黃烷酮化合物及其應用的制作方法

專利名稱：：黃烷酮化合物及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的黃烷酮化合物，以及各自含有該黃烷酮化合物的抗氧化劑、抗菌劑、抗癌劑、食品飲料、化妝品、準藥物和藥物。眾伎不已知的黃烷酮化合物可列舉蓮葉桐A(nymphaeol-A)，蓮葉桐B(nymphaeol-B)和蓮葉桐C(nymphaeol-C)。對于這些已知的黃烷酮化合物，可參見"K.Yakushijin，K.Shibayama，H.Murata和H.Furukawa:由HemandiaNymphaefolia(presl)Kubitzki得到的新異戊二烯黃烷酮，雜環雜志，14巻397-402頁，1980"，"W.R.Phillips,N.J.Baj,A.A.L.Gunatilaka和D.G.I.Kingston:由Mimulusclevelandii得到的C-香葉基化合物，天然產物雜志，59巻495-497頁，1996"，以及"M.H.Tseng,C.H.Chou,Y.M.Chen和Y.H.Kuo:由macarangatanarius落葉得到的異種相克相成異戊二烯黃烷酮，天然產物雜志，64巻827-828頁，2001"。Nymphaeol-A是從Hemandianymphaefolia(presl)Kubitzki或Mimulusclevelandii分離f尋歪ij的。Nymphaeol-B是從Hemandianymphaefolia(presl)Kubitzki分離f尋至U的。Nymphaeol-C是從Hemandianymphaefolia(presl)Kubitzki或Macarangatanarius分離得到的。然而，這些黃烷酮化合物的生理活性還不明了。
發明內容因此，本發明人進行了廣泛的研究以尋找已知黃垸酮化合物的生理活性，并通過分離新的黃烷酮化合物以發現新黃烷酮化合物的有用的生理活性。本發明是基于由此獲得的發現而做的。本發明的第一個目的是提供一種具有各種應用如食品飲料和藥物的新黃烷酮化合物。本發明的第二個目的是提供利用了這些黃烷酮化合物的有用生理活性的對已知的或新的黃垸酮化合物的應用。為了達到上述目的，本發明首先是提供了由下式表示的黃烷酮化合物:OHOHO本發明的另一方面是提供各自含有上述黃烷酮化合物的抗氧化劑、抗菌劑、抗癌劑、食品飲料、化妝品、準藥物和藥物。本發明還有一個方面是提供各自含有至少一種選自蓮葉桐A(nymphaeol-A)、蓮葉桐B(nymphaeol-B)和蓮葉桐C(nymphaeol-C)的黃垸酮化合物的抗氧化劑、抗菌劑、抗癌劑、食品飲料、化妝品、準藥物和藥物。圖1中的表匯集了實施例中的化合物1的物理化學性質。圖2中的表顯示了實施例中的化合物1的核磁共振數據。圖3中的表匯集了實施例中的化合物2的物理化學性質。圖4中的表顯示了實施例中的化合物2的核磁共振數據。圖5中的表匯集了實施例中的化合物3的物理化學性質。圖6中的表顯示了實施例中的化合物3的核磁共振數據。圖7中的表匯集了實施例中的化合物4的物理化學性質。圖8中的表顯示了實施例中的化合物4的核磁共振數據。具體實施方式下面說明本發明的第一實施方式。根據第一實施方式的黃烷酮化合物是5,7,3'，4'-四羥基-5'-C-香葉基黃烷酮(isonymphaeol-B)，由結構式1表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>該黃垸酮化合物的分子式為C25H2806，分子量為424，熔點為123126°C(見圖3)。該黃烷酮化合物是一種天然存在的新化合物，并由本發明人從沖繩蜂膠中分離出來。雖然該黃烷酮化合物的結構特性類似于圣草酚的，但是它在5'-位置有C-香葉基。因此，它具有比圣草酚更高的親脂性(或膜滲透性)。該黃烷酮化合物具有同圣草酚或a-生育酚一樣高的抗氧化作用。此外，該黃垸酮化合物具有抗癌作用，其能夠抑制癌細胞如乳癌細胞的擴散。此外，該黃烷酮化合物具有誘導生理學細胞死亡(或編程性細胞死亡)的作用，以除去不希望有的細胞如癌變細胞和已接近細胞壽命的老化細胞。此外，該黃烷酮化合物對革蘭氏陽性細菌如金黃葡萄球菌和生孢子細菌如Genus氏桿菌具有抗菌作用。根據第一實施方式的抗氧化劑含有該黃烷酮化合物作為活性成分(或抗氧化組分)。該抗氧化劑可作為防腐劑添加到食品飲料中以有效的抑制各種產品的變質(主要是氧化變質)，如油脂的氧化變質，香料的變質，色素的分解和褪色。在一個通過口攝取了含有該抗氧化劑的食品飲料如保健食品的活體中，該黃烷酮化合物除去活性氧以起到增強健康的作用，如肝功能增強作用，乙酸毒性的降低，低密度脂蛋白膽固醇(LDL)的抗氧化作用，乳癌細胞的抑制擴散作用，以及改善免疫功能。