專利名稱：高純度紅曲色素組分的制備方法
技術領域：
本發明屬生化制品技術領域，具體涉及一種高純度紅曲色素的制備方法。
技術背景
高速逆流色譜(High-SpeedCounter-CurrentChromatography，HSCCC)是利用溶 質在兩種互不相溶的溶劑系統中分配系數的不同，從而進行分離的色譜法。高速逆流色譜 技術無需固相載體支持，避免了因發生不可逆吸附而引起的樣品損失、變性等問題，分離用 有機溶劑易回收使用且節省了分離材料消耗。該項技術已廣泛應用于黃酮、生物堿、植物多 酚、酯類、萜類、木脂素、香豆素、皂苷等各種天然植物化學成份及抗生素的分離制備。高速 逆流色譜法制備6種高純度紅曲色素(純度大于95%)未見報道。紅曲霉在固態培養(或液態培養)過程中，產生大量次級代謝產物。其中最主 要的一類次級代謝產物為紅曲色素，屬氧雜菲酮(Azaphilone)化合物，由聚酮合成酶 (PolyketideSynthases，PKS)代謝途徑合成。紅曲霉發酵產品中含有十多種Azaphilone類 化合物，紅曲色素主要為6種組分2種紅色素(Rubropunctatamine、Monascorubramine)、 2 ftHfe (Monascin> Ankaf lavin)禾口 2 ftSfe (Rubropunctatin> Monascorubrin)0目前國內外市場上，紅曲霉發酵產品主要包括色素紅曲粉、紅曲紅色素和紅曲黃 色素。現有紅曲色素產品主要為多種色素的混合物且純度不高，不同色調的色素組分比例 不同，造成色價和色調都不穩定。若能分離純化單一組成結構的紅曲色素產品，不同色調色 素分開使用，將開拓天然紅曲色素的應用范圍。將不同色調的色素分開，按需進行調配，可 以大大提高產品著色的穩定性，不僅可以填補國內高檔食用色素的空白，而且在國際市場 極具競爭優勢。另外高純度紅曲色素組分及其衍生物的制備也有利于新型藥物研發和制藥 產業鏈的延伸。上述6種色素組分在化學結構和理化性質上十分相似，分離純化較為困難。目前 市場上未見高純度的紅曲色素產品，也未見單一組分的紅曲色素化合物標準品。張慧娟[1] 采用二次薄層層析法分離純化紅斑紅曲素，鐘立人[2]采用高效液相色譜研究紅曲色素組 分的分離，這些方法僅能純化得到毫克級紅曲色素。連喜軍[3]采用樹脂法分離紅曲黃色 素和紅色素，但各種樹脂對紅曲色素的吸附量均低于52U/g。代春華[4]采用硅膠柱層析法 分離紅曲黃色素，處理量小且較難實現單一組分紅曲色素的分離純化。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種高純度紅曲色素的制備工藝。本發明以紅曲米為原料，經粉碎后，采用萃取液提取_高速逆流色譜法分離_結 晶的組合技術，分離純化得到6種紅曲色素組分，分別為紅斑胺(Rubropunctamine )、 衾工 ft tE Monascorubramine)> 衾工 ft ^(Monascin)> 衾工 ft H ^ (Ankaflavin)> HM % (Rubropunctatin)、紅曲紅素(Monascorubrine))晶體，各種色素純度均大于95%，可用于 食品、化妝品著色劑及保健品的制備。
本發明以紅曲米為原料，經粉碎、萃取液提取得到色素粗提物，然后經過制備型高 速逆流色譜儀分離，根據紫外檢測器譜圖分別收集6個色素組分進行結晶操作，得到6種高 純度紅曲色素組分；所述6種高純度紅曲色素組分為紅斑胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅曲黃素、 紅斑素、紅曲紅素，純度大于95%。具體制備步驟如下
原料采用色價為800-6000U/g (E^ 505nm，GB4926-2008)的紅曲米，粉碎至粒徑
100-1000 iim，然后按紅曲米粉與萃取液比為1 :5-20 (w/v)的配比置于15_60°C條件下 浸泡、攪拌或回流提取，提取液經過濾、真空濃縮，析出色素粗提物；所述萃取液采用有機 溶劑與水按10 1-10配比(v/v)混合；所述有機溶劑包括甲醇、乙醇或丙酮。色素粗提物 采用高速逆流色譜法分離純化，步驟如下將溶劑A，B, C，D組分按體積比2. 5-10 0-7. 5 3-8 2. 5-7. 