛋白質、肽還是小分子）的半衰期常常需要對治療劑 本身進行專門的配制或修飾。常規的修飾方法，如聚乙二醇化、向治療劑中添加抗體片段或 白蛋白分子，具有許多明顯的缺點。雖然這些經修飾的形式可以大規模地制備，但這些常規 方法一般受到高的商品成本、復雜的制造工藝和最終產物的低純度所困擾。時常難以（如 果不是不可能的話）純化到目標實體的同質性。對于聚乙二醇化來說尤其如此，聚乙二醇 化的反應本身無法精確地受控制以產生帶有相同數目或質量的聚乙二醇的經聚乙二醇化 的試劑的同質群體。此外，這些經聚乙二醇化的試劑的代謝物可以具有嚴重的副作用。舉 例來說，已經觀測到經聚乙二醇化的蛋白質在動物模型中引起腎小管空泡形成（Bendele， A., Seely, J. , Richey, C. , Sennello, G.和 Shopp, G. Short communication:renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol-conjugated proteins. Toxicol. Sci. 1998. 42, 152-157)。腎清除的經聚乙二醇化的蛋白質或其代謝物可以在腎中 積聚，導致PEG水合物的形成，PEG水合物干擾正常的腎小球濾過。另外，動物和人類可以經 過誘導來制造針對PEG的抗體（Sroda，K.等人Repeated injections of PEG-PE liposomes generate anti-PEG anti bodies. Cell. Mol. Biol. Lett. 2005. 10,37-47)。
[0005] 因此，對適用于在合理的成本下生產具有延長的半衰期特性的治療劑的高純度形 式的替代性組合物和方法仍有相當大的需要。 發明概要
[0006] 本發明解決了這一需要并且提供了相關優勢。本文所公開的組合物和方法不僅適 用作治療劑，而且特別適用作候選治療劑的臨床前和臨床開發的研究工具。在一些方面，本 發明一部分是通過產生延伸重組多肽（XTEN)試劑來解決這一需要，這些試劑可以使用一 個或幾個簡單的步驟純化到同質，和/或可以使用多種多樣的綴合方法與具有反應基團的 有效負載肽、蛋白質和小分子進行化學綴合。XTEN試劑的使用產生XTEN連接的試劑的高產 率產物，其與未經綴合的產物相比在一個或多個方面是優良的，包括高同質性、高溶解度、 長穩定性和提高的終末半衰期。
[0007] 本發明一部分是關于新穎組合物，其包含基本上同質的延伸重組多肽（XTEN)，這 些XTEN適用作連接到一個或多個有效負載藥理活性劑或生物活性劑的綴合伴侶，從而得 到XTEN-有效負載組合物。在一個方面，本發明提供了經過工程改造以直接或經由交聯劑 共價連接到一個或多個有效負載的XTEN，從而得到XTEN-有效負載組合物，這種組合物包 含一種、兩種、三種或更多種類型的有效負載的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9 個或10個或更多個分子。本發明的一個目的在于提供這些經工程改造的XTEN多肽，用來 與所關注的有效負載劑形成綴合物，作為具有增強的醫藥學特性（包括增強的藥物動力學 特性）的組合物。本發明提供了在長度和序列上基本上同質的XTEN，其適用于制備包含連 接到一個或多個有效負載的XTEN的綴合物，以使所得XTEN-有效負載綴合物具有高純度。 高純度的這些綴合物適用于制備用于患有醫學病狀的受試者的醫藥組合物，對此，一個或 多個有效負載具有預防、治療或改善這種病狀的效用。
[0008] 在第一個方面，本發明提供了基本上同質的XTEN多肽組合物，其適用作綴合伴侶 以形成XTEN-交聯劑中間物和XTEN-有效負載組合物。在一些實施方案中，本發明提供了 多肽的基本上同質的群體，其包含延伸重組多肽（XTEN)，并且其中所述群體中至少90%、 91 %、92 %、93 %、94%或95 %的個別多肽分子具有相同的序列長度。在前述的一個實施方 案中，XTEN的特征在于：總XTEN氨基酸殘基是至少36個至約3000個氨基酸殘基；甘氨酸 (G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、谷氨酸（E)和脯氨酸（P)殘基的總和占 XTEN的 總氨基酸殘基的約90%以上；XTEN序列是基本上非重復的，以使得（i)XTEN序列不含有相 同的三個連續氨基酸，除非這些氨基酸是絲氨酸，（ii)至少約80%、或約90%、或約95%的 XTEN序列由非重疊的序列基序組成，這些序列基序中的每一者包含約9個至約14個氨基 酸殘基，其中任何兩個相連氨基酸殘基在這些序列基序中的每一者中不會出現兩次以上； 或（iii)XTEN序列具有小于10的子序列計分；如通過G0R算法所測定，XTEN序列具有大 于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大于99%的無規卷曲形成率；如 通過Chou-Fasman算法所測定，XTEN序列具有小于2%、或3%、或4%、或5%的α螺旋； XTEN序列具有小于2%、或3%、或4%、或5%的β折疊；并且當通過ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法進行分 析時，XTEN序列缺乏預測的Τ細胞表位，其中對于XTEN序列內的表位的ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法預測 是基于-8、或_9、或-10的計分。在前述的另一個實施方案中，XTEN包含與選自由表2、表 3、表4和表22-25中所闡述的序列組成的組的序列具有至少約90%、或至少約91 %、或至 少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、 或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性的序列。
[0009] 在其它實施方案中，基本上同質的XTEN多肽組合物包含一個或多個親和標簽。在 一個實施方案中，本發明提供了基本上同質的XTEN多肽組合物，其包含第一親和標簽，其 中這個第一親和標簽對選自由疏水相互作用色譜（HIC)底物、陽離子交換底物、陰離子交 換底物、固定化金屬離子親和色譜（IMAC)底物和固定化抗體底物組成的組的色譜底物具 有結合親和力。在前述的一個實施方案中，第一親和標簽與選自由表7中所闡述的序列組 成的組的序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%或至少約95%的序列同一性。在 前述XTEN和親和標簽的另一個實施方案中，組合物進一步包含一個或多個輔助序列。在 一個實施方案中，輔助序列包含與選自由表10中所闡述的序列組成的組的序列具有至少 約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或 至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性的序 列。在另一個實施方案中，輔助序列選自由以下組成的組：KNPEQAEEQX1EET，其中XI獨立 地是S或R ;ANPEQAEEQX1EET，其中Π 獨立地是S或R ;KNPEQAEEQAEEQX1EET，其中Π 獨立 地是S或R ;KX2X3EQAEEQAEEQX1EET，其中XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，并且X3 獨立地是 K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R 或 S ;KX2 (X3) 1(IQX1EET，其中 XI 獨立地是 S 或 R，X2 獨 立地是 K 或 N，并且 X3 獨立地是 K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R 或 S ;KX2 (X3) 7AEEQX1EET，其中 XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，并且X3獨立地是K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R或S ; KX2X3EQE (X3) 3AEEQREET，其中 X2 獨立地是 K 或 N，并且 X3 獨立地是 K、N、T、Q、Η、P、E、D、 A、R 或 S ;KX2X3EQE (X3) 3AEE (X3) 5，其中 X2 獨立地是 K 或 N，并且 X3 獨立地是 K、N、T、Q、H、 P、E、D、A、R 或 S ;KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)2REET，其中 X4 獨立地是 A 或 S，并且 X5 獨立地是 K、Q或E ;KKQEQEKEQAEEQ (X4X5) 4REET，其中X4獨立地是A或S，并且X5獨立地是K、Q或E ; KKQEQEKEQAEEQ(Z)4REET，其中Z是任何天然存在的L-氨基酸；KX2(X3)n，其中n是10到40 的整數，并且Χ2獨立地是Κ或Ν，并且Χ3獨立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S ; (Χ3)η，其中 η 是 10 到 50 的整數，并且 Χ3 獨立地是 K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R 或 S ;KX2QEQEKEQAEEQ(X4X5) ηΧ1ΕΕΤ，其中η是0或1到10的整數，并且XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，X4獨立 地是Α或S，并且Χ5獨立地是K、Q或Ε ;ΚΧ2 (Χ3)η(Χ4Χ5)mXlEET，其中η是5到20的整數，m 是0或1到10的整數，XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，X3獨立地是K、N、T、Q、H、P、 E、D、A、R或S，X4獨立地是A或S，并且X5獨立地是K、Q或E ;以及KX2 (X3) n (Z) J1EET，其 中η是5到20的整數，m是0或1到10的整數，XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，X3 獨立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S，并且Z是任何天然存在的L-氨基酸，以及當最佳比 對時與前述序列顯示至少80 %、90 %、95 %、98 %或99 %的序列同一性的任何序列同源物。 [0010] 在前述基本上同質的XTEN、親和標簽和輔助序列組合物的其它實施方案中，組合 物進一步包含第一裂解序列。必要時，裂解序列選自由表8和表9中所闡述的序列組成的 組。在前述的一個實施方案中，組合物具有式I的構型：
[0011] (HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I
[0012] 其中HS是輔助序列；ATI是第一親和標簽；CS1是第一裂解序列；并且XTEN是延 伸重組多肽。在前述組合物的另一個實施方案中，組合物進一步包含第二裂解序列。必要 時，第一裂解序列和第二裂解序列能夠用相同的蛋白酶裂解，并且其中組合物具有式II的 構型：