該抗氧化劑可包含在化妝品或準藥物中使用。此時，它起到對皮膚、口腔等的美白作用和防老化作用等等。根據第一實施方式抗菌劑含有該黃烷酮化合物作為活性成分。該抗菌劑是加入到例如食品飲料中來使用的。在這種情況下用于防止食品飲料腐敗。該抗菌劑可以加入到藥物中使用，或可以作為例如傳染病治療藥物或抗菌化療的藥物使用。該抗菌劑可加入到化妝品或準藥物中使用。此時，其作用是保持皮膚、口腔、腋窩等處的清潔。當該抗菌劑加入到食品飲料、藥物、化妝品或準藥物中使用時，這些產品中含有的黃烷酮化合物的濃度優選為10ppm或更大，更優選20ppm或更大，進一步優選為30ppm至10,000ppm，尤其優選為50ppm至l,OOOppm。當黃烷酮化合物的濃度小于10ppm時，抗菌作用難以充分發揮。相反，當濃度大于10,000ppm時則不經濟。根據第一實施方式的抗癌劑含有該黃烷酮化合物作為活性成分，其主要作為藥物使用。抗癌劑劑量的確定要使得當黃烷酮化合物作用于癌細胞時其濃度優選在0.1uM至100mM，更優選10至1,000"M。如果黃烷酮化合物的濃度小于0.1yM時，治療效果將很弱。相反，當濃度大于100mM時則不經濟。該抗癌劑的成人劑量以黃烷酮化合物計，優選0.510g每天，更優選25g每天。當黃垸酮化合物的日劑量小于0.5g時，抗癌作用難以充分發揮。相反，當日劑量大于10g時則不經濟。該抗癌劑的兒童劑量優選為成年人劑量的一半。當該黃烷酮化合物包含在食品飲料(如保健食品)、化妝品或準藥物中時，這些產品能夠通過促進對如癌變細胞等不希望有的細胞的生理消除來達到防癌效果。當產品為藥物時，該黃垸酮化合物在其中的濃度優選為1至50%,更優選為10至30%。根據第一實施方式的食品飲料含有該黃烷酮化合物。這些食品飲料可含有上述的抗氧化劑或抗菌劑。由于包含在食品飲料中的黃烷酮化合物的抗氧化劑作用，這些食品飲料能夠除去體內活性氧，并因此作為能夠發揮各種增強健康作用的保健食品使用。包含在食品飲料中的黃垸酮化合物還因其防變質作用而能夠防止食品飲料的變質，從而提高了食品飲料的儲藏穩定性，或籍黃烷酮化合物的抗菌作用而防止食品飲料的腐敗，從而提高食品飲料的儲藏穩定性。因此，食品飲料的品質可在長時間內保持穩定。因其抗癌的作用，食品飲料中所包含的黃烷酮化合物能夠促進不希望有的細胞如癌變細胞和己接近細胞壽命的老化細胞的生理消除。因此這些食品飲料還可作為能夠發揮極大的增進健康作用的保健食品使用。該食品飲料的成人攝入量以黃垸酮化合物計，優選0.0510g每天，更優選0.25g每天。當黃烷酮化合物的日攝入量小于0.05g時，黃烷酮化合物的抗氧化作用難以有效發揮。相反，當日攝入量大于10g時則不經濟。第一實施方式具有以下優點。第一實施方式的黃烷酮化合物是5,7,3',4'-四羥基-5'-C-香葉基黃垸酮(isonymphaeol-B)，由上面的結構式l表示。由于該黃烷酮化合物具有抗氧化作用、抗癌作用、抗菌作用等，它可以具有多種用途，包括食品飲料和藥物。尤其是，黃垸酮化合物是一種單一化合物，卻能同時發揮多重和多種功效。因此，對于該黃烷酮化合物可用作以蜂膠為代表的多功能保健食品的原料這一點尤其值得注意。此外，該黃烷酮化合物還可用在類似于圣草酚的應用，以及親脂性比圣草酚更高的各種應用中。由于黃垸酮化合物包含在傳統上用作保健食品原料的蜂膠中，在經口攝取和經皮膚攝入上不存在問題。第一實施方式的抗氧化劑含有高抗氧化作用的黃烷酮化合物作為活性成分。因此，當在食品飲料、化妝品或準藥物中加入該抗氧化劑時，其能夠防止這些產品的變質以提高儲藏穩定性，并且當該抗氧化劑經口頭攝取或皮下攝入時能夠在體內發揮健康增強作用和抗老化作用。第一實施方式的抗菌劑含有高抗菌作用的黃烷酮化合物作為活性成分。因此，當在食品飲料、化妝品或準藥物中加入該抗菌劑時，其能夠防止這些產品的變質以提高儲藏穩定性，并且當該抗菌劑作為化妝品或準藥物經皮下攝入時能夠發揮高保健作用和高除臭作用。該抗菌劑還可作為藥物使用。第一實施方式的抗癌劑含有高抗癌作用的黃烷酮化合物作為活性成分。因此，該抗癌劑對癌癥具有高的療效，并具有防癌的效果。第一實施方式的食品飲料(飲料或食品)含有具有抗氧化作用、抗癌作用和抗菌作用等的黃垸酮化合物。因此，對于該食品飲料，防止了其自身的變質和腐敗，且在體內同時發揮多種有益功效，如健康增強作用、抗老化作用，新陳代謝增強作用和防癌效果。當食品飲料中黃烷酮化合物的含量設置在相對小的量時，很易得到其儲藏穩定性只是因黃烷酮化合物的防變質或防腐敗作用而得到提高的食品飲料。下面說明本發明的第二實施方式。