專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種產(chǎn)油微生物微藻的高值化利用分離方法。
背景技術(shù)：
隨著石化資源日 益枯竭、人類(lèi)環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)，清潔可再生的生物柴油的發(fā)展顯得尤為緊迫。能源微藻以種類(lèi)繁多、分布廣、繁殖快、成本低的特點(diǎn)成為重要來(lái)源之一。另夕卜，其脂肪酸組成與植物來(lái)源的食用油脂相似，可以代替動(dòng)、植物油脂作為食用油脂，甚至是作為保健類(lèi)功能性油脂。微藻除含有大量的脂質(zhì)之外，還含有豐富的多糖、色素、蛋白質(zhì)和必需氨基酸等活性成分。具有增強(qiáng)免疫力，抗癌，防輻射損傷，抗衰老，降血糖等功效。葉綠素是較早開(kāi)發(fā)的一種綠色色素，無(wú)毒，可食用，是一種很好的天然食用色素，但由于葉綠素穩(wěn)定性極差，且不溶于水，給應(yīng)用帶來(lái)一定的困難。為方便使用，常將其制成葉綠素銅鈉應(yīng)用。葉綠素銅鈉鹽不但溶于水而且穩(wěn)定性比葉綠素強(qiáng)很多，是我國(guó)食品工業(yè)唯一允許使用的綠色色素，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)使用的天然綠色素。從產(chǎn)油微生物能源微藻進(jìn)行分離可以得到多糖、色素、油脂以及蛋白產(chǎn)品四種成分?，F(xiàn)階段對(duì)四種成分的提取，常規(guī)方法是酸法、堿法、酶法、熱水法、超聲波、微波提取法對(duì)某一種成分進(jìn)行提取，但仍沒(méi)有一種方法同時(shí)對(duì)四種成分進(jìn)行有效提取。且超聲、微波法處理量小，工業(yè)上較難擴(kuò)大再生產(chǎn)；若直接采用酸法、堿法用量大、且濃度高，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，對(duì)色素、多糖結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、損失較大，蛋白含量較高，增加了多糖純化的難度，且堿處理使水相清液中呈墨綠色，得到的粗多糖顏色也為綠色，油脂提取過(guò)程中，色素雜質(zhì)也較多，后期分離成本加大；酶法破碎條件溫和、能耗低、處理量大，多糖得率高，油脂浸出率高，但是酶的造價(jià)較高，而在使用時(shí)又需要大量的酶才可達(dá)到較好的破碎效果，且酶的大量使用對(duì)色素降解作用較明顯，所以可以先對(duì)酶進(jìn)行預(yù)處理，減少酶的用量和作用時(shí)間；熱水處理，可增大細(xì)胞通透性，有利于胞內(nèi)物質(zhì)的浸出，可控時(shí)間內(nèi)熱水處理對(duì)色素影響較小，但脫單獨(dú)熱水處理，多糖和油脂的提取效率低，可作為一種預(yù)處理手段與酶法結(jié)合。常規(guī)對(duì)色素提取采用有機(jī)溶劑浸提，此時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物必須為干菌體，濕菌體有機(jī)溶劑提取效果甚微。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有產(chǎn)油微生物能源微藻分離方法無(wú)法對(duì)其含有的多糖、油脂、色素以及蛋白得到充分利用，并且分離效果不佳，成本高。為了解決上述存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了以下方案
一種產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，包括以下步驟
步驟I :將收集的微藻濕菌體依次經(jīng)過(guò)熱水和離心處理，得到上清液A和沉淀A ;其中，熱水與濕菌體的質(zhì)量比為20— 30 1 ；步驟2 :沉淀A依次經(jīng)過(guò)加酶和離心處理，得到上清液B和沉淀B ;其中，沉淀A和酶的質(zhì)量比為40-100 1 ；
步驟3 :將上清液A和上清液B混合后進(jìn)行濃縮，并加4°C冷乙醇混合12小時(shí)以上，將混合液進(jìn)行過(guò)濾得到粗多糖沉淀；其中，上清液A和上清液B的總體積濃縮到原體積的1/5—1/4，加冷乙醇的體積是濃縮后上清液A和上清液B總體積的3-5倍；
步驟4 :步驟3中所得粗多糖沉淀加水溶解，脫蛋白處理，分離成蛋白沉淀和脫蛋白的多糖溶液，蛋白沉淀通過(guò)冷凍干燥或烘干得到粗蛋白產(chǎn)品。進(jìn)一步，步驟4中所得脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色得到精制多糖。進(jìn)一步，將步驟2中所得沉淀B的菌懸液調(diào)節(jié)pH值為10-12后，70_80°C保溫l_2h，然后加入O. 8%的氯化鈉溶液以及正己烷與乙醇的混合液，使最終正己烷乙醇水的體積比為2 :4 :1. 5，震蕩lOmin，靜置分成三層正己烷相A、中間菌體相以及醇水相A，最上層正己烷相A得到黃色素。添加乙醇是為了使黃色素更好的進(jìn)入正己烷相中。