[0013] (HS) - (CS1) - (XTEN) - (CS2) - (ATI) II
[0014] 其中HS是輔助序列；ATI是第一未和標簽；CS1是第一裂解序列；CS2是第二裂解 序列；并且XTEN是延伸重組多肽。在前述組合物的另一個實施方案中，第一親和標簽包含 序列RPRPRPRPRPRPR、HHHHHH，或本領域中已知或本文所公開的任何親和標簽。
[0015] 在基本上同質的XTEN組合物的其它實施方案中，組合物包含第一親和標簽和第 二親和標簽、第一裂解序列和第二裂解序列，以及輔助序列，其中第二親和標簽不同于第一 親和標簽并且對與第一親和標簽的色譜底物不同的色譜底物具有結合親和力，其中這個色 譜底物選自由HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物、IMAC底物和固定化抗體底物 組成的組，并且其中第一裂解序列和第二裂解序列能夠用相同的蛋白酶裂解，并且其中第 二親和標簽與選自由表7中所闡述的序列組成的組的序列具有至少約9 0 %、91 %、9 2 %、 93 %、94 %或至少約95 %的序列同一性。在前述組合物的一個實施方案中，組合物具有式 III的構型：
[0016] (HS) - (ATI) - (CS1) - (XTEN) - (CS2) - (AT2) III
[0017] 其中HS是輔助序列；ATI是第一未和標簽；CS1是第一裂解序列；CS2是第二裂 解序列；XTEN是延伸重組多肽；并且AT2是第二親和標簽。在前述組合物的另一個實施 方案中，第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR并且第二親和標簽包含序列HHHHHH。在 前述組合物的另一個實施方案中，第一親和標簽包含序列并且第二親和標簽包 含序列RPRPRPRPRPRPR。在前述組合物的另一個實施方案中，第一親和標簽包含序列 RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR并且第二親和標簽包含序列HHHHHHHH。
[0018] 在另一個方面，本發明提供了包含多肽的基本上同質的群體的組合物，其是通過 一種工藝獲得。在一些實施方案中，組合物是通過包括以下的工藝來獲得：在一定條件下 于發酵反應物中培養包含編碼多肽的載體的宿主細胞，這些條件通過宿主細胞的粗表達產 物有效地表達多肽，其中經編碼的多肽包含XTEN、第一裂解序列和第一親和標簽；在一定 條件下使粗表達產物的多肽吸附到第一色譜底物上，這些條件有效地將第一親和標簽捕獲 到第一色譜底物上；洗脫多肽；以及回收多肽。在一些實施方案中，所得群體的至少90%、 91 %、92 %、93 %、94 %或95 %的多肽具有相同的序列長度。在前述組合物的一個實施方 案中，第一色譜底物選自由HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成 的組。在前述組合物的另一個實施方案中，親和標簽選自由表7的親和標簽組成的組。在 前述組合物的另一個實施方案中，第一色譜底物是陽離子交換底物并且第一親和標簽包含 序列RPRPRPRPRPRPR。在前述組合物的另一個實施方案中，第一色譜底物是IMAC底物并 且第一親和標簽包含序列HHHHHHHH。在前述組合物的一個實施方案中，編碼載體編碼本 文所描述的XTEN實施方案中的任一者，其包含至少親和標簽、至少第一裂解序列、輔助序 列和任選的第二裂解序列。在前述組合物的另一個實施方案中，載體進一步編碼第二裂解 序列和第二親和標簽，其中第一裂解序列和第二裂解序列能夠用相同的蛋白酶裂解，并且 其中第二親和標簽相較第一親和標簽對第二、不同的色譜底物具有結合親和力，并且其中 組合物是通過進一步包括以下的工藝來獲得：在一定條件下使多肽吸附到第二色譜底物 上，這些條件有效地將第二親和標簽捕獲到第二色譜底物上；洗脫多肽；以及回收多肽，其 中這個群體的至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的多肽具有相同的序列長度。在 前述的一個實施方案中，第一色譜底物不同于第二色譜底物，并且第一色譜底物和第二色 譜底物中的每一者獨立地選自由HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物 組成的組。在前述組合物的另一個實施方案中，第一色譜底物是陽離子交換底物并且第 一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR或RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR，并且第二色譜底物是 IMAC底物并且第一親和標簽包含序列或HHHHHHHH。在前述組合物的另一個實 施方案中，第一色譜底物是IMAC底物并且第一親和標簽包含序列或HHHHHHHH， 并且第二色譜底物是陽離子交換底物并且第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR或 RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR。在另一個實施方案中，包含第一親和標簽或第一親和標簽和第 二親和標簽的前述組合物是通過以下來進一步加工：在有效地使裂解序列裂解的條件下用 蛋白酶處理組合物，由此從親和標簽中釋放XTEN ;在有效地捕獲XTEN而不是親和標簽或蛋 白酶的條件下使XTEN吸附到色譜底物上；洗脫XTEN ;以及回收XTEN。所得組合物中至少 90%、91%、92%、93%、94%或95%的個別XTEN分子具有相同的序列長度。在前述組合物 的一個實施方案中，裂解序列能夠用選自由表9的蛋白酶組成的組的蛋白酶裂解。在前述 組合物的另一個實施方案中，裂解序列能夠用胰蛋白酶裂解并且蛋白酶是胰蛋白酶。在前 述組合物的另一個實施方案中，色譜底物是陰離子交換底物。陰離子交換底物可以選自由 macrocap Q、capto Q、superQ_650M和poros D組成的組的底物。或者，包含一個親和標簽 或兩個親和標簽的前述組合物是通過以下來進一步加工：在有效地使裂解序列裂解的條件 下處理組合物，由此從一個或兩個親和標簽中釋放ΧΤΕΝ ;在有效地捕獲蛋白酶和親和標簽 而不是ΧΤΕΝ的條件下使蛋白酶吸附到色譜底物上；以及從洗脫物中回收ΧΤΕΝ。在一些實 施方案中，所得洗脫物的至少90 %、91 %、92 %、93%、94%或95%的個別ΧΤΕΝ分子具有相 同的序列長度。在前述組合物的一個實施方案中，裂解序列能夠用選自由表9的蛋白酶組 成的組的蛋白酶裂解。在前述組合物的另一個實施方案中，裂解序列能夠用胰蛋白酶裂解 并且所利用的蛋白酶是胰蛋白酶。色譜底物可以選自陽離子交換底物、HIC底物或IMAC底 物中的一者或多者。
[0019] 在另一個方面，本發明一部分是關于多肽組合物，其可以被裂解成同等長度和序 列的ΧΤΕΝ區段。在一個實施方案中，本發明提供了一種包含ΧΤΕΝ序列的組合物，其中ΧΤΕΝ 序列進一步包含一個或多個能夠用胰蛋白酶裂解的裂解序列，并且其中在有效地使所有裂 解序列裂解的條件下用胰蛋白酶處理得到ΧΤΕΝ片段的制劑，其中每個ΧΤΕΝ片段與這個制 劑中所有其它的片段具有至少約99%的序列同一性。在組合物的一個實施方案中，裂解序 列與序列SASRSA或SASKSA具有至少86%的序列同一性或與序列SASRSA或SASKSA相同。 在組合物的另一個實施方案中，裂解序列包含序列RX或ΚΧ，其中X是除了脯氨酸以外的任 何L-氨基酸。在前述組合物的一個實施方案中，ΧΤΕΝ組合物與選自表6中所闡述的序列 的組的序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 的序列同一·I"生。
[0020] 在另一個方面，本發明一部分是關于產生基本上同等長度和序列的ΧΤΕΝ片段的 方法。在一個實施方案中，本發明提供了一種產生ΧΤΕΝ的基本上同質的群體的方法，這種 方法包括在有效地使所有裂解序列裂解的條件下用胰蛋白酶處理包含選自表6中所闡述 的序列的組的序列的多肽的群體，從而得到基本上同質的ΧΤΕΝ群體，其中ΧΤΕΝ片段的至少 90%、91%、92%、93%、94%或95%的個別分子具有相同的序列長度。在前述方法的一個 實施方案中，這種方法進一步包括在有效地捕獲ΧΤΕΝ片段而不是蛋白酶的條件下使ΧΤΕΝ 片段吸附到色譜底物上；洗脫ΧΤΕΝ片段；以及回收ΧΤΕΝ片段，其中這個群體的至少90%、 91 %、92 %、93 %、94 %或95%的個別分子具有相同的序列長度。在前述方法的一個實施方 案中，色譜底物是陰離子交換底物。底物可以選自由macrocap Q、capto Q、superQ-650M和 poros D組成的組。在前述方法的另一個實施方案中，ΧΤΕΝ與選自表6中所闡述的序列的 組的序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同 一性。在前述方法的另一個實施方案中，所得ΧΤΕΝ片段與選自表2或3中所闡述的序列的 組的序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同 一性。在另一個實施方案中，本發明提供了 ΧΤΕΝ組合物，其是通過前述方法的實施方案的 工藝來制造。
[0021] 在另一個方面，本發明一部分是關于以高表達產率從宿主細胞中產生ΧΤΕΝ的方 法。在一些實施方案中，本發明提供了一種方法，其包括在一定條件下于發酵反應物中培養 包含編碼包含ΧΤΕΝ和輔助序列的多肽的載體的宿主細胞，這些條件有效地以大于約2克/ 升（g/L)、或約3g/L、或約4g/L、或約5g/L、或約6g/L、或約7g/L的所述多肽的濃度表達多 肽作為粗表達產物的組分。在前述方法的一個實施方案中，當發酵反應物在600nm的波長 下達到至少100、或至少130、或至少150的光密度時，實現前述表達產率。在另一個實施 方案中，本發明提供了一種方法，其包括在一定條件下于發酵反應物中培養包含編碼包含 XTEN和輔助序列的多肽的載體的宿主細胞，這些條件有效地以大于約10毫克/克宿主細胞 干重（mg/g)、或至少約15mg/g、或至少約20mg/g、或至少約25mg/g、或至少約30mg/g、或至 少約40mg/g、或至少約50mg/g的所述多肽的濃度表達多肽作為粗表達產物的組分。在前 述方法的一個實施方案中，當發酵反應物在600nm的波長下達到至少100、或至少130、或至 少150的光密度時，實現前述高產率表達。在另一個實施方案中，本發明提供了一種方法， 其包括在一定條件下于發酵反應物中培養包含編碼包含XTEN和輔助序列的多肽的載體的 宿主細胞，這些條件有效地以大于約10毫克/克宿主細胞干重（mg/g)、或至少約250微摩 爾/升、或約300微摩爾/升、或約350微摩爾/升、或約400微摩爾/升、或約450微摩 爾/升、或約500微摩爾/升的所述多肽的濃度表達多肽作為粗表達產物的組分。在前述 方法的一個實施方案中，當發酵反應物在600nm的波長下達到至少100、或至少130、或至少 150的光密度時，實現前述表達產率。在前述方法的一個實施方案中，經表達的多肽的輔助 序列是在這個多肽的N端，其中這個輔助序列與選自由表10中所闡述的序列組成的組的序 列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%或95%的序列同一性或與選自由表10中所闡述 的序列組成的組的序列相同。