裝置和制劑的制作方法

專利名稱：裝置和制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用電場處理液體的方法和裝置，特別是(但并非排它性地)涉及采用電場霧化(comminuting)相對高導電性的液體制劑如含水制劑的方法和裝置。
采用電場處理液體的方法描述于，例如，GB-A-1569707中。在該方法中，它稱為電場流體動力學(electrohydrodynamic)方法(本文有時也稱之為“EHD”)，從出口流出的液體受到電場的作用使液體在進入自由空間或空氣時，該液體中的凈電荷可抵消液體的表面張力，而同類電荷所產生的排斥力引起錐形射流(cone and jet)。然后，根據不同液體制劑，該液體射流可如GB-A-1569707中所述被分散成小液滴，或者可以如申請人的WO98/03267(其全部內容通過引用結合于本文中)所述被分散形成固體或膠體樣顆粒或可以形成連續纖維，所述可以碎裂成較短的長度(“纖絲”)。為簡便起見，本文將電場流體動力學方法獲得的產物統稱為“電溶膠”。
電場流體動力學方法特別有利于控制所生成的產物的大小并提供了一條將藥物或藥劑傳遞到呼吸系統，例如肺系統，以及其它上皮或局部表面例如傷口表面的極為有效的途徑，如在WO98/03267中所述。此外，如WO98/03267中所述，電場流體動力學方法可以用于噴霧復合膠體劑，如果該膠體劑起初實際上是液態的話。
與一些常規生產氣溶膠的方法不同，電場流體動力學方法能夠產生霧狀或云狀液滴(“氣溶膠”)，其中液滴為單分散性的，即它們具有非常均勻的大小并且不需要拋射氣體。這使得如申請人的US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377以及WO99/07478中所述的采用電場流體動力學方法的吸入器(它能夠傳遞至少部分釋放電荷的液滴)與WO00/35524中所述的采用電場流體動力學方法的吸入器(它能夠傳遞帶電的液滴)具有特殊優勢，因為沒有氣體拋射劑使得吸入器易于使用，當吸入時無須從吸入器中定時噴出氣體，而且氣溶膠的單分散性質與電場流體動力學方法所提供的控制液滴大小的能力相結合，使得藥物或其它藥劑能夠靶向于呼吸系統的特定部位，例如肺的特定區域。US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377、WO99/07478和WO00/35524的全部內容均通過參考結合到本說明書中。
隨著對生物種類手術(biological species operate)、獸醫和醫學治療途徑的認識的增加，越來越多的生物分子或材料如DNA、RNA、蛋白質、肽、激素、脂質、細胞因子等被結合到治療、處理和預防藥物如疫苗中。在本文中所用的術語“生物材料”包括生物學分子，生物學分子片段如DNA片段以及重組生物學分子，包括蛋白質如酶及其它類似大小的生物材料。這些生物材料隨其復雜性而變化但是某些，尤其是蛋白質和DNA，對其鄰近的環境極為敏感并且容易裂解或變性，這可以降低它們的活性并且甚至將其完全消除。生物材料的傳遞有時還需要采用等滲或緩沖的液體載體，并且由于這些物質通常生產成本昂貴，釋藥系統必須盡可能地有效。
噴霧這類液體的常規方法，如噴氣或超聲霧化法，對載體液體并因此也對其中的生物材料施加較大的剪切力。已知這種數量級的剪切力使敏感的生物材料如DNA或蛋白質變性并且因此沒有易于獲得的適合即刻采用這些生物材料治療的釋藥方法。
