專利名稱：水溶性3h－吲哚菁染料的制作方法
技術領域：
本發明屬于精細化工高新技術功能染料。
背景技術：
3H-吲哚菁染料是于二十世紀八十年代才被發現其具有較好的熒光性能，可用作生物熒光標示劑應用在DNA自動測序中。該類染料具有與生物基質結合后熒光增強，最大吸收波長可調諧范圍大(300nm-1800nm)等特點，可根據各類需要合成得到各種適直波段吸收的系列產品，尤其是近紅外熒光染料。近紅外染料可避免檢測時熒光背景的干擾，使檢測靈敏度大幅提高，成為熒光標示劑的重要發展方向。而3H-吲哚菁染料是目前使用最廣泛的近紅外染料。作為嵌入劑及熒光標示劑在生物芯片，DNA測序，免疫檢測等方面有重要應用，但各方面性能良好的水溶性熒光染料品種較少。
Waggoner等設計開發的商品化水溶性熒光染料Cy3，Cy5，Cy7的結構如下 其結構特點是吲哚環5位上有磺酸基存在，其中一個N原子上的取代基為羧戊基，另一個N原子上的取代基與之相同或為短鏈烷基。因其熒光及水溶性等各方面性能良好，是目前應用最好的水溶性熒光探針。故以其為新化合物母體結構。光穩定性差是該類熒光探針的最大弱點。
姚祖光等研究了吲哚環N原子上引入各種取代基對吲哚菁染料化合物光穩定性的影響。其研究的吲哚菁染料與Waggoner等設計開發的不同之處在于吲哚環的5位上無磺酸基存在。絕大多數為非水溶性染料，主要用作CD-R光盤上的光記錄介質。研究結果表明N原子上為芐基取代時，吲哚菁染料的穩定性高于相應的鏈烷基取代的染料。
Patonay，陳萍，A.J.G.Mank，姚祖光等研究了六元或五元環，方酸殘核，克酮酸殘核等甲川鏈吲哚菁染料，結果證明這些剛性環的引入使吲哚菁染料的光穩定性大幅提高。但他們研究的吲哚菁染料5位上也無磺酸基存在，且N原子上取代基也不含鄰或間或對羧芐基。
隨著科學術的進步，熒光標示技術得到了飛速發展，使熒光標示劑—熒光染料在DNA自動測序、免疫分析、臨床診斷、新藥設計和開發中得到了重要應用。尤其近年來以熒光染料為標示劑具有多功能的生物芯片的出現，使熒光染料有了更加廣闊的應用前景。熒光性能、光穩定性、溶解性、成本價格是熒光染料在生物領域中應用的重要影響因素。我國在水溶性生物熒光標記探針新產品開發方面研究較少，國外已有部分產品商品化。但光穩定性差，合成難，分離提純更難，價格昂貴是目前使用的熒光探針存在的主要問題。通過吲哚環N原子上取代基的更換及甲川鏈中剛性環的引入，對目前主要使用的進口商品化生物探針Cy3，Cy5，Cy7進行結構改造，使新染料化合物的光穩定性、熒光性能提高，成本降低。并簡化分離方法，使之適合于工業化生產。
發明內容
本發明對稱或非對稱水溶性3H-吲哚菁染料的分子結構具有如下通式 其中Y＝-CH-，-CHCH＝CH-，-CHCH＝CHCH＝CH-， Z＝O，S，Se，Te，CR2R3(R2，R3＝H，CH3，CF3，C2H5)；R1＝(CH2)mCH3，(CH2)mCOOH，(CH2)mSO3-， m＝0-18R4，R5，R6，R7＝H，F，(CH2)pCF3，(CH2)pCN，SO3-，SO3H，(CH2)pCH3，OH，O(CH2)pCH3，(CH2)pCOOH；P＝0-4不難看出水溶性3H-吲哚菁染料最大的結構特征是在帶有水溶性基的2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽的1位N原子上連接著鄰或間或對-羧芐基，使新染料上的羧基可與生物基質中NH2共價結合，加上甲川鏈中剛性環的引入，使整個染料增加了光穩定性，提高了熒光性能，降低了生產成本。
水溶性3H-吲哚菁染料的合成，首先是制備該類染料的中間體，即由2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀鹽與鄰或間或對-氯甲基苯甲酸反應，兩者的摩爾比為1∶1-2，在鄰二氯苯中回流反應8-16小時，可制得1-鄰或間或對-羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀中間體 其次，將制得的2分子1-鄰或間或對-羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀使其自身在縮合劑的參與下進行縮合反應，可制得對稱性的具有上述通式的水溶性3H-吲哚菁染料。也可將1-鄰、間或對-羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀與其它不同結構的中間體在縮合劑的參與下進行縮合，制得不對稱的水溶性3H-吲哚菁染料。這兩類染料，均是由兩者兩端的氮雜環通過共軛甲川鏈使它們連接在一起，因而，將這些染料按共軛甲川鏈形式的不同，大致可分為五種類型A型，B型，C型，D型，E型。A型為線性甲川鏈吲哚菁染料；B型為方酸殘核甲川鏈吲哚菁染料；C型為克酮酸殘核甲川鏈吲哚菁染料；D型為六元或五元環甲川鏈吲哚菁染料；E型為異佛爾酮殘核甲川鏈吲哚菁染料。