5 (v :v :v :v)置于漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡后，將上相和下相分開，上相 作為固定相使用，下相作為流動相使用；進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速 100-1000轉，將流動相泵入柱內，待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，根據紫外檢 測器譜圖收集目標組分；所述的溶劑A選自石油醚、正已烷、環已烷或正庚烷中的一種；所 述的溶劑B選自乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或氯仿中的一種；所述的溶劑C選自甲醇、乙醇、 異丙醇、丙酮或丁香酮中的一種；所述的溶劑D為水；根據紫外檢測器譜圖分別收集6個色 素組分進行結晶操作，所述的結晶操作將收集到的6個色素組分分別真空濃縮至干，再用 結晶溶液溶解，30-60°C真空濃縮至過飽和，然后緩慢降溫至10-30°C即析出大量色素晶體； 所述的結晶溶液為有機溶劑與水按10 1-10 (v/v)配比混合而成；所述有機溶劑為甲醇、乙 醇、異丙醇、氯仿或丙酮中的一種或幾種混合。本發明的顯著優點本發明通過高速逆流色譜的方法，實現了 6種紅曲色素的分 離純化。分離用有機溶劑易回收使用且節省了分離材料消耗，克服了薄層層析法、高效液相 色譜法、樹脂法和硅膠柱層析法處理量小且較難實現單一組分色素有效分離純化的問題。 本發明采用萃取液提取_高速逆流色譜法分離_結晶的組合技術，制備得到了 6種高純度 紅曲色素晶體。具有操作步驟簡單和收率高的優點。
圖1為純化后6種紅曲色素的HPLC譜圖； 圖2為純化后6種紅曲色素的光譜圖3為純化后6種紅曲色素的HPLC-MS圖；其中Rl、R2、Yl、Y2、01和02分別為 Rubropunctatamine、Monascorubramine、Monascin、Ankaflavin> Rubropunctatin 禾口 Monascorubririo
具體實施例方式原料采用色價為800-6000U/g (E505nm，GB4926-2008)的紅曲米，粉碎至
粒徑100-1000 iim，然后按紅曲米粉與萃取液比為1 :5-20 (w/v)的配比置于15_60°C條件 下浸泡、攪拌或回流提取，提取液經過濾、真空濃縮至萃取液體積1/4-1/2即析出色素粗提 物。色素粗提物經過制備型高速逆流色譜儀分離，根據紫外檢測器譜圖分別收集6個色素組分進行結晶操作，得到6種高純度紅曲色素組分。其中所述萃取液采用有機溶劑(甲醇、乙醇或丙酮)與水按10 1-10配比(v/v)混
口 O所述色素粗提物采用高速逆流色譜法分離純化，具體步驟如下將溶劑A，B，C，D 組分按體積比2. 5-10 0-7. 5 3-8 2. 5-7. 5 (v :v :v :v)置于漏斗中，搖勻靜置分層。待平 衡后，將上相和下相分開，上相作為固定相使用，下相作為流動相使用。進樣前，先用固定相 存滿整個柱子，調整主機轉速100-1000轉，將流動相泵入柱內，待整個體系建立動態平衡 后，由進樣閥進樣，根據紫外檢測器譜圖收集目標組分。所述的溶劑A選自石油醚、正已烷、環已烷或正庚烷中的一種；所述的溶劑B選自 乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或氯仿中的一種；所述的溶劑C選自甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮或 丁香酮中的一種；所述的溶劑D為水。所述的結晶操作將收集到的目標色素組分樣品分別置于燒瓶中真空濃縮至干，以 結晶溶液溶解，30-60°C真空濃縮至過飽和，然后緩慢降溫至10-30°C即析出大量色素晶體； 所述的結晶溶液為有機溶劑與水按10 1-10 (v/v)配比混合而成；所述有機溶劑為甲醇、乙 醇、異丙醇、氯仿或丙酮中的一種或幾種混合。以下結合具體實施例，進一步闡述本發明，但是本發明不僅限于此。實施例1
紅曲米色價5100U/g，含紅色素(紅斑胺和紅曲紅胺)10. lg/Kg，橙色素(紅斑素和紅曲 紅素)48.3g/Kg，黃色素(紅曲素和紅曲黃素)41.9g/Kg。粉碎至粒徑0. 1mm，采用70% (重量 比，下同)乙醇溶液萃取(60°C水浴，固液比1 :10)后，真空濃縮至原體積1/2即析出紅曲色 素粗提物，得率10. 1%。采用柱體積為300mL的高速逆流色譜系統分離。選取正已烷-甲醇-水作為溶劑 體系，按10:7. 5:2.5(v :v :v :v)配比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。 取上層為固定相，下層為流動相。