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進(jìn)一步，中間菌體相經(jīng)過(guò)干燥處理后當(dāng)作動(dòng)物膳食的高蛋白成分飼料。進(jìn)一步，醇水相A加酸調(diào)節(jié)溶液pH至酸性后，加入體積比為2 1的正己烷與乙醇混合溶液以及O. 8%的氯化鈉溶液，醇水相A、正己烷乙醇混合液以及氯化鈉溶液體積比為4 6 :1，震蕩lOmin，靜置再次分層為正己烷相B和醇水相B，正己烷相B制得油脂，醇水相B制得葉綠素銅鈉鹽。進(jìn)一步，所述酶選自中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及纖維素酶中的一種或多種組合；所述纖維素酶酶活為1200-1500U/g，所述中性蛋白酶酶活為59000-60000U/g，所述堿性蛋白酶酶活為 2X 105-2. 02X 105U/g。進(jìn)一步，步驟I中的熱水處理溫度和時(shí)間分別為90_100°C和O. 5_2h。進(jìn)一步，所述產(chǎn)油微生物能源微藻為小球藻、螺旋藻或柵藻。藻類(lèi)微生物的細(xì)胞壁成分主要是纖維素極其結(jié)合蛋白。以適當(dāng)?shù)谋壤M成具有水解多糖、蛋白等物質(zhì)能力的復(fù)合酶，使細(xì)胞壁通透性大幅增加，產(chǎn)品能夠順利溶出。所述纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1:0. 2-5 ;所述酶與產(chǎn)油微生物菌體的質(zhì)量比為1:40-100。本發(fā)明使用的微藻濕菌體由藻類(lèi)微生物菌體發(fā)酵液通過(guò)離心處理獲得，藻類(lèi)微生物菌體發(fā)酵液的制備方法為取種子液對(duì)數(shù)期進(jìn)行接種，接種量為20%，初始pH值為7. 5，溫度27°C，光照40001x，通無(wú)菌空氣培養(yǎng)8天則達(dá)到穩(wěn)定期。本發(fā)明在提取油脂時(shí)優(yōu)選采用六號(hào)溶劑萃取，六號(hào)溶劑是各種低級(jí)烷烴的混合物，具有工業(yè)己烷類(lèi)似的性質(zhì)且不與水互溶，形成的雙水相可以分離脂溶性的油脂和水溶性的葉綠素酸。浸提后離心得到油相層，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫溶得到油脂。該產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法與現(xiàn)有方法相比，具有以下有益效果
(I)本發(fā)明產(chǎn)油微生物能源微藻的利用分離方法，在確保能夠不影響油脂提取，以及得到較高的產(chǎn)物得率的情況下，對(duì)提取順序進(jìn)行了優(yōu)化，可以依次得到蛋白、多糖、色素以及油脂產(chǎn)品四種成分。(2)本發(fā)明設(shè)計(jì)用熱水處理作為預(yù)處理手段，增大細(xì)胞通透性，適當(dāng)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，減少酶法酶法作用時(shí)間和酶的使用量，通過(guò)熱水抽提和酶解作用，得到產(chǎn)品多糖和少量的粗蛋白。
(3)本發(fā)明通過(guò)油脂和葉綠素在堿性條件下可以變成水溶性的物質(zhì)，得到胡蘿卜
素等黃色素廣品。(4)本發(fā)明油脂在酸性條件下仍能變成脂溶性的游離脂肪酸，葉綠素仍是水溶性的葉綠素酸，從而分離成油脂和葉綠素，得到的油脂產(chǎn)品色素雜質(zhì)極少，油脂品質(zhì)較好。 ( 5 )本發(fā)明中葉綠素可以直接轉(zhuǎn)化成葉綠素銅鈉鹽，且葉綠素轉(zhuǎn)化充分。
具體實(shí)施例方式結(jié)合下列實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明
實(shí)施例I :選用小球藻
將小球藻發(fā)酵液以4000rpm/min離心IOmin,去除上清液獲得小球藻濕菌體,稱(chēng)取小球 藻濕菌體I. Og于IOOml三角燒瓶中，加入25ml去離子水，90°C加熱I. 5h，冷卻，離心得上清液A和沉淀A。稱(chēng)取O. 065g纖維素酶，O. 035g中性蛋白酶，纖維素酶酶活為1200U/g，中性蛋白酶酶活為60000U/g，加入pH=5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，pH=5是實(shí)驗(yàn)中選定的最優(yōu)酶作用的PH反應(yīng)體系。定容至IOOml，取25ml酶溶液加入到小球藻濕菌體沉淀A中，水解溫度為42°C，攪拌4h，90°C滅酶lOmin。