它們的基本結構式及合成條件如下 上述五類反應原料及產物中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，Z的代表含義與前述相同。
本發明水溶性3H-吲哚菁染料的特點為(1)新染料化合物的結構特點是分子為大的π共軛體系，最大吸收在540-800nm之間；吲哚環5位上有磺酸基存在，使分子具有水溶性，增大了分子的穩定性，減少了分子的聚集程度；兩個N原子上至少有一個羧芐基取代基，其中的羧基可與生物基質中的NH2共價結合。
(2)本產品通過吲哚環N原子上羧芐基及甲川鏈中剛性環的引入，對目前主要使用的進口商品化生物探針Cy3，Cy5，Cy7進行結構改造，使新染料的光穩定性能提高。同時由于N原子上的取代基的更換，也使染料的熒光性能有所改善，染料中間體的合成原料變得相對易得，價格低廉，反應活性提高，從而使染料合成容易，成本降低。
(3)可以采用普通硅膠柱，用適宜比例的正丁醇、吡啶、乙醇和水為洗脫劑進行分離，使原來僅靠RP-C18或RP-C8柱儀器分離變得更加簡單、成本低、批處理量大，適合于工業化生產。
(4)新染料產品可應用于生物分析(如DNA的嵌入劑及DNA芯片中的熒光標示劑)、藥物設計與開發、太陽能電池(光敏劑)、光盤(如可錄型光盤的光記錄介質)、照相感光(增感劑如感紅劑)、紡織等領域，有著廣闊的產業化前景。
具體實施例方式
實施例11-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀染料中間體的合成4.0mmol2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀鹽和4.8mmol對氯甲基苯甲酸在10ml鄰二氯苯中混合，并加熱到105-110℃，反應10小時后，冷卻，移去溶劑，殘渣固體用異丙醇研磨，得到中間體固體顆粒。
實施例2(A型n＝1，Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)在已加熱至回流的2.8mmol的1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀的吡啶溶液中，滴入5.0mmol原甲酸三乙酯。然后繼續反應約2-2.5h后，冷卻至室溫。反應液用乙醚稀釋，靜置，傾去上層清液，暗紅色固體凝結在瓶底，用甲醇溶解，然后加入異丙醇使沉淀再次析出，過濾，得粗固體產品，干燥。染料通過硅膠柱分離，用洗脫液正丁醇∶吡啶∶乙醇∶水＝3-2∶1∶1∶0-0.5洗脫，收集紫粉色組分，收率40％。
實施例3(A型n＝2，Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2CH3；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)3.0mmol的1-乙基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀和3.4mmol的縮合劑(PhNHCH＝CHCH＝NPhHCl)溶于12ml醋酸和醋酐中，然后在110℃下反應2h。冷卻，旋轉蒸發除去溶劑。固體殘渣用乙酸乙酯洗滌，然后將之溶于醋酐和吡啶中，再加入3.0mmol1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀，于110℃下反應約2-3h。冷卻，加乙醚稀釋，靜置。過濾，得黑藍色固體。硅膠柱分離，洗脫液為正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1。