根據第二實施方式的黃垸酮化合物包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質。nymphaeol-B是5,7,3'，4'-四羥基-2'-C-香葉基黃垸酮，由結構式2表示nymphaeol-B的分子式為C25H2806，分子量為424，熔點(MP)為8083°C(見圖1)。nymphaeol-B是一種天然存在的有機化合物，并由本發明人從沖繩蜂膠中分離出來。雖然nymphaeol-B的結構特性類似于圣草酚，但是它在2'-位有C-香葉基。因此，它具有比圣草酚更高的親脂性(或膜滲透性)。nymphaeol-A是5,7，3',4'-四羥基-6-C-香葉基黃烷酮，由結構式3表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>nymphaeol-A的分子式為C25H2806，分子量為424，熔點(MP)為172175°C(見圖5)。nymphaeol-A是一種天然存在的有機化合物，并由本發明人從沖繩蜂膠中分離出來。雖然nymphaeol-A的結構特性類似于圣草酚，但是它在6-位有C-香葉基。因此，它具有比圣草酚更高的親脂性(或膜滲透性)。nymphaeol-C是5，7，3'，4'-四羥基-6-(3"'，3"'-二甲基烯丙基)-2'-C-香葉基黃垸酮，由結構式4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>nymphaeol-C的分子式為C3()H3606，分子量為492(見圖7)。nymphaeol-C是一種天然存在的有機化合物，并由本發明人從沖繩蜂膠中分離出來。雖然nymphaeol-C的結構特性類似于圣草酚，但是它在6-位有一個3"',3"'-二甲基烯丙基，以及在2'-位有一個C-香葉基。因此，nymphaeol-C具有比圣草酚、nymphaeol-A和nymphaeol-B都更高的親脂性(或膜滲透性)。nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中任何一個都具有如同圣草酚或a-生育酚一樣的抗氧化作用。此外，nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C中的任何一個都具有抗癌作用，其能夠抑制癌細胞如乳癌細胞的擴散。nymphaeol-A和nymphaeol-C的抗癌作用比nymphaeol-B的要高。每個nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C都具有誘導生理學細胞死亡(編程性細胞死亡)的作用，從而除去不希望有的細胞如癌變細胞和己接近細胞壽命的老化細胞。此外，nymphaeol-B對革蘭氏陽性細菌如金黃葡萄球菌和生孢子細菌如Genus氏桿菌具有抗菌作用。每個nymphaeol-A和nymphaeol-C都對革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌和上述的革蘭氏陽性菌和生孢子菌具有抗菌作用。根據第二實施方式的抗氧化劑包含選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C中的至少一種作為活性成分(或抗氧化組分)。該抗氧化劑可作為防腐劑添加到食品飲料中以有效的抑制各種產品的變質(主要是氧化變質)，如油脂的氧化變質，香料的變質，色素的分解和褪色。在一個通過口攝取了含有該抗氧化劑的食品飲料如保健食品的活體中，每個nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C都具有除去活性氧以起到增強健康的作用，如肝功能增強作用，乙醛毒性的降低，低密度脂蛋白膽固醇(LDL)的抗氧化作用，抑制乳癌細胞擴散的作用，以及改善免疫功能。該抗氧化劑可包含在化妝品或準藥物中使用。此時，它起到對皮膚、口腔等的美白作用和防老化作用等等。根據第二實施方式的抗菌劑包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質來作為活性成分。該抗菌劑是加入到例如食品飲料中來使用的。在這種情況下用于防止食品飲料腐敗。該抗菌劑可以加入到藥物中使用，或可以作為例如傳染病治療藥物或抗菌化療的藥物使用。該抗菌劑可加入到化妝品或準藥物中使用。此時，其作用是保持皮膚、口腔、腋窩等處的清潔。當該抗菌劑加入到食品飲料、藥物、化妝品或準藥物中使用時，這些產品中含有的nymphaeol-A，nymphaeol陽B禾口nymphaeol-C的總濃度優選為10ppm或更大，更優選15ppm或更大，進一步優選為30ppm至10，000卯m，尤其優選為50ppm至1,000ppm。