在前述方法的另一個實施方案中，表達載體進一步編碼第一 親和標簽和介于這個親和標簽與XTEN之間的裂解序列，并且這種方法進一步包括回收宿 主細胞的發酵反應混合物的粗表達產物；在一定條件下使粗表達產物的多肽吸附到第一色 譜底物上，這些條件有效地將多肽的第一親和標簽捕獲到這個色譜底物上，其中第一色譜 底物選自由HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組；洗脫并回 收多肽，其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的多肽具有相同的序列長度。在前 述方法的另一個實施方案中，表達載體進一步編碼第一親和標簽和不同于第一標簽的第二 親和標簽以及介于每個親和標簽與XTEN之間的裂解序列，并且這種方法進一步包括回收 宿主細胞的發酵反應混合物的粗表達產物；在一定條件下使多肽吸附到第一色譜底物上， 這些條件有效地將多肽的第一親和標簽捕獲到這個色譜底物上，其中第一色譜底物選自由 HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組；洗脫多肽；在一定條件 下使多肽吸附到第二色譜底物上，這些條件有效地將多肽的第二親和標簽捕獲到這個色譜 底物上，其中第二色譜底物選自由HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物 組成的組；洗脫多肽；以及回收多肽，其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的多肽 具有相同的序列長度。在前述方法的一個實施方案中，這些方法進一步包括在有效地使裂 解序列裂解的條件下用蛋白酶處理多肽，由此從多肽中釋放XTEN ;在有效地捕獲XTEN的條 件下使XTEN吸附到陰離子色譜底物上；洗脫XTEN ;以及回收XTEN，其中至少90 %、或至少 91 %、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%的個別XTEN分子具有相同的序 列長度。在前述方法中，陰離子交換底物可以選自由macrocap Q、capto Q、superQ_650M和 poros D組成的組。在前述方法的一個實施方案中，裂解序列能夠用胰蛋白酶裂解并且蛋白 酶是胰蛋白酶。在前述方法的另一個實施方案中，這種方法進一步包括在有效地使裂解序 列裂解的條件下用蛋白酶處理多肽，由此從多肽中釋放XTEN ;在有效地捕獲蛋白酶和親和 標簽而不是XTEN的條件下使蛋白酶吸附到色譜底物上；以及回收洗脫物中的XTEN，其中至 少90 %、91 %、92%、93%、94%或95%的XTEN具有相同的序列長度。在前述方法的一個實 施方案中，裂解序列能夠用胰蛋白酶裂解并且所利用的蛋白酶是胰蛋白酶。在用以捕獲蛋 白酶和親和標簽的前述方法中，色譜底物可以選自HIC底物、陽離子交換底物和IMAC底物 中的一者或多者。
[0022] 在另一個方面，本發明一部分是關于一種固體支撐物，其包含固定在上面的基本 上相同的XTEN多肽分子的群體。在一個實施方案中，本發明提供了一種固體支撐物，其包 含固定在上面的基本上相同的多肽分子的群體，其中固體支撐物包含色譜底物、各自包含 XTEN、第一親和標簽和第二親和標簽的經固定的多肽，其中第一親和標簽是通過在XTEN的 N端的裂解序列連接到XTEN并且第二親和標簽是通過在C端的裂解序列連接到XTEN，并且 其中第二親和標簽不同于第一親和標簽，其中色譜底物能夠結合到所述第一親和標簽或所 述第二親和標簽而不同時結合兩者，并且其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的 經固定的多肽分子具有相同的序列長度。在一個實施方案中，XTEN包含與選自由表2、表 3、表4和表22-25中所闡述的序列組成的組的序列具有至少約90%、或至少約91%、或至 少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、 或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性的序列，第一親和標簽和第二親和標 簽各自獨立地與選自由表7中所闡述的序列組成的組的序列具有至少約90%、91 %、92%、 93 %、94%或至少約95 %的序列同一性，并且裂解序列選自由表8和表9中所闡述的序列 組成的組。在前述的一個實施方案中，裂解序列與序列SASRSA或SASKSA具有至少約86% 的序列同一性或與序列SASRSA或SASKSA相同。在前述的一個實施方案中，裂解序列包 含序列RX或KX，其中X是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸。在前述的一個實施方案中， 固體支撐物選自由HIC色譜樹脂、陽離子交換色譜樹脂、陰離子交換色譜樹脂和IMAC色 譜樹脂組成的組。在前述的一個實施方案中，第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR或 RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR并且第二親和標簽包含序列或HHHHHHHH。在前述的另 一個實施方案中，第一親和標簽包含序列或并且第二親和標簽包含序列 RPRPRPRPRPRPR 或 RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR。
[0023] 在另一個方面，本發明一部分是關于綴合到交聯劑的XTEN的組合物。在一些實施 方案中，本發明提供了本文所描述的XTEN中的任一者的組合物，XTEN共價連接到至少第一 交聯劑的一個或多個分子，其中這個交聯劑選自由表13中所闡述的交聯劑、表15中所闡述 的炔烴反應物和表15中所闡述的疊氮化物反應物組成的組。在綴合組合物的一個實施方 案中，第一交聯劑在選自由以下組成的組的位置處綴合到至少第一 XTEN :XTEN的N端氨基 酸殘基的α -氨基；XTEN的每個賴氨酸殘基的ε -氨基；以及XTEN的每個半胱氨酸殘基的 硫醇基。必要時,在這個實施方案中的XTEN與選自表2和表3中所闡述的序列的組的序列 具有至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約 95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一 性。在綴合組合物的另一個實施方案中，XTEN選自由以下組成的組：AE144、AE288、AE432、 AE576、AE864、Seg 174、Segl75、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、 Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199,并且交聯劑綴合到XTEN的N端氨基酸的a-氨基。在綴合組合物的另一個實施方案 中，XTEN選自由以下組成的組：表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Segl87、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、 Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199,并且交聯劑綴合到XTEN的每個半胱氨酸殘基的硫 醇基。在綴合組合物的另一個實施方案中，第一交聯劑選自由以下組成的組：N-馬來酰亞 胺、碘乙酰基、吡啶基二硫化物和乙烯基砜、3-炔丙氧基丙酸、（氧乙基）n-乙炔（其中η是 1-10)、二苯甲基環辛炔（DBCO)、環辛炔（COT)、3_疊氮-丙酸、6-疊氮-己酸和（氧乙基） n-疊氮化物（其中η是1-10)。在這一段的前述實施方案中，綴合物具有式IV的構型：
[0024]
【權利要求】
1. 一種產生包含XTEN序列的基本上同質的群體的組合物的方法，所述方法包括： a. 提供包含至少一個具有選自表6中所闡述的序列的組的氨基酸序列的多肽的多肽 組合物，其中所述氨基酸序列包含至少一個裂解序列， b. 在有效地使所述裂解序列裂解的條件下用胰蛋白酶處理所述多肽組合物；并且 其中所得到的XTEN序列的基本上同質的群體中至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的 個別序列具有相同的序列長度。
2. 如權利要求1所述的方法，其進一步包括： a. 在有效地捕獲所述XTEN序列而不是所述蛋白酶的條件下使所述XTEN序列吸附到色 譜底物上； b. 洗脫所述XTEN序列；以及 c. 回收所述XTEN序列，其中所述群體的至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %的個別分子具有相同的序列長度。
3. 如權利要求2所述的方法，其中所述色譜底物是陰離子交換底物。
4. 如權利要求3所述的方法，其中所述陰離子交換底物選自由macrocap Q、capto Q、 superQ_650M 和 poros D 組成的組。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述XTEN序列與選自表6中所闡述的 氨基酸序列的組的序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99 %的序列同一性。
6. 如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述XTEN序列與選自表2或3中所 闡述的氨基酸序列的組的序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98 %或99 %的序列同一性。
7. -種組合物，其是通過如權利要求1至6中任一項所述的方法來產生。
8. -種組合物，其包含多肽的基本上同質的群體，所述多肽包含延伸重組多肽 (XTEN)，并且其中所述群體中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的個別多肽分子具 有相同的序列長度。
9. 如權利要求8所述的組合物，其中所述XTEN的特征在于： a. 所述XTEN包含約36個至約3000個氨基酸殘基； b. 甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、谷氨酸（E)和脯氨酸（P)殘基的總 和占所述XTEN的總氨基酸殘基的約90 %以上； c. 所述XTEN序列是基本上非重復的，以使得（i)所述XTEN序列不含有相同的三個連 續氨基酸，除非所述氨基酸是絲氨酸，（ii)至少約80%的所述XTEN序列由非重疊的序列基 序組成，所述序列基序中的每一者包含約9個至約14個氨基酸殘基，其中任何兩個連續氨 基酸殘基在所述序列基序中的每一者中不會出現兩次以上；或（iii)所述XTEN序列具有小 于10的子序列計分； d. 如通過G0R算法所測定，所述XTEN序列具有大于90 %的無規卷曲形成率； e. 如通過Chou-Fasman算法所測定，所述XTEN序列具有小于2 %的α螺旋和2 %的 β折置；以及 f. 當通過ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法進行分析時，所述XTEN序列缺乏預測的Τ細胞表位，其中對于 所述XTEN序列內的表位的所述TEPIT0PE算法預測是基于-9的計分。