上述生物材料的載體液體通常是含水的并且導電性相對較高。遺憾的是，已知EHD難以對導電性液體進行噴霧。大量專利和發表的論文指出所噴霧液體的電阻率必須高于10000Ohm.m。低于此值的液體可以噴霧，但在約100Ohm.m時可能會截止，低于此值的以水作基質的制劑都不會被噴入空氣中。這是部分由于水的表面張力較高，約72mN/m(毫牛頓/每米)及部分是由于水的極性特性所致，這使得任何雜質如水溶性藥物顯著促進液體的導電性。這表明非水溶劑如乙醇適于用于EHD。
此外，EHD霧化法(comminution)采用高壓(1KV和更高)直接抵消液體的表面張力而分散液體制劑。采用這樣高的電壓引起了幾個潛在的實際問題，即1)電場可能直接影響、滅活或裂解液體中的敏感物質，如生物材料；2)將大體積液體分散成小液滴時可能會通過超強剪切力而使這些敏感生物材料產生物理變性；3)在噴嘴周圍分散的氣體可能產生臭氧，它能夠與制劑中的任何水分反應生成其自身為強氧化劑的過氧化氫，而它的存在可能導致分子變性。
這些問題已經表明，迄今為止EHD實際上只能應用于較小的、穩定的分子，例如沙丁胺醇和布地縮松，它們在類似乙醇的選擇性溶劑中具有良好的溶解性。然而，對于生物材料而言，乙醇不是良好溶劑，因為它會導致沉淀(例如它對于DNA會如此)和變性(例如它對于敏感蛋白會如此)。
在一個方面，本發明提供一種能夠使所用的EHD具有高導電性的，通常是含水的液體的方法。
在一個方面，本發明提供一種能夠使EHD用于分配(dispense)生物材料如DNA、RNA、蛋白質、肽、激素、脂質、細胞因子及重組生物分子的方法。
在一個方面，本發明提供一種采用EHD處理液體的控制方法，其中液體中揮發性組分在液體經受電場的鄰近區域內的蒸氣分壓受到控制。
在一個方面，本發明提供一種控制電場流體動力學霧化含水液體制劑以產生液滴的方法，其中在液體所流入區域內的空氣被干燥或去濕以引起蒸發而減小液滴的大小。這將使所產生的液滴易于供給嬰兒甚至很小的哺乳動物，例如小鼠的呼吸系統。
在一個方面，本發明提供一種能夠將生物材料及其它敏感分子或化合物如藥物傳遞給人或動物例如小鼠的EHD吸入裝置。
在一個方面，本發明提供能夠產生含敏感的、以水為基質的分子的可吸入液滴的裝置和方法，所述方法優于目前可利用的任何其它方法。
在一個方面，本發明提供電場流體動力學霧化裝置，該物質不導致生物材料或敏感分子變性，并因此受益于在控制粒徑和電荷下產生霧化。
在一個方面，本發明提供一種噴霧敏感分子或生物材料而不使之變性的方法。
在一個方面，本發明提供一種改進的EHD處理的氣溶膠產物的方法，該方法能夠保持產物的一致性(不論產物是固體、凝膠或液體)并且通過影響液體的局部蒸發特性而改變液滴的大小。
在一個方面，本發明提供一種在溶液中加入乙醇而不使DNA沉淀的制備DNA的制劑。
在一個方面，本發明提供一種通過EHD噴霧DNA的方法，其中加入一種酸(例如，乙酸)以制備可以在更高濃度下噴霧的含DNA溶液。
在一個方面，本發明提供一種通過EHD噴霧DNA的方法，其中EDTA或過氧化氫酶被加入到待噴霧的液體中以防止DNA降解。
在一個方面，本發明提供一種通過EHD噴霧DNA的方法，其中含水或高表面張力的制劑通過加入增加量的表面活性物質，濃度一般顯著高于臨界膠團濃度(Critical Micelle Concentration)，可以獲得噴霧。
在一個方面，本發明提供一種通過向待噴霧的液體中加入至少一種長鏈聚合物(例如，PVP、PVA、乙基纖維素)而使含水或導電性高的制劑能夠通過EHD噴霧的方法。