其總濃度小于50ppm時，發揮的抗菌作用難以令人滿意。相反，當濃度大于10，000ppm時則不經濟。根據第二實施方式的抗癌劑包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質來作為活性成分，其主要是作為藥物使用。該抗癌劑劑量的確定要使得當nymphaeol-A,nymphaeol-B和nymphaeol-C作用于癌細胞時其總濃度優選在0.1nM至100mM，更優選10至1,000uM。當其總濃度低于0.1uM時，療效會很弱。相反，當濃度大于lOOmM時則不經濟。該抗癌劑的成人劑量以nymphaeol-A，nymphaeol-B禾Bnymphaeol-C計，優選0.510g每天，更優選25g每天。當nymphaeol-A，nymphaeol-B禾tlnymphaeol-C的日劑量小于0.5g時，抗癌作用難以充分發揮。相反，當日攝入量大于10g時則不經濟。nymphaeol-A,nymphaeol-B和nymphaeol-C的兒童劑量優選為成年人的一半。當選自nymphaeol-A,nymphaeol-B和nymphaeol-C的至少一種物質包含在食品飲料(如保健食品)、化妝品或準藥物中時，這些產品能夠通過促進對如癌變細胞等不希望有的細胞的生理消除來達到防癌效果。當產品為藥物時，nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C在其中的總濃度優選為1至50%，更優選為10至30%。根據第二實施方式的食品飲料包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質。這些食品飲料可以含有上述的抗氧化劑或抗菌劑。由于包含在食品飲料中的nymphaeol-A,nymphaeol-B和nymphaeol-C的抗氧化作用，這些食品飲料能夠除去體內活性氧，并因此作為能夠發揮各種健康增強作用的保健食品使用。包含在食品飲料中的nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeo-C還因其防變質作用而能夠防止食品飲料的變質，從而提高了食品飲料的儲藏穩定性，或籍其抗菌作用而防止食品飲料的腐敗，從而提高食品飲料的儲藏穩定性。因此，食品飲料的品質可在長時間內保持穩定。在食品飲料中的nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C通過其抗癌作用，促進了那些不希望有的細胞如癌變細胞和已接近細胞壽命的老化細胞的生理去除。因此這些食品飲料還可用作能夠發揮極大的增進健康作用的保健食品使用。該食品飲料的成人攝入量以nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C計，優選0.0510g每天，更優選0.25g每天。當nymphaeol-A,nymphaeol-B禾Bnymphaeol-C的日攝入量小于0.05g時，抗氧化作用難以有效地發揮。相反，當日攝入量大于10g時則不經濟。第二實施方式具有以下優點。由于nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中任一種都具有抗氧化作用、抗癌作用和抗菌作用等，它們可以具有多種用途，包括食品飲料和藥物。尤其是，雖然nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中每一個是單一化合物，卻能同時發揮多重和多種功效。因此，對于nymphaeol-A,nymphaeol-B和nymphaeol-C中每一個都可用作以蜂膠為代表的多功能保健食品的原料這一點尤其值得注意。此外，nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C還可用在類似于圣草酚的應用，以及親脂性比圣草酚更高的各種應用中。由于nymphaeol-A，nymphaeol-B或nymphaeol-C包含在傳統上用作保健食品原料的蜂膠中，在經口攝取和經皮膚攝入上不存在問題。根據第二實施方式的抗氧化劑包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質作為活性成分，其中每個都具有高抗氧化作用。因此，當在食品飲料、化妝品或準藥物中加入該抗氧化劑時，其能夠防止這些產品的變質，從而提高儲藏穩定性，并且當該抗氧化劑經口頭攝取或皮膚攝入時能夠在體內發揮健康增強作用和抗老化作用。