實施例4(A型n＝3，Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)0.5mmol縮合劑(PhNHCH＝CHCH＝CHCH＝NPh)溶于熱的4ml醋酐和1ml吡啶混合物中，然后加入1.0mmol1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀，再升溫回流10分鐘，冷卻，加乙醚稀釋，靜置。過濾，沉淀物用甲醇溶解，再用異丙醇析出，得黑綠色固體。硅膠柱分離，洗脫液為正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1。
實施例5(B型Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)將1.4mmol的1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀的8ml吡啶溶液和0.7mmol方酸的10ml苯和正丁醇(1∶1)溶液分別加入到三口瓶中，加熱回流4h后冷卻至室溫。加乙醚稀釋，靜置。過濾，得藍色固體。硅膠柱分離，洗脫液為正丁醇∶吡淀∶乙醇＝3-1∶1∶1∶0-0.5。
實施例6(C型Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)1.4mmol的1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀的8ml吡啶溶液和0.7mmol克酮酸的10ml苯和正丁醇(1∶1)溶液混合后，加熱回流4h，冷卻至室溫。加乙醚稀釋，靜置。過濾，得綠色固體。硅膠柱分離，洗脫液為正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1。
實施例7(D型Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)3.0mmol的1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀和2.0mmol五元或六元環縮合劑，以30ml醋酸酐溶解，再加入5.0mmol無水醋酸鈉，于氮氣室溫下攪拌6h。加入乙醚稀釋，靜置。過濾，沉淀物用甲醇溶解，濾去不溶物，減壓濃縮。硅膠柱分離，洗脫液為正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1或三氯甲烷∶乙醇＝4∶1，收集綠色組分。
實施例8(E型Z＝S；L＝SCH3；R1＝(CH2)4SO-3；R4，R5R6R7＝H；X＝CH3C6H4SO-3)3.0mmol的1-對羧芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀，9.0mmol異佛爾酮加入到35ml醋酸酐中，加熱至110℃，反應約15h，冷卻，析出固體后，過濾。濾餅和6.0mmolN-(δ-磺丁基)-2-甲硫基雜環季銨鹽加入到10ml吡啶中，回流2h。冷卻至室溫。加乙醚稀釋，靜置。過濾得染料固體。
權利要求
1.一類由2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉磺酸衍生物與其結構相同或不同的另一個中間體，經縮合劑的連接制得的水溶性3H-吲哚菁染料，其特征在于該對稱或非對稱的水溶性3H-吲哚菁染料的分子結構具有如下通式 其中Y＝-CH-，-CHCH＝CH-，-CHCH＝CHCH＝CH-， Z＝O，S，Se，Te，CR2R3(R2，R3＝H，CH3，CF3，C2H5)；R1＝(CH2)mCH3，(CH2)mCOOH，(CH2)mSO3-， m＝0-18R4，R5，R6，R7＝H，F，(CH2)pCF3，(CH2)pCN，SO3-，SO3H，(CH2)pCH3，OH，O(CH2)pCH3，(CH2)pCOOH；P＝0-4
2.一類按照權利要求1所述水溶性3H-吲哚菁染料的分離方法，其特征在于染料合成后，經過冷卻，過濾，采用硅膠柱作為分離載體，用正丁醇∶吡啶∶乙醇∶水＝1-3∶1∶1∶0-0.5(體積比)作為洗脫液，得到染料。
全文摘要
本發明提供了一類對稱或非對稱的水溶性3H－吲哚菁染料,它的分子結構具有如下通式:其中:見右式。該類染料由于羧芐基的引入,增加了光穩定性,提高了熒光性能,降低生產成本。可用于生物分析、藥物設計與開發,太陽能電池、光盤、照相感光等領域。
文檔編號C09B23/00GK1364829SQ0210292
公開日2002年8月21日 申請日期2002年1月30日 優先權日2002年1月30日
發明者彭孝軍, 王麗秋 申請人:大連理工大學