在一個方面，本發明提供一種通過向待噴霧的液體中加入聚合物(或者為單一聚合物或組合的聚合物)而使通常形成不穩定噴霧的制劑能夠通過EHD噴霧的方法。
在一個方面，本發明提供一種通過向待噴霧的液體制劑中加入表面活性物質和聚合物而提高EHD制劑的可噴霧性(sprayability)的方法。
在一個方面，本發明提供一種通過EHD噴霧生物材料的方法，其中聚合物被加入到待噴霧的含生物材料的液體制劑中。這保護并穩定了液體制劑中敏感的生物材料。
在一個方面，本發明提供一種通過向制劑中加入聚合物而制備任選在極性條件下通過EHD的可噴霧制劑的方法。這使得能夠利用US-A-6105877和US-A-5915377中所述的雙噴嘴或雙出口裝置噴霧液體制劑。
在一種實施方案中，所提供的裝置和方法能夠使含藥物和/或生物材料的含水液體被電場流體動力學霧化而產生理想的用于吸入的噴霧體或分散體并傳遞到體內上皮，包括肺、支氣管、喉、口和鼻道，并且還能夠有利地用于所有的局部用藥。
在此通過實施例，并參照附圖，描述本發明的實施方案，其中

圖1表示第一實施例的分配(dispensing)裝置部分剖面圖(part-cross-sectional view)；圖2表示第二實施例的分配裝置部分剖面圖；圖3和4分別表示用作口腔和鼻腔吸入器的分配裝置實例；圖5表示采用具體實施本發明方法獲得的液滴頻譜圖；圖6表示DNA凝膠電泳的印跡(trace)圖的照片，以比較采用本發明具體方法產生的霧化或碎裂的含DNA液滴噴霧中獲得的降解量和采用其它方法產生的霧化或氣霧化的含DNA液滴噴霧中獲得的降解量。
圖7表示DNA凝膠電泳的印跡圖的照片，圖示說明了當采用本發明具體方法產生霧化或氣霧化的含DNA質粒的液滴噴霧時，各種DNA質粒沒有降解。
圖8和9顯示分別說明加入EDTA和過氧化氫酶對過氧化氫降解的影響的圖10表示采用本發明具體方法所產生的霧化物實例照片；圖11表示采用本發明具體方法所產生的霧化物的另一個實例的照片；圖12至14表示傳遞適于吸入的電溶膠的不同吸入裝置的示意流程圖；圖15表示用于圖12所示吸入裝置的EHD霧化室和吸氣室透視圖；圖16和17表示適用于吸入裝置的空氣處理器(air adaptation unit)的不同實例的斷面圖；圖18表示說明在有和無空氣處理器下圖12所示吸入裝置的吸氣室內隨時間的濕度變化的曲線圖；圖19和20圖解說明了在吸入裝置中可用作空氣處理器的兩種類型的冷阱圖；圖21表示圖1所示的分配裝置的一種改進型式的部分剖面示意圖；圖22表示圖2所示的分配裝置的一種改進型式的部分剖面示意圖；和圖23表示的圖形表示用不同溶劑孵育后Eagan 4A LPS與rSP-D結合的曲線圖。
現在參看圖1，這是表示適用于后文詳述的本發明具體實施方法中的分配裝置1。該裝置1具有通常由電絕緣性材料構成的外罩2。外罩2具有出口3并被分隔成第一室和第二室4和5。第二室5有空氣入口2a。第一室內含電源6例如電池、用于從電池電壓產生高壓(千伏級)的高壓發生器7和用于貯存要經電場流體動力學處理的液體的貯庫8。在此實例中，所述貯庫連接著通常絕緣的輸液管9，該輸液管延伸到第二室5中并在第二室5中有出口10。在重力作用下或通過如US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377、WO99/07478和WO00/35524中任何一個所描述的泵將液體從貯庫8輸送到輸液管9中。提供了一種用戶可操作的開關SW以便使用戶能將電源6與高壓發生器7連接。
