用作熒光生物探針的具有聚集誘導發光性質的生物相容納米粒子及其在體外／體內成像 ...的制作方法
【專利摘要】本發明開發了一種熒光生物探針、它的制備方法及其在體內外生物成像中的實際應用，所述熒光生物探針包含具有聚集誘導發光(AIE)特性的有機熒光化合物。
【專利說明】用作熒光生物探針的具有聚集誘導發光性質的生物相容納米粒子及其在體外/體內成像中的應用方法
[0001]相關申請
[0002]本專利申請要求了分別于2011年9月I日和2012年3月14日提交的臨時專利申請N0.61 / 573，097和61 / 685，227的優先權，它們均是由本申請的發明人提交的，并且它們均通過引用的方式并入本文。
【技術領域】
[0003]本發明的主題涉及具有聚集誘導發光(aggregation induced emission)性質的熒光有機化合物的應用。以生物相容性聚合物為基質，可以將這些熒光化合物配制成為高亮度、低細胞毒性、被癌細胞選擇性攝取的大小均勻的納米粒子。因此，負載了熒光化合物的納米粒子可用作體外和體內成像的熒光生物探針。
【背景技術】
[0004]非侵入性活體動物熒光成像技術的出現為癌癥的診斷和治療開拓了新的發展道路。在遠紅外/近紅外熒光( FR / NIR)區域(>650nm)具有強烈發光的熒光成像探針，因其能夠克服光學吸收、光散射和生物介質的自身熒光的干擾，而受到越來越多的關注。
[0005]迄今為止，一系列的材料，包括有機染料、熒光蛋白和無機量子點(QDs),都已經廣泛的應用于FR / NIR熒光成像的研究中。然而，有機染料和熒光蛋白摩爾吸光系數有限，光致漂白閾值較低；而無機量子點在氧化環境中具有高的細胞毒性(A.MDerfus et al.，Nan0.Lett.2004,4,11)。這些缺點極大的限制了有機染料、無機量子點和熒光蛋白在體外和體內成像方面的應用。
[0006]熒光納米粒子，如負載了有機熒光化合物的納米粒子，已經發展成為新一代的生物成像納米探針。它們表現出諸多優勢，如合成多樣性、低細胞毒性、高光穩定性和具有易得的對特定靶向作用的表面功能化。在實際的應用中，高亮度的納米粒子非常有利于高對比度成像。在理想情況下，負載了熒光團的納米粒子的亮度應該與包封的染料分子數量成正比。然而，在高負載率時，η共軛的熒光團易于聚集。聚集的形成通常會導致熒光淬滅，這是一個常見的物理現象，稱為聚集引起熒光淬滅(ACQ)。ACQ效應導致納米粒子很難具有高亮度。人們在放大具有ACQ性質的染料的熒光性方面做了很多的努力(美國專利N0.7，883，900)。然而，即使在放大后，熒光信號也僅略微增強。
[0007]大多數有機熒光團只在其溶液狀態下發光，包括溴化乙啶(美國專利N0.4，729，947、N0.5，346，603、N0.6，143，151 和 N0.6，143，153)、尼羅紅(美國專利N0.6，897，297和N0.6，465，208)、熒光胺(美國專利N0.4，203，967)、鄰苯二甲醛(美國專利 N0.6，969，615 和 N0.6，607，918)和箐染料(美國專利 N0.5，627，027 和 N0.5，410，030)。它們的發光在聚集狀態下(例如，熒光染料高濃度態，成膜狀態，固體粉末狀態等)嚴重淬滅或者完全淬滅。因此，負載的染料濃度在納米粒子里只能達到中等水平，導致可得到的熒光強度非常有限。因此在實際應用中，負載了有機熒光團的納米粒子在體外和體內的生物成像(bioimaging)方面受到了很大的限制。
[0008]因此，非常需要發展用于體外和體內成像，特別是活體動物成像的具有高生物相容性、強的光致漂白抗性和高效的發光亮度的熒光生物探針。
【發明內容】
[0009]本發明涉及了一系列新類型的、具有聚集誘導發光(AIE)特性的有機熒光化合物，其包含一種或多種熒光團以及一種或多種發色團。這些有機熒光基團在稀溶液中不發光，但可以通過聚集時分子內旋轉受限這一機制誘導發光。相反，傳統的發色團在固體狀態下發生聚集引起熒光淬滅。本發明開發了一種結構設計的策略，通過共價鍵將傳統的ACQ發色團與具有聚集誘導發光性質(AIE)的熒光團共價整合轉變為高效的固態發光體。所得加合物繼承了聚集誘導發光性質。由于電子共軛得以延長，與所得加合物的ACQ母體(其表現出聚集引起淬滅)相比，其發光紅移。
[0010]因此，本發明涉及開發和使用具有AIE特性的熒光化合物，這些熒光化合物是通過共價鍵將AIE熒光團與傳統的發色團連接而具有AIE特性。
[0011]本發明進一步涉及了開發具有AIE性質的有機熒光化合物，所述有機熒光化合物可作為熒光生物探針用于體外和體內成像。本發明特別涉及到熒光生物探針的開發和應用，所述熒光生物探針包括負載了熒光化合物的納米粒子，所述負載了熒光化合物的納米粒子包含具有AIE性質的熒光化合物，其中所述熒光化合物包含與一種或多種AIE熒光團連接的一種或多種發色團。負載了熒光化合物的納米粒子具有熒光發射性質。此外，所述熒光化合物包含選自由以下成員構成的組中的骨架結構:
[0012]
【權利要求】
1.一種熒光生物探針，包括負載了熒光化合物的納米粒子，所述納米粒子包含具有聚集誘導發光特性的熒光化合物，其中所述熒光化合物包含與一種或多種聚集誘導發光熒光團連接的一種或多種發色團，其中所述負載了熒光化合物的納米粒子具有熒光發射性質，并且其中，所述熒光化合物包含選自由以下成員構成的組中的一種或多種骨架:
2.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含選自由以下成員構成的組中的骨架結構
3.根據權利要求2所述的熒光生物探針，其中R1HR4HRrlVIVIVHR13> R14> Ri5> Ri6> Ri7> Ris> Ri9> R20和R21各自可以被取代或未取代，并且獨立地選自選自由以下基團構成的組:H、CnH2n+1、0CnH2n+1、C6H5, C10H7' C12H9' OC6H5' OC10H7 和 OC12H9 ;其中 n=0 到 20。
4.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
5.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
6.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
7.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
8.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
9.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
10.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
11.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
12.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
13.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
14.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
15.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
16.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
17.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
18.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
19.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
20.根據權利要求1所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含以下骨架結構:
21.根據權利要求1-20中任一項所述的熒光生物探針，其中RpRyRyRpRpRpRpIVR9> R10> Rn>Ri2> Ri3> Rh、Ris> Rie> R17、Ri8> Ri9> R20 和 R21 中的任一者還包括末端官能團，該末端官能團獨立地選自由以下成員構成的組:N3、NH2, COOH, NCS、SH、炔基、N-羥基丁二酰亞胺酯、馬來酰亞胺、酰肼、硝酮、-CH0、-0H、鹵素以及帶電荷的離子基團，其中獨立地選自由生物識別肽和細胞穿透肽構成的組中的肽連接到所述末端官能團。
22.根據權利要求1-21中任一項所述的熒光生物探針，其中所述負載了熒光化合物的納米粒子還包含生物相容性聚合物基質。
23.根據權利要求22所述的熒光生物探針，其中所述生物相容性聚合物基質選自由動物血清白蛋白、1，2- 二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇、聚芴撐、以及它們的混合物構成的組中。
24.根據權利要求23所述的熒光生物探針，其中所述生物相容性聚合物基質選自由BSA、DSPE-PEG 和 DSPE-PEG-葉酸構成的組。
25.根據權利要求1-24中任一項所述的熒光生物探針，其中通過使用(a)作為熒光共振能量轉移供體的共軛聚合物，或(b)作為生物識別性試劑的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽來修飾所述納米粒子的表面進一步增強所述負載了熒光化合物的納米粒子的熒光發射性。
