專利名稱：用于測量鈣離子的方法
技術領域：
本發明涉及用于測定鈣的試劑和使用所述試劑的測定方法。更具體地，本發明涉及用于測定鈣的試劑，其包含單硝基取代的BAPTA型螯合劑(BAPTA=I, 2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸)的。本發明描述了以下測定方法，這種方法允許精確測定樣品如血液樣品(例如全血、血漿或血清)或任何其它含水液體樣品(例如腦脊髓液、淋巴液、唾液或尿)中的鈣，并因此對于臨床診斷是特別有用的。
背景技術：
血液或血清鈣水平分別具有重要的診斷價值并可具有重要治療意義。鈣離子的參考范圍非常窄(2. 20-2. 55mmol/L)，在這些水平之上或之下的輕微偏 離對數種生理障礙是具有診斷性的。與高鈣血癥(血清鈣升高)相關的兩種最常見的疾病是甲狀旁腺功能亢進和惡性腫瘤，尤其是當惡性腫瘤已經轉移至骨骼并導致骨吸收(即骨的局部破壞，伴有從轉移病灶的位置釋放鈣)時。血清鈣水平降低(低鈣血癥)一般與甲狀旁腺功能減退相關。約1%的新生兒患有顯著的低鈣血癥(血清鈣〈I. 75mmol/L)，具有諸如易激惹(irritability)、顫搐和驚厥的癥狀，這種情況需要立即進行醫療干預。如同鈣一樣，鎂是在體內發現的一種重要元素。鎂水平的缺損也導致臨床癥狀，其中的一些與針對鈣水平缺損所發現的臨床癥狀非常相似。鑒于低血清鈣和低血清鎂具有幾乎相同的臨床癥狀，因此必須指出哪種元素導致所述臨床癥狀。通常，有必要對血清鈣和鎂都進行測量以測定哪種元素或視情況而定是否兩種元素都在正常范圍之外，并且重要的是，鎂不干擾鈣的量化。用于測量鈣和鎂的參考方法分別是原子吸收。對于常規測量，原子吸收有些不方便，需要昂貴的儀器和相當熟練的操作員來實施測定，以實現足夠的精度和重現性。某些酶的催化活性強烈依賴鈣離子的存在，由此使得可以通過測量鈣依賴性酶活性來量化鈣。基于酶法測量鈣離子的方法已經例如描述在US6，068，971中。臨床實驗室日常工作中經常用于測量鈣的現有方法是基于利用螯合的生色劑如鄰甲酚酞絡合酮(O-CPC)、偶氮胂III、偶氮膦或偶氮氯膦的方法。盡管這些方法的至少一種經常用在實驗室的臨床日常工作中，但是每種方法都有缺點。ο-CPC方法的敏感性非常依賴于pH。為得到最大敏感性，使反應在約10. 7的pH進行。然而，在這些堿性PH值時，試劑容易吸收環境二氧化碳。吸收的二氧化碳與水組合形成的碳酸逐漸降低試劑PH并最終使試劑喪失鈣測量功能。pH的逐漸改變也需要更頻繁地進行校準，以確保準確的測量。此外，o-CPC是非常不具有選擇性的，結合鎂和其它金屬如釓。為了消除在血清中常規水平的鎂的干擾，添加8-羥基喹啉以螯合鎂。基于偶氮胂III的鈣檢測方法不具有在o-CPC法中固有的高pH和鎂干擾(取決于測量pH)的問題。偶氮胂III在弱酸性條件下(例如pH 5-6)結合鈣，如果鈣測量在小于7的pH進行，那么鎂的結合可忽略。盡管偶氮胂III消除了 o-CPC法的許多缺點，但是它的問題是相當低的敏感性和環境憂慮。每摩爾的偶氮胂III含有2摩爾的砷，由于擔心供水被砷污染，因此偶氮胂III試劑的處置在許多國家是重要問題。JP-A-04-120464披露，通過使用偶氮氯膦-III作為螯合劑和生色劑可將鈣和鎂同時量化。在偶氮氯膦-III的情況中，最適于其顏色改變的PH范圍是弱酸性pH以及偶氮氯膦-III是不含砷的試劑。因此，偶氮氯膦-III就由相對于高PH和毒性導致的問題方面是有利的。然而，使用偶氮氯膦-III同時量化鎂和鈣引起問題。通常將這種螯合劑添加至樣品以結合鎂和鈣，由此導致變色。然后添加EGTA以單獨釋放結合的鈣，這種釋放導致顏色變化。然后基于顏色變化來量化鈣。偶氮氯膦-III也傾向于產生高空白值，該事實限制了可在其中進行鈣離子測定的濃度范圍。已經描述了 BAPTA型螯合鈣的試劑并且其被用作緩沖體系用于例如控制細胞內隹丐離子的濃度。Pethig, R. et al. , (Cell Calcium 10 (1989) 491-498)已經測定了數種不同BAPTA型鈣緩沖劑的締合常數。他們建議在有關鈣的生理工作中使用二溴-BAPTA。
如上所述，用于測量鈣離子的各種測定方法是臨床日常工作中已知的。可得到用于鈣測定的基于使用螯合劑和生色劑的數種試劑，每種試劑都留有進一步改進的余地。因此，仍需要定量地測量分析樣品中的鈣的試劑和方法。理想的方法應基于如下的螯合劑，其a)在貯存條件下和在分析儀的工作臺上穩定，b)不含有毒性元素如砷，c)具有相對低的試劑空白吸收，d)不與鎂離子或其它金屬離子如釓結合，e)允許快速測定和高樣品通量，和f)在寬測量范圍內對鈣離子進行精確測量。意料不到地發現，BAPTA型螯合劑的單硝基衍生物表現出相當有利的性質，從而使它們非常適于測量鈣離子。