在此實例中，通過固定于管9內的第一導電電極11和安裝于管9外表面的第二電極12之間所建立的高壓提供霧化部位。第一和第二電極分別與高壓發生器7的高壓導線13及地線14連接。
當用戶操作開關SW以連接電源6和高壓發生器7時，在第一和第二電極之間產生高壓(通常為千伏級)，由此在鄰近出口10的霧化區域20內產生要建立的電場。從出口流出的液體由此受到這種電場的作用，使得當液體出現于自由空間或空氣中時，其液體中的凈電荷抵消了液體表面張力，而由同類電荷所產生的排斥力引起錐形射流，然后基于不同液體制劑，所述錐形射流可以被分散成液體霧滴。
分配裝置1產生一種電擊霧化法(electrically chargedcomminution)。這種裝置的進一步細節和改進可以見于WO00/35524。
US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377、WO99/07478和WO00/35524中任何一個所描述的任何一種霧化位置排列都可以用于替代上述霧化位置。此外，可以改進圖1所示裝置以使之能夠實現US-A-4962885、US-A-6105571、US-A-5813614、和GB-A-1569707中所述任何一種方式的至少部分放電的電擊霧化法。
圖2表示基于WO99/07478所述的分配裝置1a，其中第二電極12被游離于管9的放電電極12a代替，并且其中安裝了另一個電極，即偏轉電極13。在這種情況下，安置高壓發生器7以保持另一個電極13的電壓處于供給第一放電電極11和12a的電壓之間。如WO99/07478所述，后置電極13用于使霧化作用偏離放電電極12a直到霧化步驟產生足夠的空間電荷。可以改進裝置1a以使之與WO99/07478中所述任何一種實施方案或WO99/07478中所述的任何一種改進的實施方案具有相同的構造。
圖1和2所示的分配裝置1和1a可以用于將霧化物分散于室中或表面(特別是其中霧化物帶有電荷時)。在這些情況下，圖1所示第二電極12可以省去而地線可以位于噴霧所正對的表面或由該表面提供。此外，如圖3所示，出口3可以連接管嘴30以保證使用人能夠由口腔吸入霧化物或者如圖4所示可以變化以緊貼著使用者的鼻孔或稍稍小于鼻孔，以便能夠由鼻腔吸入。
現在將描述能夠用電場流體動力學處理(本文另稱為噴霧)液體的本發明的具體實施方法。
方法1現在描述一種能夠用電場流體動力學霧化含有生物材料如DNA的水溶液的方法。
EHD制劑通常摻入乙醇，因為乙醇具有較低的導電性和較低的表面張力。它可以加入到大多數的制劑中，但對于DNA，其加入通常導致沉淀。事實上，加入乙醇實際是作為一種從溶液中沉淀DNA的方法被傳授的(例見“分子克隆-實驗室手冊-第3卷，第二版(Molecular Cloning-Laboratory Manual)”Sambrook，Fritsch，Maniatis著；E10-15頁；Coldspring Harbour Press；1989)。然而我們開發了一種能夠將乙醇加入到DNA溶液中以使之適用于EHD的方法。
DNA通常貯存于含有多種化學物的鹽類的各種緩沖溶液中。在這種方法中，這些鹽的絕大多數被透析除去以產生相對純的DNA溶液。除去這些鹽后，加入乙醇以制備乙醇體積占80％的制劑。令人吃驚的是，這不會使DNA沉淀出來。然后用該制劑裝滿如圖1或2所示的分配裝置中的貯庫并激發分配裝置。在本實施例中，該液體以1μl/s(微升每秒)的流速從單一毛細管式噴嘴的輸液管噴出。當DNA的濃度較低(最高可至約200微克每毫升)時，發現該制劑的噴霧令人滿意，但在高濃度DNA下不能令人滿意地噴霧。