稱取200mg紅曲色素粗提物，以20mL固定相溶解待用。進樣前，用固定相充滿整 個柱體積，調整主機轉速至SOOrpm/min，將流動相以4ml/min流速泵入柱內建立動態平衡 后，采用進樣閥進樣；然后分別收集目標色素組分。目標組分分離液置60°C條件下真空濃縮至干，收集色素純化組分用90%甲醇溶液 溶解，置60°C條件下真空濃縮至過飽和，緩慢降溫至10°C即析出大部分色素晶體，Rl、R2、 Yl、Y2、01 和 02 的收率分別為 83. 22%,84. 78%,84. 22%,82. 96%,82. 54% 禾口 81. 40%。結晶樣品采用HPLC歸一化法測定純度，結果如圖1所示，Rl、R2、Yl、Y2、01和02 純度分別為 99. 1%、99. 3%, 99. 5%, 99. 1%、99. 9% 和 99. 6%。R1、R2、Y1、Y2、01 和 02 的光譜圖 如圖2所示，可將6種色素分為三組。第一組為紅色素，包括2種紅色素物質(R1和R2)，其 光譜圖在304、413和524nm處有特征吸收峰，最大吸收峰位于304nm。第二組為黃色素，包 括2種黃色素物質(Y1和Y2)，其光譜圖在231、291和387nm處有特征吸收峰，最大吸收峰位 于391nm。第三組為橙色素，包括2種橙色素物質(01和02)，其光譜圖有四個特征吸收峰， 分別在波長213、247、286和467nm處，最大吸收峰位于467nm。Rl、R2、Yl、Y2、01和02的 HPLC-MS圖如圖3所示，其分子量分別為353、381、358、386、354和382。根據光譜圖和分子 量，推斷 R1/R2、Y1/Y2 禾口 01/02 分別為 Rubropunctatamine、Monascorubramine、Monascin、Ankaflavin>Rubropunctatin 禾口 Monascorubrin。實施例2
紅曲米色價3000U/g，粉碎至粒徑1mm，采用70% (重量比，下同)甲醇溶液萃取(60°C水 浴，固液比1 :15)后，真空濃縮至原體積1/3即析出紅曲色素粗提物，得率6. 7%。采用柱體積為1000mL的高速逆流色譜系統分離。選取石油醚_乙酸乙酯_乙 醇-水作為溶劑體系，按2. 5:7.5:5:5(v:v:v 配比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中， 搖勻后靜置分層。取上層為固定相，下層為流動相。稱取800mg紅曲色素粗提物，以50mL固定相溶解待用。進樣前，用固定相充滿整 個柱體積，調整主機轉速至900rpm/min，將流動相以lOml/min流速泵入柱內建立動態平衡 后，采用進樣閥進樣；然后分別收集目標色素組分。目標組分分離液置60°C條件下真空濃縮至干，收集色素純化組分用85%丙酮溶液 溶解，置48°C條件下真空濃縮至過飽和，緩慢降溫至15°C即析出大部分色素晶體，Rl、R2、 Yl、Y2、01 和 02 的得率分別為 80. 54%,82. 24%,81. 40%,82. 75%,84. 74% 和 85. 52%。采用 HPLC 測定結果表明，其純度分別為 99. 5%,99. 4%,99. 2%,99. 5%,99. 7% 和 99. 7%。實施例3
紅曲米色價4000U/g，粉碎至粒徑1mm，采用90%丙酮水溶液萃取(60°C水浴，固液比1 5)，萃取后的提取液真空濃縮至原體積1/3即析出紅曲色素組份粗提物，得率8. 5%。采用柱體積為1000mL的高速逆流色譜系統分離。選取環已烷-氯仿-異丙醇-水 作為溶劑體系，按5:6:8:2. 5 (v :v :v :v)配比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后 靜置分層。取上層為固定相，下層為流動相。稱取800mg紅曲色素粗提物，以50mL固定相溶解待用。進樣前，用固定相充滿整 個柱體積，調整主機轉速至900rpm/min，將流動相以lOml/min流速泵入柱內建立動態平衡 后，采用進樣閥進樣；然后分別收集目標色素組分。目標組分分離液置60°C條件下真空濃縮至干，收集色素純化組分用70%乙醇溶液 溶解，置60°C條件下真空濃縮至過飽和，緩慢降溫至10°C即析出大部分色素晶體，Rl、R2、 Yl、Y2、01 和 02 的得率分別為 82. 11%,83. 35%,82. 78%,84. 63%,81. 93% 和 83. 68%。采用 HPLC 測定結果表明，其純度分別為 98. 3%,98. 7%,98. 6%,99. 2%,99. 6% 和 98. 7%。