將水解后的懸濁液進(jìn)行4000r/min下離心lOmin，得到上清液B和沉淀B，合并兩次上清液A和上清液B，濃縮該上清混合液至原體積的1/5，加入3倍體積的冷乙醇4°C震蕩混合均勻，靜置12h，過(guò)濾得粗多糖沉淀。取IOml水溶解粗多糖沉淀，用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH到3，混勻，靜置2h，加入15倍三氯乙酸體積的正丁醇，攪拌，靜置lh，離心，水溶液回收多糖，重復(fù)2次。多糖提取率82. 3%。用水溶解多糖，以2BV/h的流速對(duì)2. 5mg/ml的粗多糖溶液進(jìn)行吸附脫色，測(cè)得色素脫除率92. 4%，多糖保留率為88. 97%。pH=3時(shí)蛋白質(zhì)溶解度較低且多糖損失較小，是實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)反應(yīng)體系。正丁醇的使用也是為了降低蛋白質(zhì)的水溶性，從而和多糖分離。此處單獨(dú)使用TCA方法也可以，增加重復(fù)提取的次數(shù)。沉淀B的菌懸液用2mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為11，70°C反應(yīng)60min，冷卻，加入適量O. 8%的氯化鈉溶液和正己烷與乙醇的混合液正己烷與乙醇的體積比為2 :4，使最終正己烷乙醇水的體積比為2 :4 :1. 5，震蕩lOmin，收集正己烷相，再加入初始1/3體積的正己烷重復(fù)兩次，正己烷相A加無(wú)水硫酸鈉去除微量水，回收溶劑并得到胡蘿卜素等黃色素。中間層懸浮的菌體經(jīng)干燥后粗蛋白含量為38. 7%，十八水解氨基酸含量充分，完全可以作為富含蛋白、氨基酸的成分當(dāng)作蛋白飼料成為動(dòng)物膳食飼料的部分替代品。醇水相A中加lmol/L的硫酸調(diào)節(jié)pH到3，85°C反應(yīng)90min，冷卻，加入體積比為2 1的正己烷乙醇溶液和O. 8%的氯化鈉溶液，醇水相A、正己烷乙醇混合液以及氯化鈉溶液體積比4 6 :1，震蕩IOmin,靜置再次分層為正己烷相B和醇水相B，重復(fù)兩次，正己烷相B加無(wú)水硫酸鈉去除微量水，回收溶劑并得到油脂產(chǎn)品，油脂提取率為79. 4%。醇水相B濃縮到原體積的1/3，加入10%的硫酸銅溶液，醇水相B :硫酸銅體積比為2 :3，攪拌均勻，60°C攪拌90min。趁熱過(guò)濾，濾液加入2倍純水,析出葉綠素銅,靜置90min過(guò)濾。析出的葉綠素銅的濾餅用乙醇溶解，緩慢加入5%氫氧化鈉-乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH為11，攪拌成鹽，過(guò)濾，濾液于60°C加熱蒸發(fā)得到墨綠色結(jié)晶物，60°C烘箱烘干得到葉綠素銅鈉鹽成品，葉綠素銅鈉鹽得率75. 6%。實(shí)施例2 :選用柵藻
將柵藻發(fā)酵液以4000rpm/min離心lOmin，去除上清獲得柵藻菌體，稱(chēng)取柵藻濕菌體I. Og于IOOml三角燒瓶中，加入25ml去離子水，90°C加熱I. 5h，冷卻，離心得上清液A和沉淀A。稱(chēng)取O. 075g纖維素酶，O. 025g堿性蛋白酶，纖維素酶酶活為1200U/g，堿性蛋白酶酶活為2X 105U/g，加入pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液定容至100ml，取25ml酶溶液加入到柵藻濕菌體沉淀A中，水解溫度為40°C，攪拌4h，90°C滅酶lOmin，將水解后的懸濁液進(jìn)行4000r/min下離心IOmin,得到上清液B和沉淀B。之后步驟同實(shí)施例I。最終產(chǎn)物，多糖提取率78. 14%。測(cè)得色素脫除率90. 92%，多糖保留率為89. 23%。粗蛋白含量為36. 7%，油脂提取率為78. 88%，葉綠素銅鈉鹽得率77. 26%。實(shí)施例3 :選用螺旋藻
將螺旋藻發(fā)酵液以4000rpm/min離心lOmin，去除上清獲得螺旋菌體，稱(chēng)取螺旋濕菌體O. 8g于IOOml三角燒瓶中，加入25ml去離子水，90°C加熱I. 5h，冷卻，離心得上清液A和沉淀A。稱(chēng)取O. 067g中性蛋白酶，堿性蛋白酶酶活為60000U/g，加入pH=7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液定容至100ml，取20ml酶溶液加入到柵藻濕菌體中，水解溫度為42°C，攪拌6h，90°C滅酶lOmin。將水解后的懸濁液進(jìn)行4000r/min下離心lOmin，得到上清液B和沉淀B。 之后步驟同實(shí)施例I。最終產(chǎn)物，多糖提取率75. 74%。測(cè)得色素脫除率91. 22%，多糖保留率為89. 75%。粗蛋白含量為38. 97%，油脂提取率為78. 28%，葉綠素銅鈉鹽得率72. 86%。