進一步以70％濃度的醇和最高可達90％的不同濃度的乙醇進行實驗。發現低濃度DNA全部能夠令人滿意地噴霧。
方法2重復方法1但有改進，即向制劑中加入少量(約1mM)乙酸并以0.5ml/hr(毫升每小時)的流速噴霧。發現該制劑的噴霧令人滿意，即使DNA濃度顯著增加并且達到了以6mg/ml濃度DNA進行的令人滿意的噴霧。用0.2mM至高達1mM(微摩爾)濃度的乙酸獲得類似結果。
當達到實際應用的DNA霧化速率時，具有這種濃度的DNA的常規制劑不產生任何沉淀。此外，如圖5所示，所得EHD霧化液滴具有直徑范圍極窄的非常理想的液滴頻譜。
我們發現乙酸完全地適用于該目的，但也可使用其它酸例如硝酸和鹽酸。這種制劑使得DNA能夠噴霧，而且也可以用于那些在乙醇存在下不變性的任何蛋白。
圖6表示通過不同霧化器噴霧后的多種DNA樣品的凝膠電泳圖。外側兩條泳道表示有助于結果定量的千堿基標記(kb)。pCIKβGal標記的泳道表示未被噴霧的DNA印跡。標記為“Jet”和“Ultra”的帶對應于“Sidestream”噴氣式霧化器(Medic Aid生產，Bognor Regis，英國)及“Euroneb”超聲霧化器(Medikare生產，德國)噴霧后收集的DNA。Jet和Ultra泳道中低于原位(由pCIKβGal泳道指示)的DNA的成片電泳條帶表明霧化過程導致對DNA的顯著損傷。作為對照，標記“EHD”的條帶顯示采用上述方法2分配的DNA實際上與原始的的DNA相同，說明霧化過程很少或沒有對其造成損傷。這還表明在EHD霧化過程中所采用的高壓對DNA沒有影響。
圖7表示類似于圖6的對多種不同的DNA質粒采用方法2所獲得結果的圖譜。所述結果按對分組，其中每對的左側結果代表噴霧前的DNA而右側圖譜表示采用上述方法2的EHD霧化后的DNA。所示三種質粒為4.6千堿基的pCIKCAT、9.2千堿基的pCIKCFTR.10、及14.2千堿基的pREP8βGal。由此可見采用上述方法2來分配DNA似乎對這些質粒中的任何一種沒有影響。
方法1和2可以用于通過EHD噴霧DNA、DNA片段以及不被醇類變性的其它生物材料。
方法3在方法1和2中，當EHD霧化處理期間產生的離子與制劑中的水反應時便生成過氧化氫生。盡管所產生的過氧化氫的量極少，但是過氧化物所致的DNA降解可以清楚地見到。這種降解反應由極少量天然存在且極難清除的存在于制劑中的金屬離子催化。降解量有但很少，并且在0.025mg/ml的DNA濃度以上，我們發現降解百分比幾乎難以覺察。因此，對于治療制劑，它們所具有的濃度可能比這高40倍或甚至更高，過氧化物降解可以被忽略。然而，當所噴霧的DNA濃度較低時，例如約0.0025mg/ml，對DNA的影響是顯著的。
在這種方法中，通過加入50mM乙二胺四乙酸(EDTA)或40nM過氧化氫酶而改進方法1和2的制劑。
圖8和9分別表示采用摻入作為添加劑的50mM乙二胺四乙酸(EDTA)或40nM過氧化氫酶的制劑在噴霧后收集的含DNA霧化物中的超螺旋DNA百分率(用電泳圖譜測定)。在噴霧前和后取值，而且對于各制劑只有極少的直接損害，即超螺旋DNA的變化量極小。然而，在噴霧后約一小時時，其結果開始出現偏離。此時盡管所收集的采用方法3產生的霧化物中的超螺旋DNA的量(用實心方塊表示)基本保持不變，但是所收集的沒有摻入添加劑的霧化物中的保存的超螺旋DNA的量(用空心方塊或外框方塊表示)開始減少。由此清楚表明沒有采用添加劑噴霧的DNA逐漸變質。