根據第二實施方式的抗菌劑包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質作為活性成分，其中每個都具有高抗菌作用。因此，當在食品飲料、化妝品或準藥物中加入該抗菌劑時，其能夠防止這些產品的變質，從而提高儲藏穩定性，并且當該抗菌劑作為化妝品或準藥物經皮膚攝入時能夠發揮高保健作用和高除臭作用。該抗菌劑還可作為藥物使用。根據第二實施方式的抗癌劑包含至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質作為活性成分，其中每個都具有高抗癌作用。因此，該抗癌劑對癌癥具有高的療效，并具有防癌的效果。第二實施方式的食品飲料(飲料或食品)含有至少一種選自nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的物質，其中每個都具有抗氧化作用、抗癌作用和抗菌作用等。因此，對于該食品飲料，防止了其自身的變質和腐敗，且在體內同時發揮多種有益功效，如健康增強作用、抗老化作用，新陳代謝增強作用和防癌效果。當食品飲料中nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的含量設置在相對小的量時，很易得到其儲藏穩定性只是因nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的防變質或防腐敗作用而得到提高的食品飲料。以下，將結合實施例對本發明加以更詳細地描述。<化合物的分離>在50g沖繩蜂膠原料中加入500ml乙醇，而后超聲處理數分鐘。將該溶液在室溫下攪拌一整夜，將殘留物質過濾掉。將得到的提取液減壓濃縮以得到39.73g的乙醇提取液。然后，在下述條件下對該乙醇提取液進行柱型色譜法分離，用下面(l)到(ll)的淋洗溶劑淋洗得到11種鎦分。柱管玻璃柱，5.0X45cm填料硅膠，約590cm3淋洗溶劑(1)己烷乙酸乙酯=卯10(350ml)(2)己烷乙酸乙酯=80:20(220ml)(3)己烷乙酸乙酯=70:30(250ml)(4)己烷乙酸乙酯=60:40(1000ml)(5)己烷乙酸乙酯=50:50(200ml)(6)己烷乙酸乙酯=40:60(100ml)(7)己烷乙酸乙酯=30:70(100ml)(8)己烷乙酸乙酯=20:80(100ml)(9)己烷乙酸乙酯=10:90(100ml)(10)乙酸乙酯(200ml)(11)甲醇(700ml)當所得到的每個餾分在下列HPLC(高效液相色譜)條件1下分析時，已經證實用淋洗溶劑(4)淋洗得到的餾分(稱作"第四餾分")含有四種主要成分。HPLC條件1柱YMC-PackR&DODS(4.6X250誦)溶劑A:水(與2%的乙酸)，B:乙腈(與2%的乙酸)淋洗條件0-60min(梯度淋洗；A:B=80:2020:80)流率1ml/min檢測280nm紫外線然后，該第四餾分在以下HPLC條件2下分離和凈化，從而分離出化合物1(產率61.1mg)，化合物2(產率65.7mg)和化合物3(產率99.8mg)。此外，該第四餾分在以下HPLC條件3下分離和凈化，從而分離出化合物4(產率20.0mg)。HPLC條件2柱YMC-PackR&DODS(20X250mm)溶劑水(與0.1。/。的TFA):乙腈(與0.P/。的TFA)=40:60流率9ml/min檢測280nm紫外線HPLC條件3柱YMC-PackR&DODS(20X250匪)溶劑水(與0.1。/。的TFA):乙腈(與0.1。/。的TFA)=20:80流率9ml/min檢測280nm紫外線<化合物14的鑒定>每個化合物14的結構通過'H-NMR(核磁共振)，13C-NMR，MS(質譜)，IR(紅外)光譜，UV(紫外)光譜等等分析。(化合物l)化合物1的物理化學性質如圖1所示。由ESI-MS測定證實化合物1的分子量為424。IR光譜顯示，在3420cm—1處有一個羥基，在1680cm"有一個羰基，由UV光譜顯示出黃烷酮或黃垸醇的特征光譜，從而認定化合物1具有黃浣酮構架。由^-NMR光譜積分值確認存在28個質子，由。C-NMR光譜觀察到25個信號。由DEPT光譜識別出三個甲基、四個亞甲基、七個次甲基和十一個季碳原子。從上述結果可知化合物1的分子式是<:25!12806。此外，由圖2的核磁共振數據，同時參照HSQC光譜，iH」HCOSY，HMBC光譜，CD光譜(圓二色性譜)等，認定化合物1是由上述結構式(2)表示的nymphaeol-B(5,7,3',4'-四羥基-2'-C-香葉基黃烷酮)。盡管由Hemandianymphaefolia(presl)Kubitzki分離得到該化合物己有報告，但是采用本研究的方法從蜂膠分離得到這種化合物則是首次。