10. 如權利要求8所述的組合物，其中所述XTEN包含與選自由表2、表3、表4和表 22-25中所闡述的序列組成的組的序列具有至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、 或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約 98%、或至少約99%、或100%的序列同一性的序列。
11. 如權利要求8所述的組合物，其進一步包含第一親和標簽。
12. 如權利要求11所述的組合物，其中所述第一親和標簽對選自由疏水相互作用色譜 (HIC)底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物、固定化金屬離子親和色譜（IMAC)底物和固 定化抗體底物組成的組的色譜底物具有結合親和力。
13. 如權利要求11所述的組合物，其中所述第一親和標簽選自由表7中所闡述的序列 組成的組。
14. 如權利要求11至13中任一項所述的組合物，其進一步包含輔助序列。
15. 如權利要求14所述的組合物，其中所述輔助序列包含與選自由表10中所闡述的序 列組成的組的序列具有至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少 約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或 100 %的序列同一性的序列。
16. 如權利要求14所述的組合物，其中所述輔助序列選自由以下組成的組： a. KNPEQAEEQX1EET，其中 XI 獨立地是 S 或 R ; b. ANPEQAEEQX1EET，其中 XI 獨立地是 S 或 R ; c. KNPEQAEEQAEEQX1EET，其中 XI 獨立地是 S 或 R ; d. KX2X3EQAEEQAEEQX1EET，其中XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，并且X3獨立 地是 K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R 或 S ; e. KX2 (X3) 10QX1EET，其中XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，并且X3獨立地是K、 N、T、Q、H、P、E、D、A、R或 S ; f. KX2 (X3) 7AEEQX1EET，其中XI獨立地是S或R，X2獨立地是K或N，并且X3獨立地是 K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R*S; g. KX2X3EQE (X3) 3AEEQREET，其中 X2 獨立地是 K 或 N，并且 X3 獨立地是 K、N、T、Q、Η、P、 E、D、A、R 或 S ; h. KX2X3EQE (X3) 3AEE (X3) 5,其中 X2 獨立地是 K 或 N，并且 X3 獨立地是 K、N、T、Q、Η、P、 E、D、A、R 或 S ; i. KKQEQEKEQAEEQ(X4X5) 2REET，其中X4獨立地是A或S，并且X5獨立地是K、Q或E ; KKQEQEKEQAEEQ (X4X5) 4REET，其中X4獨立地是A或S，并且X5獨立地是K、Q或E ; j. KKQEQEKEQAEEQ (Z) 4REET，其中Z是任何天然存在的L-氨基酸； k. KX2 (X3) n，其中η是10至40的整數，并且X2獨立地是K或N，并且X3獨立地是K、 N、T、Q、H、P、E、D、A、R或 S ; l. (X3) n，其中η是10至50的整數，并且X3獨立地是K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R或S ; m. KX2QEQEKEQAEEQ (Χ4Χ5) ηΧΙΕΕΤ，其中η是0或1至10的整數，并且XI獨立地是S或 R，Χ2獨立地是Κ或Ν，Χ4獨立地是Α或S，并且Χ5獨立地是K、Q或Ε ; η· KX2 (X3) n (X4X5)mXlEET，其中η是5至20的整數，m是0或1至10的整數，XI獨立 地是S或R，X2獨立地是K或N，X3獨立地是K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R或S，X4獨立地是A 或S，并且X5獨立地是K、Q或E ;以及 o.KX2(X3)n(Z)mXlEET，其中η是5至20的整數，m是0或1至10的整數，XI獨立地 是S或R，Χ2獨立地是Κ或Ν，Χ3獨立地是K、N、T、Q、Η、P、E、D、A、R或S，并且Ζ是任何天 然存在的L-氨基酸。
17. 如權利要求11至16中任一項所述的組合物，其進一步包含第一裂解序列，其中所 述第一裂解序列選自由表8和表9中所闡述的序列組成的組。
18. 如權利要求17所述的組合物，其中所述組合物具有式I的構型： (HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I 其中 a. HS是所述輔助序列； b. ATI是所述第一親和標簽； c. CS1是所述第一裂解序列；以及 d. XTEN是所述延伸重組多肽。
19. 如權利要求17所述的組合物，其進一步包含第二裂解序列，其中所述第一裂解序 列和所述第二裂解序列能夠用相同的蛋白酶裂解，并且其中所述組合物具有式II的構型： (HS) - (CS1) - (XTEN) - (CS2) - (ATI) II 其中 a. HS是輔助序列； b. ATI是所述第一親和標簽； c. CS1是所述第一裂解序列； d. CS2是所述第二裂解序列；以及 e. XTEN是所述延伸重組多肽。
20. 如權利要求18或19所述的組合物，其中所述第一親和標簽包含序列 RPRPRPRPRPRPR 或 HHHHHH。
21. 如權利要求11至17中任一項所述的組合物，其進一步包含第二親和標簽和第二 裂解序列，其中所述第二親和標簽相較所述第一親和標簽對不同的色譜底物具有結合親和 力，其中所述色譜底物選自由HIC底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物、IMAC底物和固 定化抗體底物組成的組，并且其中所述第一裂解序列和所述第二裂解序列能夠用相同的蛋 白酶裂解。
22. 如權利要求21所述的組合物，其中所述第二親和標簽不同于所述第一親和標簽， 并且所述第二親和標簽選自表7中所闡述的序列的組。
23. 如權利要求21或權利要求22所述的組合物，其中所述組合物具有式III的構型： (HS) - (AT 1) - (CS1) - (XTEN) - (CS2) - (AT2) III 其中 a. HS是所述輔助序列； b. ATI是所述第一親和標簽； c. CS1是所述第一裂解序列； d. CS2是所述第二裂解序列； e. XTEN是所述延伸重組多肽；以及 f. AT2是所述第二親和標簽。
24. 如權利要求23所述的組合物，其中所述第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR，并 且所述第二親和標簽包含序列HHHHHH。
25. 如權利要求23所述的組合物，其中所述第一親和標簽包含序列HHHHHH，并且所述 第二親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR。
26. -種包含多肽的基本上同質的群體的組合物，其是通過包括以下的工藝來獲得： a. 在一定條件下于發酵反應物中培養包含編碼所述多肽的載體的宿主細胞，所述條件 有效地表達所述多肽作為所述宿主細胞的粗表達產物的組分，其中所述經編碼的多肽包含 XTEN、第一裂解序列和第一親和標簽； b. 在一定條件下使所述粗表達產物的所述多肽吸附到第一色譜底物上，所述條件有效 地將所述第一親和標簽捕獲到所述第一色譜底物上； c. 洗脫所述多肽；以及 d. 回收所述多肽，其中所述群體的至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的所述多 肽具有相同的序列長度。
27. 如權利要求26所述的組合物，其中所述第一色譜底物選自由HIC底物、陽離子交換 底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組。
28. 如權利要求26所述的組合物，其中所述親和標簽選自由表7的親和標簽組成的組。
29. 如權利要求27所述的組合物，其中所述第一色譜底物是陽離子交換底物，并且所 述第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR。
30. 如權利要求27所述的組合物，其中所述第一色譜底物是IMAC底物，并且所述第一 親和標簽包含序列HHHHHHHH。
31. 如權利要求26所述的組合物，其中所述載體編碼如權利要求11至19中任一項所 述的多肽。
32. 如權利要求26至28中任一項所述的組合物，其中所述載體進一步編碼第二裂解 序列和第二親和標簽，其中所述第一裂解序列和所述第二裂解序列能夠用相同的蛋白酶裂 解，并且其中所述第二親和標簽相較所述第一親和標簽對第二、不同的色譜底物具有結合 親和力，并且其中所述組合物是通過進一步包括以下的工藝來獲得： a. 在一定條件下使所述多肽吸附到第二色譜底物上，所述條件有效地將所述第二親和 標簽捕獲到所述第二色譜底物上； b. 洗脫所述多肽；以及 c. 回收所述多肽，其中所述群體的至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的所述多 肽具有相同的序列長度。
33. 如權利要求32所述的組合物，其中所述載體編碼如權利要求23所述的多肽。
34. 如權利要求32所述的組合物，其中第一色譜底物不同于所述第二色譜底物，并且 所述第一色譜底物和所述第二色譜底物中的每一者獨立地選自由HIC底物、陽離子交換底 物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組。
35. 如權利要求32所述的組合物，其中所述第一色譜底物是陽離子交換底物并且所述 第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR，并且所述第二色譜底物是IMAC底物并且所述第一 親和標簽包含序列HHHHHHHH。
36. 如權利要求32所述的組合物，其中所述第一色譜底物是IMAC底物并且所述第一親 和標簽包含序列HHHHHHHH，并且所述第二色譜底物是陽離子交換底物并且所述第一親和標 簽包含序列RPRPRPRPRPRPR。
37. 如權利要求23至28或32至34中任一項所述的組合物，所述工藝進一步包括： a. 在有效地使所述裂解序列裂解的條件下用蛋白酶處理所述組合物，由此從所述親和 標簽中釋放所述XTEN ; b. 在有效地捕獲所述XTEN而不是所述親和標簽或所述蛋白酶的條件下使所述XTEN吸 附到色譜底物上； c. 洗脫所述XTEN;以及 d. 回收所述XTEN，其中至少90%、91 %、92%、93%、94%或95%的個別XTEN分子具有 相同的序列長度。
38. 如權利要求37所述的組合物，其中所述裂解序列能夠用選自由表9的蛋白酶組成 的組的蛋白酶裂解。