權利要求
一種紅曲色素組分的制備方法，其特征在于以紅曲米為原料，經粉碎、萃取液提取得到色素粗提物，然后經過制備型高速逆流色譜儀分離，根據紫外檢測器譜圖分別收集6個色素組分進行結晶操作，得到6種高純度紅曲色素組分。
2.根據權利要求1所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于所述6種高純度紅 曲色素組分分別為紅斑胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅曲黃素、紅斑素、紅曲紅素，純度大于95%。
3.根據權利要求1所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于原料采用色價為 800-6000U/g的紅曲米，粉碎至粒徑100-1000 iim，然后按紅曲米粉與萃取液比為1 :5_20 (w/v)的配比置于15-60°C條件下浸泡、攪拌或回流提取，提取液經過濾、真空濃縮，析出色 素粗提物。
4.根據權利要求1或3所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于所述萃取液采 用有機溶劑與水按10 1-10配比(v/v)混合；所述有機溶劑包括甲醇、乙醇或丙酮。
5.根據權利要求1所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于色素粗提物采用高 速逆流色譜法分離純化，步驟如下將溶劑A，B, C，D組分按體積比2. 5-10 :0-7.5 :3-8 2. 5-7. 5 (v :v :v :v)置于漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡后，將上相和下相分開，上相作 為固定相使用，下相作為流動相使用；進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速 100-1000轉，將流動相泵入柱內，待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，根據紫外檢 測器譜圖收集目標組分。
6.根據權利要求5所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于所述的溶劑A選自 石油醚、正已烷、環已烷或正庚烷中的一種；所述的溶劑B選自乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或 氯仿中的一種；所述的溶劑C選自甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種；所述的溶劑D為水。
7.根據權利要求1所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于所述的結晶操作是 將收集到的6個色素組分分別真空濃縮至干，再用結晶溶液溶解，30-60°C真空濃縮至過飽 和，然后緩慢降溫至10-30°C即析出色素晶體。
8.根據權利要求8所述的紅曲色素組分的制備方法，其特征在于所述的結晶溶液為 有機溶劑與水按10 1-10 (v/v)配比混合而成；所述有機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿或 丙酮中的一種或幾種混合。
全文摘要
本發明提供了一種制備高純度紅曲色素的新工藝。本發明以紅曲米為原料，經粉碎后，采用萃取液提取-高速逆流色譜法分離-結晶的組合技術，分離純化得到6種紅曲色素組分，分別為紅斑胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅曲黃素、紅斑素、紅曲紅素，各種色素純度均大于95%，可用于食品、化妝品著色劑及保健品的制備。本發明分離用有機溶劑易回收使用且節省了分離材料消耗，克服了薄層層析法、高效液相色譜法、樹脂法和硅膠柱層析法處理量小且較難實現單一組分色素有效分離純化的問題。本發明采用萃取液提取-高速逆流色譜法分離-結晶的組合技術，制備得到了6種高純度紅曲色素晶體。具有操作步驟簡單和收率高的優點。
文檔編號C09B61/00GK101864191SQ20101020589
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者石賢愛, 鄭允權, 郭養浩 申請人:福州大學