(化合物2)化合物2的物理化學性質如圖3所示。由ESI-MS測定證實化合物2的分子量為424。IR光譜顯示，在3360cm—1處有一個羥基，在1680cm"有一個羰基，由UV光譜顯示出黃烷酮或黃垸醇的特征光譜，從而認定化合物2具有黃烷酮構架。由^-NMR光譜積分值確證實存在28個質子，由。C-NMR光譜觀察到25個信號。由DEPT光譜識別出三個甲基、四個亞甲基、八個次甲基和十一個季碳原子。從上述結果可知化合物2的分子式是C25H2806。此外，由圖4的核磁共振數據，同時參照HSQC光譜，iH」HCOSY，HMBC光譜，CD光譜等，認定化合物2是由上述結構式(l)表示的5,7,3',4'-四羥基-5'-C-香葉基黃烷酮。該化合物是一個至今未在文獻中有報導的新化合物。(化合物3)化合物3的物理化學性質如圖5所示。由ESI-MS測定證實化合物3的分子量為424。由IR光譜顯示，在3380cm"處有一個羥基，在1680cm"有一個羰基，由UV光譜顯示出黃烷酮或黃垸醇的特征光譜，從而認定化合物3具有黃垸酮構架。由^-NMR光譜積分值確證實存在28個質子，由t-NMR光譜觀察到25個信號。由DEPT光譜證實存在三個甲基、四個亞甲基、七個次甲基和十一個季碳原子。從上述結果可知化合物3的分子式是C25H2806。此外，由圖6的核磁共振數據，同時參照HSQC光譜，'H」HCOSY，HMBC光譜，CD光譜等，認定化合物3是由上述結構式(3)表示的nymphaeol-A(5,7,3'，4'-四羥基-6-C-香葉基黃烷酮)。盡告，但是采用本研究的方法從蜂膠分離得到這種化合物則是首次。(化合物4)化合物4的物理化學性質如圖7所示。由FAB-MS測定證實化合物4的分子量為492。由IR光譜顯示，在3400cm—1處有一個羥基，在1640cm—1有一個羰基，由UV光譜顯示出黃烷酮或黃烷醇的特征光譜，從而認定化合物4具有黃烷酮構架。由^-NMR光譜積分值確證實存在36個質子，由13C-NMR光譜觀察到存在有30個碳原子。由DEPT光譜證實存在五個甲基、五個亞甲基、七個亞甲基次甲基和十三個季碳原子。從上述結果可知化合物4的分子式是(33必3606。此外，由圖8的核磁共振數據，同時參照HSQC光譜，iH」HCOSY，HMBC光譜，CD光譜等，認定化合物4是由上述結構式(4)表示的nymphaeol-C(5,7,3',4'-四羥基誦6-(3'",3"'-二甲基烯丙基)-2'-C-香葉基黃烷酮)。盡管由Hernandianymphaefolia(presl)Kubitzki和Macarangatanarius分離得到該化合物已有報告，但是采用本研究的方法從蜂膠分離得到這種化合物則是首次。<測定在蜂膠中的含量>為了解沖繩蜂膠中究竟含有多少化合物14，在下列HPLC條件4下作分析以確定每個化合物14的含量。結果是，經證實每100g沖繩蜂膠原料中含有12.7g的化合物l，10.5g的化合物2，13.5g的化合物3和9.1的化合物4。HPLC條件4柱YMC-PackR&DODS(4.6X250mm)溶劑A:水(與0.P/。的TFA)，B:乙腈(與0.1%的TFA)淋洗條件0~50min(梯度淋洗;A:B=65:35—0:100)流率1ml/min檢測280nm紫外線<DPPH自由基清除活性測試>DPPH(d,a-二苯基-e-苦基肼基)是一個紫色穩定的自由基，在517nm處出現最大光吸收，并可通過獲得氫而轉變為無色肼。利用該顯色反應便可確定每個化合物14的自由基清除活性。也就是說，將每個化合物l4溶于乙醇中制得3ml濃度為25uM的樣品溶液。其后，在每個得到的樣品溶液中加入0.5mM的DPPH溶液0.75ml(溶劑是乙醇)并攪拌，在蔽光處反應一小時，然后測定其在517nm下的吸光率。此外，作為化合物14的替代，使用BHT(丁基化羥基甲苯)、a-生育酚或圣草酚以確定按照與上述相同程序的吸光率。此外，作為上述樣品溶液的替代，使用乙醇作為對照以確定按照與以上相同程序的吸光率。每種原料的自由基清除活性(％)使用以下計算式1計算。結果如下列表l所示。順便提及，表l中的每個值是運作三次得到的平均值及其標準偏差。計算式l(自由基清除活性)=[{(對照樣品的吸光率)-(樣品溶液的吸光率)}/(對照樣的吸光率)]X100表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表l的結果顯示，化合物14每個的自由基清除活性都比BHT的高，且基本上與ci-生育酚的自由基清除活性相同。其中，化合物3的自由基清除活性最高，它與圣草酚的基本上相同。雖然化合物l、3和4都是已知原料，但對其自由基清除活性還未按慣例研究過。