39. 如權利要求38所述的組合物，其中所述裂解序列能夠用胰蛋白酶裂解，其中所述 序列選自由表8中所闡述的序列組成的組，并且其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
40. 如權利要求37或38所述的組合物，其中所述色譜底物是陰離子交換底物。
41. 如權利要求40所述的組合物，其中所述陰離子交換色譜底物選自由macrocap Q、 capto Q、superQ_650M 和 poros D 組成的組。
42. 如權利要求23至28或32至34中任一項所述的組合物，所述工藝進一步包括： a. 在有效地使所述裂解序列裂解的條件下用蛋白酶處理所述組合物，由此從所述親和 標簽中釋放所述XTEN ; b. 在有效地捕獲所述蛋白酶而不是所述XTEN的條件下使所述蛋白酶吸附到色譜底物 上；以及 c. 從洗脫物中回收所述XTEN，其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的個別 XTEN分子具有相同的序列長度。
43. 如權利要求42所述的組合物，其中所述裂解序列能夠用選自由表9的蛋白酶組成 的組的蛋白酶裂解。
44. 如權利要求42或43所述的組合物，其中所述裂解序列能夠用胰蛋白酶裂解，其中 所述序列選自由表8中所闡述的序列組成的組，并且其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
45. 如權利要求42至44中任一項所述的組合物，其中所述色譜底物是陽離子交換底 物、HIC底物或IMAC底物中的一者或多者。
46. -種包含XTEN序列的組合物，其中所述XTEN序列進一步包含一個或多個能夠用胰 蛋白酶裂解的裂解序列，并且其中在有效地使所有所述裂解序列裂解的條件下用胰蛋白酶 處理得到XTEN片段的制劑，其中每個XTEN片段與所述制劑中所有其它的片段具有至少約 95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性。
47. 如權利要求46所述的組合物，其中所述裂解序列與序列SASRSA或SASKSA具有至 少86 %的序列同一性或與序列SASRSA或SASKSA相同。
48. 如權利要求46所述的組合物，其中所述裂解序列包含序列RX或KX，其中X是除了 脯氨酸以外的任何L-氨基酸。
49. 如權利要求46所述的組合物，其中所述組合物與選自表6中所闡述的序列的組的 序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列 同一I"生。
50. -種在宿主細胞中產生XTEN序列的方法，所述方法包括在一定條件下于發酵反應 物中培養包含編碼包含a)所述XTEN序列和b)輔助序列的多肽的載體的宿主細胞，所述條 件有效地以大于約2克/升（g/L)、或約3g/L、或約4g/L、或約5g/L、或約6g/L、或約7g/L 的所述多肽的濃度表達所述多肽作為粗表達產物的組分。
51. -種在宿主細胞中產生XTEN序列的方法，所述方法包括在一定條件下于發酵反應 物中培養包含編碼包含a)所述XTEN序列和b)輔助序列的多肽的載體的宿主細胞，所述條 件有效地以大于約10毫克/克宿主細胞干重（mg/g)、或至少約15mg/g、或至少約20mg/g、 或至少約25mg/g、或至少約30mg/g、或至少約40mg/g、或至少約50mg/g的所述多肽的濃度 表達所述多肽作為粗表達產物的組分。
52. -種在宿主細胞中產生XTEN序列的方法，所述方法包括在一定條件下于發酵反應 物中培養包含編碼包含a)所述XTEN序列和b)輔助序列的多肽的載體的宿主細胞，所述條 件有效地以大于約10毫克/克宿主細胞干重（mg/g)、或至少約250微摩爾/升、或約300 微摩爾/升、或約350微摩爾/升、或約400微摩爾/升、或約450微摩爾/升、或約500微 摩爾/升的所述多肽的濃度表達所述多肽作為粗表達產物的組分。
53. 如權利要求50至52中任一項所述的方法，其中所述濃度是在所述發酵反應物在 600nm的波長下達到至少130的光密度時測量的。
54. 如權利要求50至52中任一項所述的方法，其中所述經表達的多肽的所述輔助序列 是在所述多肽的N端，并且其中所述輔助序列與選自由表10中所闡述的序列組成的組的序 列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%或95%的序列同一性或與選自由表10中所闡述 的序列組成的組的序列相同。
55. 如權利要求54所述的方法，其中所述載體編碼如權利要求14至17中任一項所述 的多肽。
56. 如權利要求55所述的方法，其進一步包括 a. 回收所述宿主細胞發酵反應混合物的所述粗表達產物； b. 在一定條件下使所述粗表達產物的所述多肽吸附到第一色譜底物上，所述條件有效 地將所述多肽的第一親和標簽捕獲到所述色譜底物上，其中所述第一色譜底物選自由HIC 底物、陽離子交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組； c. 洗脫并回收所述XTEN序列，其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的所述多 肽具有相同的序列長度。
57. 如權利要求50至52中任一項所述的方法，其中所述載體編碼如權利要求21至23 中任一項所述的多肽。
58. 如權利要求57所述的方法，其進一步包括： a. 回收所述宿主細胞發酵反應混合物的所述粗表達產物； b. 在一定條件下使所述多肽吸附到第一色譜底物上，所述條件有效地將所述多肽的第 一親和標簽捕獲到所述色譜底物上，其中所述第一色譜底物選自由HIC底物、陽離子交換 底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組； C.洗脫所述多肽； d. 在一定條件下使所述多肽吸附到第二色譜底物上，所述條件有效地將所述多肽的所 述第二親和標簽捕獲到所述色譜底物上，其中所述第二色譜底物選自由HIC底物、陽離子 交換底物、陰離子交換底物和IMAC底物組成的組； e. 洗脫所述多肽；以及 f. 回收所述XTEN序列，其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的所述多肽具有 相同的序列長度。
59. 如權利要求56或58所述的方法，所述方法進一步包括： a. 在有效地使裂解序列裂解的條件下用蛋白酶處理所述多肽，由此從所述多肽中釋放 所述XTEN ; b. 在有效地捕獲所述XTEN的條件下使所述XTEN吸附到陰離子色譜底物上； c. 洗脫所述XTEN;以及 d. 回收所述XTEN，其中至少90 %、或至少91 %、或至少92 %、或至少93 %、或至少 94%、或至少95%的個別XTEN分子具有相同的序列長度。
60. 如權利要求59所述的方法，其中所述陰離子色譜底物選自由macrocap Q、capto Q、superQ_650M 和 poros D 組成的組。
61. 如權利要求59或60所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶，并且其中所述序列 選自由表8中所闡述的序列組成的組。
62. 如權利要求56或權利要求58所述的方法，所述方法進一步包括： a. 在有效地使裂解序列裂解的條件下用蛋白酶處理所述多肽，由此從所述多肽中釋放 所述XTEN ; b. 在有效地捕獲所述蛋白酶而不是所述XTEN的條件下使所述蛋白酶吸附到色譜底物 上；以及 c. 回收洗脫物中的所述XTEN，其中至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的所述 XTEN具有相同的序列長度。
63. 如權利要求62所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶，并且其中所述序列選自 由表8中所闡述的序列組成的組。
64. 如權利要求62或權利要求63所述的方法，其中所述色譜底物是HIC底物、陽離子 交換底物和IMAC底物中的一者或多者。
65. -種固體支撐物，其包含固定在上面的基本上相同的多肽的群體，其中所述固體支 撐物包含色譜底物，并且所述經固定的多肽各自包含XTEN、第一親和標簽和第二親和標簽， 其中： a. 所述第一親和標簽是通過在所述XTEN的N端的裂解序列連接到所述XTEN ; b. 所述第二親和標簽是通過在所述XTEN的C端的裂解序列連接到所述XTEN ; c. 所述第二親和標簽不同于所述第一親和標簽； d. 所述色譜底物能夠結合到所述第一親和標簽或所述第二親和標簽而不同時結合兩 者；以及 e. 至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的所述經固定的多肽分子具有相同的序列 長度。
66. 如權利要求65所述的固體支撐物，其中所述經固定的多肽分子包含如權利要求21 至25中任一項所述的多肽。
67. 如權利要求65或權利要求66所述的固體支撐物，其中所述裂解序列與序列 SASRSA或SASKSA具有至少約86 %的序列同一性或與序列SASRSA或SASKSA相同。
68. 如權利要求65或權利要求66所述的固體支撐物，其中所述裂解序列包含序列RX 或KX，其中X是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸。
69. 如權利要求65至68中任一項所述的固體支撐物，其中所述固體支撐物選自由HIC 色譜樹脂、陽離子交換色譜樹脂、陰離子交換色譜樹脂和IMAC色譜樹脂組成的組。
70. 如權利要求69所述的組合物，其中所述第一親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR，并 且所述第二親和標簽包含序列HHHHHH。
71. 如權利要求69所述的組合物，其中所述第一親和標簽包含序列HHHHHH，并且所述 第二親和標簽包含序列RPRPRPRPRPRPR。
72. -種綴合組合物，其包含共價連接到至少第一交聯劑的一個或多個分子的XTEN， 其中所述交聯劑選自由表13中所闡述的交聯劑、表15中所闡述的炔烴反應物和表15中所 闡述的疊氮化物反應物組成的組，并且所述XTEN選自由如權利要求37所述的XTEN、如權利 要求42所述的XTEN、如權利要求7所述的XTEN、表2中所闡述的序列和表3中所闡述的序 列組成的組。
73. 如權利要求72所述的綴合組合物，其中所述第一交聯劑在選自由以下組成的組的 位置處綴合到至少第一 XTEN : a. 所述XTEN的N端氨基酸殘基的α -氨基； b. 所述XTEN的每個賴氨酸殘基的ε -氨基；以及 c. 所述XTEN的每個半胱氨酸殘基的硫醇基。
74. 如權利要求72或權利要求73所述的綴合組合物，其中所述XTEN與選自表2和表 3中所闡述的序列的組的序列具有至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約 93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少 約99%、或100%的序列同一性。
75. 如權利要求74所述的綴合組合物，其中所述XTEN選自由以下組成的組：AE144、 AE288、AE432、AE576、AE864、Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、 Seg 198和Seg 199,并且所述交聯劑綴合到所述XTEN的所述N端氨基酸的所述a-氨基。