上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性的描述，顯然本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場(chǎng)合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，包括以下步驟 步驟I :將收集的微藻濕菌體依次經(jīng)過(guò)熱水和離心處理，得到上清液A和沉淀A ;其中，熱水與濕菌體的質(zhì)量比為20— 30 1 ； 步驟2 :沉淀A依次經(jīng)過(guò)加酶和離心處理，得到上清液B和沉淀B ;其中，沉淀A和酶的質(zhì)量比為40-100 1 ； 步驟3 將上清液A和上清液B混合后進(jìn)行濃縮，并加4 V冷乙醇混合12小時(shí)以上，將混合液進(jìn)行過(guò)濾得到粗多糖沉淀；其中，上清液A和上清液B的總體積濃縮到原體積的1/5—1/4，加冷乙醇的體積是濃縮后上清液A和上清液B總體積的3-5倍； 步驟4 :步驟3中所得粗多糖沉淀加水溶解，脫蛋白處理，分離成蛋白沉淀和脫蛋白的多糖溶液，蛋白沉淀通過(guò)冷凍干燥或烘干得到粗蛋白產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于步驟4中所得脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色得到精制多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于將步驟2中所得沉淀B的菌懸液調(diào)節(jié)pH值為10-12后，70-80°C保溫l_2h，然后加入O. 8%的氯化鈉溶液以及正己烷與乙醇的混合液，使最終正己烷乙醇水的體積比為2 4 :1. 5，震蕩lOmin，靜置分成三層正己烷相A、中間菌體相以及醇水相A，最上層正己烷相A得到黃色素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于中間菌體相經(jīng)過(guò)干燥處理后當(dāng)作動(dòng)物膳食的高蛋白成分飼料。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于醇水相A加酸調(diào)節(jié)溶液pH至酸性后，加入體積比為2 :1的正己烷與乙醇混合溶液以及O. 8%的氯化鈉溶液，醇水相A、正己烷乙醇混合液以及氯化鈉溶液體積比為4 :6 :1，震蕩lOmin，靜置再次分層為正己烷相B和醇水相B，正己烷相B制得油脂，醇水相B制得葉綠素銅鈉鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5至任何一項(xiàng)所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于所述酶選自中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及纖維素酶中的一種或多種組合；所述纖維素酶酶活為1200-1500U/g，所述中性蛋白酶酶活為59000-60000U/g，所述堿性蛋白酶酶活為 2X 105-2. 02X 105U/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5至任何一項(xiàng)所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于步驟I中的熱水處理溫度和時(shí)間分別為90-100°C和O. 5-2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至5至任何一項(xiàng)所述產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，其特征在于所述產(chǎn)油微生物能源微藻為小球藻、螺旋藻或柵藻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)油微生物能源微藻的高值化利用分離方法，包括以下步驟步驟1將收集的微藻濕菌體依次經(jīng)過(guò)熱水和離心處理，得到上清液A和沉淀A；步驟2沉淀A依次經(jīng)過(guò)加酶和離心處理，得到上清液B和沉淀B；步驟3將上清液A和上清液B混合后進(jìn)行濃縮，并加4℃冷乙醇靜置12小時(shí)以上，將混合液進(jìn)行過(guò)濾得到粗多糖沉淀；步驟4步驟3中所得粗多糖沉淀加水溶解，脫蛋白處理，分離成蛋白沉淀和脫蛋白的多糖溶液，蛋白沉淀通過(guò)冷凍干燥或烘干得到粗蛋白產(chǎn)品，脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色得到精制多糖，沉淀B再經(jīng)過(guò)多次處理后可以得到黃色素、葉綠素鹽、高蛋白成分飼料以及油脂。
文檔編號(hào)C09B61/00GK102875658SQ20121038897
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者張栩, 段美蓉, 譚天偉 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)