而本研究對化合物l、3和4各自非常高的自由基清除活性第一次得到了澄清。<0-胡蘿卜素褪色測試>e胡蘿卜素會因過氧化亞油酸(亞油酸自氧化的產物)與e胡蘿卜素中的雙鍵反應而褪色。利用該現象便可確定每個化合物14的抗氧化活性。也就是說，首先，將2ml的200mg/ml的Tween-40的氯仿溶液、0.4ml的100mg/ml的亞油酸的氯仿溶液和3ml的0.1mg/ml的P胡蘿卜素的氯仿溶液混合，然后用氮氣除去溶劑。隨后，加入100ml的蒸餾水并充分攪拌以獲得乳液。在3ml所得到的乳液中加入乙醇以完全溶解溶劑中的溶質。其后，將每個化合物l4溶于乙醇以制備濃度為1.2mM的樣品溶液。將50y1的樣品溶液與上述溶質已完全溶解的乳液混合以制備反應液(或樣品反應液)。于是每個化合物l4在該反應液中的濃度為20um。將該反應液在60'C下培養60分鐘。然后測量每種反應液在培養前后對470nm的吸光率。此外，用BHT、a-生育酚或圣草酚替代化合物l4以確定按照與上述相同程序的反應液在培養前后的吸光率。此外，作為對照，制備一種不含樣品溶液的反應液(或對照反應液)以確定按照與上述相同程序的反應液在培養前后的吸光率。每種原料的抗氧化活性(％)用以下計算式2計算。結果由上述表l所示。順便提及，表l中的每個值是運作三次得到的平均值及其標準偏差。計算式2(抗氧化活性)=[{(對照樣的退色率)-(樣品溶液的退色率)}/(對照樣的退色率)X100注意在計算式2中，"對照樣的退色率"是對照反應液在培養前的吸光率除以培養后的吸光率再除以60所得到的值的自然對數；而"樣品溶液的退色率"是樣品反應液在培養前的吸光率除以培養后的吸光率再除以60所得到的值的自然對數。表l的結果顯示并證實，化合物2具有與BHT、a-生育酚和圣草酚大致相同的高抗氧化活性。表l的結果顯示并證實，化合物14中的任何一種都具有高抗氧化活性，在它們之中，化合物l、2和4具有與每個BHT、a-生育酚和圣草酚都大致相同的高抗氧化活性。雖然化合物1、3和4是已知材料，但對其抗氧化活性還未按慣例研究過。而本研究對化合物1、3和4各自非常高的抗氧化活性第一次得到澄清。<抑制乳癌細胞擴散測試>在培養乳癌細胞(mcf-7)時，如果加入具有促進細胞擴散作用的雌二醇(或ne-雌二醇)，能夠在短期內促進乳癌細胞的擴散。利用這一現象來檢測化合物14等對乳癌細胞擴散的抑制效果。也就是說，首先，用二甲基亞砜稀釋每個化合物14以制備樣品溶液。其后，在一個96格平皿的每個格中接種2X103個mcf-7，4小時后加入雌二醇和樣品溶液。在每個格子中加入雌二醇以使雌二醇的最終濃度為O.lum，而樣品溶液的最終濃度為0.2!xm，2ym，或20um。在按預定時間(三或五天)培養后，將每個培養基換成新的培養基，在新的培養基中加入10%新培養基的量的酶溶液(細胞計數Kit-8:Wako)。培養基在37'c的培養箱中保持兩個小時以后，用分光光度計測定培養基在450nm波長下的吸光率(基準波長630nm)以對每個格中的活細胞數目定量。對那些培養期定為五天的格子，在培養第三天時，培養基替換為一個新培養基，然后，在新培養基中加入雌二醇和樣品溶液，繼續培養至第五天。對那些培養期定為零天的格子，在細胞培養4小時之后向培養基中加入酶溶液。將該培養基在37'c的培養箱中保溫兩小時，然后測定吸光率。作為化合物14的替代，圣草酚被用來測定按照與上述相同程序的吸光率，從而對每個格子中的活細胞數目定量。此外，用未加入雌二醇或樣品的對照樣1來測定按照與上述相同程序的吸光率，從而對每個格子中的活細胞數目定量，而使用未加入樣品的對照樣2來測定按照與上述相同程序的吸光率，從而對每個格子中的活細胞數目定量。將對照樣1在零天培養期后的活細胞數目假定量化為1，那么上述每輪操作量化得到的活細胞數目的相對值如表2所示。順便提及，表2中的每個值是來自八個格子的平均值及其標準偏差。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由表2的結果可以證實，化合物14每個都具有抑制乳癌細胞擴散的作用，并多少有些差異。此外還發現每個化合物14抑制乳癌細胞擴散的效果與其濃度相關。尤其是對于加入有20uM化合物3或4的格子，具有相對于對照樣1更強的抑制乳癌細胞擴散的作用(即對乳癌細胞的細胞毒素效果)。盡管化合物l、3和4是已知材料，但對其抑制乳癌細胞擴散的作用還未按慣例研究過。而本研究對化合物1、3和4各自非常高的抗癌活性第一次得到澄清。<關于乙醇提取物的抗菌活性試驗>用E.coli(IF03366)作為革蘭氏陰性細菌的生物指示劑，金黃葡萄球菌(IFO15035)作為革蘭氏陽性菌的生物指示劑，蠟樣芽胞桿菌(IFO15305T)作為具有甚至對加熱消毒等處理都具有耐受性的生孢子細菌的生物指示劑，以及用從變質罐頭食品中分離得到的凝結芽孢桿菌作為導致罐頭食品變質的真菌的生物指示劑，從而對每個化合物14的抗菌活性加以評價。