76. 如權利要求74所述的綴合組合物，其中所述XTEN選自由以下組成的組：表3中 所闡述的 Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199,并且所述交聯劑綴合到所述XTEN的每個半胱氨酸殘基的所述硫醇基。
77. 如權利要求72至76中任一項所述的綴合物，其中所述第一交聯劑選自由以下組 成的組：N-馬來酰亞胺、碘乙酰基試劑、吡啶基二硫化物試劑、乙烯基砜試劑、3-炔丙氧基 丙酸、（氧乙基）η-乙炔（其中η是1-10)、二苯甲基環辛炔（DBCO)、環辛炔（COT)、3_疊 氮-丙酸、6-疊氮-己酸和（氧乙基）η-疊氮化物（其中η是1-10)。
78. 如權利要求76所述的綴合組合物，其中所述第一交聯劑綴合到所述XTEN的每個半 胱氨酸殘基的所述硫醇基，并且所述綴合物進一步包含綴合到所述XTEN的所述N端氨基酸 的所述α -氨基的第二交聯劑，其中所述交聯劑選自由表13中所闡述的交聯劑、表15的炔 烴反應物和表15的疊氮化物反應物組成的組。
79. 如權利要求78所述的綴合組合物，其具有式V的構型： 其中就各次出現獨立而言； a. CL1是綴合到所述ΧΤΕΝ的半胱氨酸殘基的所述第一交聯劑； b. CL2是在所述N端綴合到XTEN的所述第二交聯劑； c. X是1至約10的整數； d. y是整數1，其限制條件為x+y>2 ; e. XTEN是包含X個半胱氨酸殘基數的經半胱氨酸工程改造的XTEN。
80. 如權利要求72至77中任一項所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到每個第一交 聯劑的第一有效負載的單原子殘基，其中所述殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組。
81. 如權利要求80所述的綴合組合物，其中所述單原子殘基的所述第一有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組。
82. 如權利要求72至77中任一項所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到每個第一交 聯劑的選自由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組的有效負載。
83. 如權利要求78或權利要求79所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 交聯劑中的每一者的第一有效負載的單原子殘基，其中所述殘基選自由碳、氮、氧和硫組成 的組，以及綴合到所述第二交聯劑的第二有效負載的單原子殘基，其中所述殘基選自由碳、 氮、氧和硫組成的組。
84. 如權利要求83所述的綴合組合物，其中所述單原子殘基的所述第一有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，并且所述單原子殘基的所述第二有效負 載是不同于所述第一有效負載的有效負載并且選自由表6、7、18和21中所闡述的有效負載 組成的組。
85. 如權利要求78或79所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一交聯劑中的 每一者的第一有效負載，其中所述有效負載選自由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組 成的組，以及綴合到所述第二交聯劑的不同于所述第一有效負載的第二有效負載，其中所 述第二有效負載選自由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組。
86. 如權利要求78或權利要求79所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一交 聯劑中的每一者的第一有效負載，其中所述有效負載選自由表21的藥物部分組成的組，以 及綴合到所述第二交聯劑的不同于所述第一有效負載的第二有效負載，其中所述第二有效 負載選自由表21的靶向部分組成的組。
87. 如權利要求85或權利要求86所述的綴合組合物，其中所述第二有效負載是由通 過炔烴反應物與疊氮化物反應物的反應而綴合的所述第二交聯劑連接到所述XTEN的所述 N端,所述反應物選自由表15的反應物組成的組。
88. -種綴合組合物，其包含至少第一 XTEN和第二XTEN，其中所述XTEN是相同的或 是不同的并且各自選自由如權利要求37所述的XTEN、如權利要求42所述的XTEN、如權利 要求7所述的XTEN和表3中所闡述的序列組成的組，并且其中所述第一 XTEN和所述第二 XTEN是使用炔烴反應物與疊氮化物反應物的反應而產生的交聯劑通過所述第一 XTEN和所 述第二XTEN的N端彼此綴合，所述反應物選自由表15的反應物組成的組。
89. 如權利要求88所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN是不同的， 并且各自獨立地與選自表3中所闡述的序列的組的序列具有至少約90%、或至少約91%、 或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約 97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性。
90. 如權利要求89所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN與選自由表3中所闡述的 Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199 組成的 序列的組的序列具有至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少 約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或 100%的序列同一性，并且所述第二XTEN與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、 Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199組成的序列的組的不同序列具 有至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約 95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一 性。
91. 如權利要求88所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN是相同的， 并且各自與選自表3中所闡述的序列的組的序列具有至少約90%、或至少約91 %、或至少 約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或 至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性。
92. 如權利要求91所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN各自與選 自由表 3 中所闡述的 Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和Seg 199組成的序列的組的序列具有至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少 約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或 至少約99%、或100%的序列同一性。
93. 如權利要求88至92中任一項所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述第二 XTEN各自包含一個或多個半胱氨酸殘基，并且進一步包含綴合到所述第一 XTEN的每個半 胱氨酸殘基的第一交聯劑和綴合到所述第二XTEN的每個半胱氨酸殘基的第二交聯劑，其 中所述第一交聯劑和所述第二交聯劑獨立地選自由表13中所闡述的交聯劑組成的組。
94. 如權利要求88至92中任一項所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述第 二XTEN各自包含一個或多個賴氨酸殘基，并且進一步包含綴合到所述綴合物的所述第一 XTEN和/或所述第二XTEN的每個賴氨酸殘基的交聯劑，其中所述交聯劑選自由表13中所 闡述的交聯劑組成的組。
95. 如權利要求93或權利要求94所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 XTEN的每個交聯劑的第一有效負載的單原子殘基，其中所述殘基選自由碳、氮、氧和硫組成 的組，并且進一步包含綴合到所述第二XTEN的每個交聯劑的第二有效負載的單原子殘基， 其中所述殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組。
96. 如權利要求95所述的綴合組合物，其中所述單原子殘基的所述第一有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，并且所述單原子殘基的所述第二有效負 載是不同于所述第一有效負載的有效負載并且選自由表6、7、18和21中所闡述的有效負載 組成的組。
97. 如權利要求93或權利要求94所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 XTEN的每個交聯劑的第一有效負載，其中所述第一有效負載選自由表6、7、18和21中所闡 述的有效負載組成的組，并且進一步包含不同于所述第一有效負載的第二有效負載，其中 所述第二有效負載綴合到所述第二XEN的每個交聯劑，其中所述第二有效負載選自由表6、 7、18和21中所闡述的有效負載組成的組。
98. 如權利要求93或權利要求94所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 XTEN的每個交聯劑的第一有效負載，其中所述第一有效負載選自由表18中所闡述的靶向 部分組成的組，并且進一步包含不同于所述第一有效負載的第二有效負載，其中所述第二 有效負載綴合到所述第二XTEN的每個交聯劑，其中所述第二有效負載選自表18中所闡述 的毒素的組。
99. 如權利要求93或權利要求94所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 XTEN的每個交聯劑的第一有效負載，其中所述第一有效負載選自由表21中所闡述的靶向 部分組成的組，并且進一步包含不同于所述第一有效負載的第二有效負載，其中所述第二 有效負載綴合到所述第二XTEN的每個交聯劑，其中所述第二有效負載選自表21中所闡述 的毒素的組。
100. 如權利要求99所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN是表3的Seg 176,并且所 述第二XTEN選自由表3中所闡述的Seg 176和Seg 177組成的組。