26.根據權利要求1-25中任一項所述的熒光生物探針，其中所述負載了熒光化合物的納米粒子的大小為Inm至100，OOOnm。
27.根據權利要求22-26中任一項所述的熒光生物探針，其中所述負載了熒光化合物的納米粒子選自由以下成員構成的組:BSA包封的納米粒子、F37NP50、FTNPs以及RGD-修飾的共負載了 PFV/TPE-TPA-DCM的BSA納米粒子。
28.一種熒光生物探針，其包含一種或多種具有聚集誘導發光特性的熒光化合物，其中所述熒光化合物包含與一種或多種肽連接的一種或多種聚集誘導發光熒光團，其中所述熒光化合物具有熒光發射性質，并且其中所述熒光化合物包含選自由以下成員構成的組中的骨架結構:
29.根據權利要求28所述的熒光生物探針，其中所述熒光化合物包含選自由以下成員構成的組中的化學結構:
30.根據權利要求28或30中任一項所述的熒光生物探針，其中所述肽獨立地選自由生物識別肽和細胞穿透肽構成的組。
31.根據權利要求30所述的熒光生物探針，其中所述肽是選自由環狀-RGD肽和DEVD肽底物構成的組中的生物識別肽。
32.根據權利要求30所述的熒光生物探針，其中所述細胞穿透肽是轉錄肽的反式激活子。
33.一種制備權利要求22-27中任一項所述的熒光生物探針的方法，包括通過以下步驟用生物相容性聚合物基質負載所述熒光化合物: a.制備包含有機溶劑和所述熒光化合物的溶液； b.制備生物相容性聚合物的水溶液； c.將所述包含所述有機溶劑和所述熒光化合物的溶液與所述水溶液混合在一起并進行超聲；以及 d.除去所述有機溶劑以形成負載了熒光化合物的納米粒子。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述負載了熒光化合物的納米粒子是利用能夠特異性靶向癌細胞或能夠放大熒光成像的任何分子制備的。
35.一種制備權利要求28-32中任一項所述的熒光生物探針的方法，包括: (a)通過固相合成法制備包含末端炔基的肽； (b)制備疊氮化熒光化合物的DMSO溶液； (c)將所述疊氮化熒光化合物與所述肽連同CuSO4和抗壞血酸鈉混合一起；(d)通過點擊化學將所述熒光化合物與所述肽交聯；以及 (e)通過高效液相色譜進行純化從而形成所述熒光生物探針。
36.一種細胞成像的方法，包括使靶細胞與權利要求1-32中任一項所述的熒光生物探針接觸；以及檢測細胞成像。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述細胞成像是利用共聚焦激光掃描顯微鏡或雙光子熒光光譜法進行的體外細胞成像；或者是利用Maestro體內熒光成像系統進行的體內細胞成像。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述雙光子熒光光譜法用于實時細胞示蹤和組織成像。
39.根據權利要求36-38中任一項所述的方法，其中所述靶細胞是癌細胞或能夠傾向地聚集在腫瘤上的細胞。
40.根據權利要求39的方法，其中所述生物探針特異性地靶向癌細胞中的整合素α V β 3°
41.根據權利要求36-40中任一項所述的方法，還包括確定是否存在腫瘤或癌細胞。
42.根據權利要求39-41`中任一項所述的方法，其中體外細胞成像是利用選自由以下成員構成的組中的生物成像樣品進行的，所述成員是:MCF-7細胞、HT-29癌細胞或HeLa癌細胞；或者其中體內成像是利用荷瘤ICR小鼠作為生物成像樣品進行的。
43.一種檢測半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性的方法，包括使包含細胞的溶液與權利要求28-32中的任一項所述的熒光生物探針接觸，以及檢測熒光。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述熒光生物探針被半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特異性切割。
45.根據權利要求43所述的方法，還包括:實時地熒光開啟監測所述熒光生物探針與所述細胞之間的相互作用；以及細胞凋亡。
46.根據權利要求45所述的方法，還包括:體外篩選能夠誘導細胞凋亡的藥物。
【文檔編號】C09K11/06GK103842472SQ201280042771
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月3日 優先權日:2011年9月1日
【發明者】唐本忠, 秦瑋, 劉建釗, 陳斯杰, 郭子健, 劉斌, 李凱, 丁丹, 史海斌, 耿軍龍, 孫景志, 秦安軍, 趙秋麗 申請人:香港科技大學, 新加坡國立大學