也就是說，首先，從蜂膠原料中提取的乙醇(見<化合物的分離>一節)溶于70%乙醇，然后，制備提取物濃度為0ppm,12.5ppm,25ppm,50卯m,100ppm或150ppm的標準瓊脂培養基。隨后，這些標準瓊脂培養基經過高壓消毒以制備評價培養基，每個生物指示劑在每個這樣的評價培養基中接種以觀察其生長發育。結果證實，乙醇提取液濃度越高，每個生物指示劑的生長發育被抑制得更強。尤其是當乙醇提取液濃度為30ppm或以上，或50ppm或以上時，在培養基中未檢測到生物指示劑。順便提及，先前已證實70%乙醇對每種生物指示劑的生長發育幾乎沒有效果。<關于化合物14的抗菌活性試驗>用E.coli和Salmcnelkenteritidis(S.en;NBRC3313)作為革蘭氏陰性細菌的生物指示劑，金黃葡萄球菌(Sta.)作為革蘭氏陽性菌的生物指示劑，以及用蠟樣芽胞桿菌(B.ce)作為生孢子細菌的生物指示劑來評價每個化合物14的抗菌活性。也就是說，首先，將每個化合物14溶解于70°/。乙醇，然后，制備每個化合物14的濃度為Oppm,5ppm,10ppm,15ppm，20ppm或50ppm的標準瓊脂培養基。隨后，這些標準瓊脂培養基經過高壓消毒以制備評價培養基，每個生物指示劑在每個這樣的評價培養基中接種。在接種每種細菌之后，測定每個皮式培養皿的細菌數目(CFU/皮式培養皿)。結果由表3和表4所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從表3的結果可以發現，化合物1或2的濃度越高，對革蘭氏陽性菌和生孢子細菌的生長發育的抑制就更強。此外，還發現任何濃度的化合物1和任何濃度的化合物2對每個E.coli和S.en的生長發育幾乎沒有效果。此外，由此結果還發現，當化合物1或2作為抗菌成分包含在食品飲料、藥物、化妝品或準藥物中時，化合物1或2在這些產品中的濃度優選為10ppm或以上，更優選15ppm或以上。從表4的結果發現，化合物3和4對任何生物指示劑都具有抗菌活性，尤其對E.coli，Sta.和B.ce具有很高的抗菌活性。此外，由此結果還發現，當化合物3作為抗菌成分包含在食品飲料、藥物、化妝品或準藥物中時，化合物3在這些產品中的濃度優選為10ppm或以上，更優選15ppm或以上。此外，由此結果還發現，當化合物4作為抗菌成分包含在食品飲料、藥物、化妝品或準藥物中時，化合物4在這些產品中的濃度優選為10ppm或以上，更優選50ppm或以上。注意，先前已證實70%乙醇對每種生物指示劑的生長發育幾乎沒有效果。權利要求1.一種抗氧化劑，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐C的黃烷酮化合物。2.—種抗菌劑，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐C的黃烷酮化合物。3.—種抗癌劑，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐C的黃烷酮化合物。4.一種食品飲料，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐-C的黃烷酮化合物。5.如權利要求4所述的食品飲料，其特征在于，所述食品飲料中所含的黃垸酮化合物的濃度為30ppm到10,000ppm。6.—種化妝品，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐C的黃垸酮化合物。7.—種準藥物，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐C的黃烷酮化合物。8.—種藥物，其特征在于，含有至少一種選自蓮葉桐A、蓮葉桐B和蓮葉桐C的黃烷酮化合物。全文摘要本發明的抗氧化劑、抗菌劑、抗癌劑、食品飲料、化妝品、準藥物和藥物的每個都含有用下列結構式表示的新黃烷酮化合物。或者，本發明的抗氧化劑、抗菌劑、抗癌劑、食品飲料、化妝品、準藥物和藥物中每個都含有至少一種選自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黃烷酮化合物。文檔編號C09K15/08GK101130536SQ200710152920公開日2008年2月27日申請日期2004年6月18日優先權日2003年6月20日發明者下位香代子,中山勉,后藤崇輝,新垣勉,熊澤茂則,福本修一申請人:百佳株式會社