101. -種綴合組合物，其包含至少第一 XTEN、第二XTEN和第三XTEN，其中所述XTEN各 自獨立地選自由如權利要求37所述的XTEN、如權利要求42所述的XTEN、如權利要求7所 述的XTEN和表3中所闡述的序列組成的組，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN和所述第 三XTEN是使用選自由表13或表14中所闡述的三價交聯劑組成的組的三價交聯劑在N端 彼此綴合。
102. 如權利要求100所述的綴合組合物，其中所述三價交聯劑選自由三（2-馬來酰亞 胺基乙基）胺（TMEA)和胺反應性氨基三乙酸三（琥珀酰亞胺酯）（TSAT)組成的組。
103. 如權利要求100至102中任一項所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN、所述第 二XTEN和所述第三XTEN是相同的，并且各自與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、 Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199 組成的組的序列具有至少 約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或 至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性。
104. 如權利要求100至102中任一項所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述 第二XTEN是相同的，并且各自與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、 Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199組成的組的序列具有至少約90%、或至 少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、 或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 %、或100 %的序列同一性，并且所述第三XTEN 不同于所述第一 XTEN和所述第二XTEN，并且與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、 Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199 組成的組的序列具有至少 約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或 至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性。
105. 如權利要求103或權利要求104所述的綴合組合物，其中所述綴合物進一步包含 綴合到所述第一 XTEN的每個半胱氨酸殘基的第一交聯劑、綴合到所述第二XTEN的每個半 胱氨酸殘基的第二交聯劑和綴合到所述第三XTEN的每個半胱氨酸殘基的第三交聯劑，其 中所述交聯劑選自由表13中所闡述的交聯劑組成的組。
106. 如權利要求105所述的綴合組合物，其具有式XII的構型：
其中就各次出現獨立而言； a. 3xCL是所述三價交聯劑； b. CL1是綴合到ΧΤΕΝΙ的所述第一交聯劑； c. CL2是綴合到ΧΤΕΝ2的所述第二交聯劑； d. CL3是綴合到ΧΤΕΝ3的所述第三交聯劑； e. X是1至約10的整數； f. y是1至約10的整數； g. z是1至約10的整數，其限制條件為x+y+z>3 ; h. ΧΤΕΝΙ 是所述第一 XTEN ; i. XTEN2是所述第二XTEN ;以及 j. XTEN3是所述第三XTEN。
107. 如權利要求105或權利要求106所述的綴合組合物，其進一步包含 a. 綴合到所述第一 XTEN的每個第一交聯劑的第一有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組； b. 綴合到所述第二XTEN的每個第二交聯劑的第二有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組；以及 c. 綴合到所述第三XTEN的每個第三交聯劑的第三有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組。
108. 如權利要求105或106所述的綴合組合物，其進一步包含 a. 綴合到所述第一 XTEN的每個第一交聯劑的第一有效負載，所述第一有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組； b. 綴合到所述第二XTEN的每個第二交聯劑的第二有效負載，所述第二有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，其中所述有效負載與所述第一有效負載 是相同的或是不同的；以及 c. 綴合到所述第三XTEN的每個第三交聯劑的第三有效負載，所述第三有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，其中所述第三有效負載與所述第一有效 負載或所述第二有效負載是相同的或是不同的。
109. 如權利要求108所述的綴合組合物，其中所述第一有效負載是對標靶具有特異性 結合親和力的靶向部分，其中所述靶向部分選自由表17-19和21中所闡述的靶向部分組成 的組，并且所述第二有效負載和所述第三有效負載是藥物，其可以是相同的或可以是不同 的，并且其中所述藥物選自由表6、表18和表21中所闡述的藥物組成的組。
110. 如權利要求109所述的綴合組合物，其中所述靶向部分選自由LHRH和葉酸鹽組成 的組，并且其中所述藥物選自由以下組成的組：阿霉素、太平洋紫杉醇、奧利司他汀、單甲基 奧利司他汀E(MMAE)、單甲基奧利司他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、長春花生物堿、喜 樹堿、絲裂霉素C、埃博霉素、hTNF、11-12、硼替佐米、豹蛙酶、假單胞菌外毒素、SN-38和雷 查霉素。
111. 如權利要求108所述的綴合組合物，其中所述靶向部分和所述藥物部分對應于表 21中所闡述的綴合物1-290中的任一者。
112. 如權利要求111所述的綴合組合物，其中所述綴合物具有對應于表21的綴合物 71的所述XTEN、所述靶向部分和所述藥物部分。
113. -種綴合組合物，其包含至少第一 XTEN和第二XTEN和第三XTEN和第四XTEN，其 中所述XTEN選自由如權利要求37所述的XTEN、如權利要求42所述的XTEN、如權利要求7 所述的XTEN和表3中所闡述的序列組成的組，其中所述XTEN可以是相同的或不同的，并且 其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN和所述第三XTEN和所述第四XTEN是使用四價交聯劑 通過N端彼此綴合，其中所述四價交聯劑是四價馬來酰亞胺簇。
114. 如權利要求113所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN、所述第二XTEN、所述第 三XTEN和所述第四XTEN是相同的，并且各自與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、 Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199 組成的組的序列具有至少 約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或 至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性。
115. 如權利要求113所述的綴合組合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN是相同 的，并且各自與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、 Seg 197、Seg 198和Seg 199組成的組的序列具有至少約90%、或至少約91%、或至少約 92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至 少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性，并且所述第三XTEN和所述第四XTEN是 相同的，但不同于所述第一 XTEN和所述第二XTEN，并且各自與選自由表3中所闡述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、 Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198 和 Seg 199 組成的組的 序列具有至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至 少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列 同一I"生。
116. 如權利要求114或115所述的綴合組合物，其中所述綴合物進一步包含綴合到所 述第一 XTEN的每個半胱氨酸殘基的第一交聯劑、綴合到所述第二XTEN的每個半胱氨酸殘 基的第二交聯劑、綴合到所述第三ΧΤΕΝ的每個半胱氨酸殘基的第三交聯劑和綴合到所述 第四XTEN的每個半胱氨酸殘基的第四交聯劑，其中每個交聯劑選自由表13中所闡述的交 聯劑組成的組。
117. 如權利要求116任一項所述的綴合組合物，其具有式XIV的構型：
其中就各次出現獨立而言： a. 4xCL是所述四價交聯劑； b. CL1是綴合到ΧΤΕΝΙ的所述第一交聯劑； c. CL2是綴合到ΧΤΕΝ2的所述第二交聯劑； d. CL3是綴合到ΧΤΕΝ3的所述第三交聯劑； e. CL4是綴合到XTEN4的所述第四交聯劑； f. v是1至約10的整數； g. X是1至約10的整數； h. y是1至約10的整數； i. z是1至約10的整數，其限制條件為x+y+z>4 ; j. ΧΤΕΝΙ 是所述第一 XTEN ; k. XTEN2 是所述第二 XTEN ; l. XTEN3是所述第三XTEN ;以及 m. XTEN4是所述第四XTEN。
118. 如權利要求116或權利要求117所述的綴合組合物，其進一步包含 a. 綴合到所述第一 XTEN的每個第一交聯劑的第一有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組； b. 綴合到所述第二XTEN的每個第二交聯劑的第二有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組； c. 綴合到所述第三XTEN的每個第三交聯劑的第三有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組；以及 d. 綴合到所述第四XTEN的每個第四交聯劑的第四有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組。