發明內容
本發明提供在測量鈣離子中非常有用的試劑，并且其有益方面包括極好的貯存穩定性，不存在砷的環境污染問題，不顯示鎂或釓的干擾和允許在寬濃度范圍內快速和精確地測定鈣，等等。本發明涉及用于測定樣品中的鈣離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟使樣品與包含單-硝基-BAPTA型螯合劑的溶液混合，由此使鈣離子與單-硝基-BAPTA型螯合劑結合，從單-硝基-BAPTA型螯合劑釋放鈣離子，其中所述釋放導致單-硝基-BAPTA型螯合劑的吸光度變化，測量吸光度變化并使用測量的吸光度變化來測定鈣離子濃度。本發明還披露了用于測定鈣的穩定試劑組合物，其含有單-硝基-BAPTA型螯合劑以及 pH 為 pH 8. 5-pH 11.5。本發明還涉及包含用于測量鈣的試劑組合物的試劑盒，所述試劑組合物的pH為pH 8. 5-pH 11. 5并含有單-硝基-BAPTA型螯合劑。
具體實施例方式發明詳述在一個優選實施方案中，本發明涉及測定樣品中的鈣離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟使樣品與包含單-硝基-BAPTA型螯合劑的溶液混合，由此使鈣離子與單-硝基-BAPTA型螯合劑結合，從單-硝基-BAPTA型螯合劑釋放鈣離子，其中所述釋放導致單-硝基-BAPTA型螯合劑的吸光度變化，測量吸光度變化并使用測量的吸光度變化來測定鈣離子濃度。本發明披露了測定樣品中的鈣離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟a)使樣品與包含式I化合物的溶液混合，由此使鈣離子與所述化合物結合，式I 為
權利要求
1.測定樣品中的鈣離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟 a)將所述樣品與包含式I化合物的溶液混合，由此使鈣離子與所述化合物結合，- 式I為
2.權利要求I的方法，其中所述包含式I化合物的溶液的pH范圍為pH8.5至pH 11.5。
3.權利要求I或2的方法，其中所述包含式I化合物的溶液的pH范圍為pH9. O至pH10. 5。
4.權利要求I至3中任ー項的方法，其中式I的Rl為氫或鹵素。
5.權利要求I至3中的任ー項的方法，其中式I的R2為氫、鹵素或烷基。
6.權利要求I至3中的任ー項的方法，其中式I的R3為氫、鹵素、羧基或烷氧基。
7.權利要求I至3中的任ー項的方法，其中在所述權利要求I的步驟(b)中的鈣離子釋放由在20° C鈣離子結合常數log k等于或大于7. O的鈣螯合劑觸發。
8.權利要求7的方法，其中在所述權利要求I的步驟(b)中的鈣離子釋放由EDTA、DTPA, EGTA, DTPMP 和/或 EDPMP 觸發。
9.用于測量鈣的pH范圍為pH8. 5至pH 11. 5的試劑，其含有如權利要求I中所定義的式I化合物。
10.權利要求9的試劑，其包含濃度為O.IOmM至50mM的式I化合物。
11.權利要求9的試劑，其包含緩沖體系，其中所述緩沖體系選自AMPD(=2-氨基-2-甲基-1，3-丙ニ醇)、CHES (=2-(N-環己基氨基)-こ磺酸)、AMPS0(=3-[ニ甲基(羥基甲基)-甲基氨基]-2-羥基丙烷-磺酸)、CAPSO (=3-環己基氨基)-2-羥基-I-丙磺酸)、CAPS (=3-環己基氨基)-2-丙磺酸)、甘氨酸緩沖體系或碳酸鹽緩沖體系。
12.權利要求9至11中任ー項的試劑，其中式I的Rl為氫或鹵素。
13.權利要求9至11中任ー項的試劑，其中式I的R2為氫、鹵素或烷基。
14.權利要求9至11中任ー項的試劑，其中式I的R3為氫、鹵素、羧基或烷氧基。
15.用于測量鈣的測試試劑盒，所述測試試劑盒包含權利要求9至14中任ー項的試劑。
全文摘要
本發明涉及用于測定鈣的試劑和使用所述試劑的測定方法。更具體地，本發明涉及用于測定鈣的包含單硝基取代的BAPTA型螯合劑(BAPTA=1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)的試劑。本發明還描述了測定方法，這種方法允許精確測定在樣品如血液樣品(例如全血、血漿或血清)或任何其它含水液體樣品(例如腦脊髓液、淋巴液、唾液或尿)中的鈣，并因此對于臨床診斷是特別有用的。
文檔編號C09B11/00GK102834721SQ201180016989
公開日2012年12月19日 申請日期2011年3月28日 優先權日2010年3月30日
發明者H-P.約瑟爾, H-J.基特齊亞, M.米克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司