119. 如權利要求116或權利要求117所述的綴合組合物，其進一步包含 a. 綴合到所述第一 XTEN的每個第一交聯劑的第一有效負載，所述第一有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組； b. 綴合到所述第二XTEN的每個第二交聯劑的第二有效負載，所述第二有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，其中所述有效負載與所述第一有效負載 是相同的或是不同的； c. 綴合到所述第三XTEN的每個第三交聯劑的第三有效負載，所述第三有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，其中所述有效負載與所述第一有效負載 或所述第二有效負載是相同的或是不同的；以及 d.綴合到所述第四XTEN的每個第四交聯劑的第四有效負載，所述第四有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，其中所述有效負載與所述第一有效負載 或所述第二有效負載或所述第三有效負載是相同的或是不同的。
120. 如權利要求119所述的綴合組合物，其中所述第一有效負載是對標靶具有特異性 結合親和力的靶向部分，其中所述靶向部分選自由表17-19和21中所闡述的靶向部分組成 的組，并且所述第二有效負載、所述第三有效負載和所述第四有效負載中至少有一者是藥 物，其中所述藥物選自由表6、18和21中所闡述的藥物組成的組。
121. 如權利要求120所述的綴合組合物，其中所述靶向部分選自由LHRH和葉酸鹽組成 的組，并且所述藥物選自由以下組成的組：阿霉素、太平洋紫杉醇、奧利司他汀、美登素、海 兔毒素、卡奇霉素、長春花生物堿、喜樹堿、絲裂霉素C、埃博霉素、hTNF、11-12、硼替佐米、豹 蛙酶、假單胞菌外毒素、SN-38和雷查霉素。
122. 如權利要求119所述的綴合組合物，其中所述第一有效負載是對標靶具有特異性 結合親和力的靶向部分，其中所述靶向部分選自由表17-19和21中所闡述的靶向部分組成 的組，并且所述第二有效負載、所述第三有效負載和所述第四有效負載中至少有一者是藥 物，其中所述藥物選自由表6、18和21中所闡述的藥物組成的組，并且其中所述XTEN、所述 靶向部分和所述藥物部分對應于表21中所闡述的綴合物1-290中的任一者。
123. 如權利要求101所述的綴合組合物，其具有式XVI的構型：
其中就各次出現獨立而言； a. 3xCL是所述三價交聯劑； b. CL1是綴合到ΧΤΕΝΙ的所述第一交聯劑； c. CL2是綴合到ΧΤΕΝ2的所述第二交聯劑； d. X是1至約10的整數； e. y是1至約10的整數，其限制條件為x+y>2 ; f. ΧΤΕΝΙ 是所述第一 XTEN ; g. XTEN2是所述第二XTEN ;以及 h. XTEN3是所述第三XTEN，其中所述XTEN選自由表2中所闡述的序列組成的組。
124. 如權利要求123所述的綴合組合物，其進一步包含 a. 綴合到所述第一 XTEN的每個第一交聯劑的第一有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組；以及 b. 綴合到所述第二XTEN的每個第二交聯劑的第二有效負載的單原子殘基，其中所述 殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組。
125. 如權利要求123所述的綴合組合物，其進一步包含： a. 綴合到所述第一 XTEN的每個第一交聯劑的第一有效負載，所述第一有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組；以及 b. 綴合到所述第二ΧΤΕΝ的每個第二交聯劑的第二有效負載，所述第二有效負載選自 由表6、7、18和21中所闡述的有效負載組成的組，其中所述有效負載與所述第一有效負載 是相同的或是不同的。
126. 如權利要求125所述的綴合組合物，其中所述第一有效負載是對標靶具有特異性 結合親和力的靶向部分，其中所述靶向部分選自由表17-19和21中所闡述的靶向部分組成 的組，并且所述第二有效負載是藥物，其可以是相同的或可以是不同的，并且其中所述藥物 選自由表6、表18和表21中所闡述的藥物組成的組。
127. 如權利要求126所述的綴合組合物，其中所述靶向部分選自由LHRH和葉酸鹽組成 的組，并且其中所述藥物選自由以下組成的組：阿霉素、太平洋紫杉醇、奧利司他汀、單甲基 奧利司他汀E(MMAE)、單甲基奧利司他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、長春花生物堿、喜 樹堿、絲裂霉素C、埃博霉素、hTNF、11-12、硼替佐米、豹蛙酶、假單胞菌外毒素、SN-38和雷 查霉素。
128. 如權利要求125所述的綴合組合物，其中所述第一有效負載選自由表11的藥物和 表12的蛋白質組成的組，并且所述第二有效負載不同于所述第一有效負載并且選自由表 11的藥物和表12的蛋白質組成的組。
129. 如權利要求125所述的綴合組合物，其中所述第一有效負載和所述第二有效負載 是相同的并且選自由表11的藥物和表12的蛋白質組成的組。
130. 如權利要求101所述的綴合組合物，其具有式XVII的構型：
其中就各次出現獨立而言； a. 3xCL是所述三價交聯劑； b. CL1是綴合到ΧΤΕΝΙ的所述第一交聯劑； c. X是1至約10的整數； d. ΧΤΕΝΙ是所述第一 ΧΤΕΝ，其中所述ΧΤΕΝ選自由表3中所闡述的序列組成的組； e. ΧΤΕΝ2是所述第二ΧΤΕΝ，其中所述ΧΤΕΝ選自由表2中所闡述的序列組成的組；以及 f. XTEN3是所述第三XTEN，其中所述ΧΤΕΝ選自由表2中所闡述的序列組成的組。
131. 如權利要求130所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 ΧΤΕΝ的每個第 一交聯劑的第一有效負載的單原子殘基，其中所述殘基選自由碳、氮、氧和硫組成的組。
132. 如權利要求130所述的綴合組合物，其進一步包含綴合到所述第一 ΧΤΕΝ的每個第 一交聯劑的第一有效負載，所述第一有效負載選自由表6、7、18和21中所闡述的有效負載 組成的組。
133. -種包含多聚分支ΧΤΕΝ分子的組合物，其中所述組合物的溶液具有小于包含具 有相同數目的氨基酸和相同的摩爾濃度的對應的線性ΧΤΕΝ的溶液的粘度。
134. 如權利要求133所述的組合物，其中所述XTEN分子具有三聚、四聚或五聚構型。
135. 如權利要求133所述的組合物，其中所述ΧΤΕΝ分子選自由表2和表3中所闡述的 序列組成的組。
136. 如權利要求133至135中任一項所述的組合物，其中所述溶液的所述粘度在含有 3 100mg/ml的所述多聚ΧΤΕΝ的溶液中與含有3 100mg/ml的等摩爾濃度的所述對應的線 性XTEN的溶液相比降低至少5、6、7、8、9或10cP。
137. -種多肽，其與選自表52中所闡述的序列的組的序列具有至少約90%、或至少約 91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少 約97%、或至少約98%、或至少約99%、或100%的序列同一性。
138. -種醫藥組合物，其包含如權利要求85至87、97至99、108至112、118至122、125 至127、129或132中任一項所述的綴合物和醫藥學上可接受的載劑。
139. 如權利要求138所述的醫藥組合物，其是用于治療選自表16中所闡述的病狀的組 的病狀。
140. 如權利要求138所述的醫藥組合物，其是用于治療受試者的醫藥方案中，所述方 案包含所述醫藥組合物。
141. 如權利要求140所述的醫藥組合物，其中所述醫藥方案進一步包括確定在受試者 中實現有益作用所需的醫藥組合物的量的步驟，所述受試者患有選自表16中所闡述的病 狀的組的病狀。
142. 如權利要求141所述的醫藥組合物，其中治療所述受試者的所述醫藥方案包括以 有效量將所述醫藥組合物以兩個或更多個連續劑量施用給所述受試者，其中所述施用使得 至少一個、兩個或三個與所述病狀相關的參數與未經治療的受試者相比改進至少10%、或 20%、或 30%、或 40%、或 50%、或 60%、或 70%、或 80%、或 90% 以上。
143. 如權利要求 85 至 87、97 至 99、108 至 112、118 至 122、125 至 127、129 或 132 中任 一項所述的綴合物，其是用于制備用以治療選自表16中所闡述的病狀的組的病狀的藥劑。
144. 一種選擇連接到XTEN的有效負載的組合作為治療劑的方法，所述方法包括 a. 提供包含多個XTEN序列的XTEN的文庫，其中所述XTEN序列中的每一者綴合到至少 第一有效負載和不同于所述第一有效負載的至少第二有效負載； b. 如果XTEN序列與（1)綴合到單獨的所述第一有效負載的XTEN序列；以及（2)綴合 到單獨的所述第二有效負載的XTEN序列相比展現改進的體外或體內參數，那么從所述文 庫中選擇所述XTEN序列作為所述治療劑。
145. 如權利要求144所述的方法，其中第一有效負載和第二有效負載在治療上有效改 善常見疾病。
146. 如權利要求144所述的方法，其中所述第一藥物和第二藥物在治療上有效治療常 見疾病的不同癥狀。
147. 如權利要求145或權利要求146所述的方法，其中所述常見疾病是選自癌癥、癌癥 支持性護理、心血管疾病、中樞神經系統疾病、內分泌疾病、胃腸疾病、泌尿生殖器疾病、血 液疾病、HIV感染、激素疾病、炎癥、自體免疫疾病、傳染病、代謝疾病、肌肉骨胳疾病、腎臟科 病癥、眼科疾病、疼痛和呼吸疾病。
148. 如權利要求144所述的方法，其中所述第一有效負載和所述第二有效負載經由共 同的生物路徑介導其治療作用。
149. 如權利要求144所述的方法，其中所述第一有效負載和所述第二有效負載是選自 由表6、表18和表21中所闡述的藥物組成的組的不同藥物。
150. 如權利要求144所述的方法，其中所述第一有效負載和所述第二有效負載是選自 由表7、表18和表21中所闡述的蛋白質組成的組的不同生物活性蛋白質。
151. 如權利要求144所述的方法，其中所述第一有效負載是選自由表6、表18和表21 中所闡述的藥物組成的組的藥物，并且所述第二有效負載是選自由表7、表18和表21中所 闡述的蛋白質組成的組的生物活性蛋白質。
152. -種經分離的多肽，其包含延伸重組多肽（XTEN)，所述XTEN經由具有選自SASRSA 或SASXSA(其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂解位點連接到親和純化標簽。
153. -種多肽，其包含延伸重組多肽（XTEN)，所述XTEN在其N端經由具有選自SASRSA 或SASXSA (其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂解位點連接到第一親和純化標簽，并且在 其C端經由具有選自SASRSA或SASXSA(其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂解位點連接 到第二親和純化標簽。
154. -種組合物，其具有圖117中所闡述的結構。
【文檔編號】B05B5/06GK104302408SQ201380020791
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年2月27日 優先權日:2012年2月27日
【發明者】V·謝爾恩伯杰, 弗拉迪米爾·波杜斯特, 王家威, 布賴恩特·麥克勞克林, 沈美貞, 丁晟, 辰·顧 申請人:阿穆尼克斯運營公司