如上所述，盡管在高濃度DNA下方法3并非必需，因為在高濃度DNA其降解量少得可以忽略，然而當僅需要低濃度的DNA時，其結果表明通過加入螯合劑如EDTA或酶如過氧化氫酶則可以完全避免DNA降解。
另一項涉及蛋白質噴霧的實驗也已進行并且被證明在EHD霧化過程中這些分子也不變性。例如，胰蛋白酶、過氧化物酶和重組肺表面活性物質-蛋白D全部被噴霧而沒有變性。其它醇而非乙醇，例如聚乙二醇200也被采用。
方法1至3可以用于在乙醇或其它醇如聚乙二醇200中不變性的任何蛋白質或其它生物材料。
方法4引入乙醇或其它共溶劑如聚乙二醇200在某些條件下可能會導致變性并因此可能是不能接受的。
本方法提供能夠用EHD霧化可含有生物材料的含水制劑的另一種方法。迄今為止實際上不可能采用EHD霧化含水制劑。這是由于這些制劑的高表面張力和高導電性易于導致霧化點或霧化區附近的空氣分解，引起大的、分散的、局部電流，這通常導致EHD錐形射流的徹底失敗。
這時可以將適當的表面活性物質加入到含水制劑中，以降低表面張力。所有表面活性物質都具有稱作臨界膠束濃度(CMC)的內在特性，這是在液體中形成膠束的濃度，并且這通常與最小濃度相對應，在此濃度下表面活性物質的表面活性被最大化。然而，實驗表明對于EHD霧化而言，該濃度的表面活性物質太低，相反，我們發現，除表面活性劑的CMC外，表面活性物質濃度還必須增加到能夠使之單層分布于霧化物的高度特異性表面。
采用分子表面積大約為682的溴化二月桂基二甲基銨作為表面活性物質來進行實驗。采用圖1或2所示的分配裝置時臨界膠束濃度(以質量計約0.061％)不足以產生滿意的霧化作用。然而將表面活性物質濃度增加到足以形成單層包膜水平時就能夠獲得滿意的霧化作用。因此對于直徑為1.5μm的典型液滴而言，至少需要約0.4％的溴化二月桂基二甲基銨并且0.5％左右的濃度可有效產生滿意的EHD霧化作用或噴霧含水制劑。
我們還發現添加0.1％的苯扎氯銨水溶液能夠使所測電阻率僅為～60Ohm.m的液體以0.12μl/s噴霧。類似地，添加0.8％的吐溫20(一種聚氧乙烯脫水山梨糖醇衍生物)能夠使大約625Ohm.m的較高電阻率的液體以同樣的流速噴霧。
其它表面活性物質也被使用過，例如吐溫80、Emulphogen(現在稱為Rhodosurf BC720(聚氧乙烯10十六烷基醚))玻雷吉(Briji)30(聚氧乙烯4十二烷基醚)。
方法5可惜，盡管有此結果，但與采用表面活性物質相關的一些問題仍然存在。這些問題包括表面活性物質對敏感上皮產生的毒性和刺激作用；相對較低的最大流速導致治療時間延長的實際情況；這些噴霧的相對不穩定性使得錐形射流容易被機械震動所破壞；以及在實際應用中，表面活性物質通常僅僅能夠進行正極性的EHD噴霧-在負極性處的氣體更容易分解并且表面張力的降低通常不足以保證通過EHD噴霧的實際情況。
在本方法中含生物材料的傳導率的制劑可以在不需要表面活性物質的條件下達到較高的流速。在本方法中將可溶于待噴霧液體的長鏈聚合物加入到制劑中。當液體為水時，合適的聚合物包括聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚透明質酸鹽，蔗聚糖(polysucrose)，以及其它多糖，例如淀粉，纖維素、殼多糖及它們的化學衍生物，聚合氨基酸，改性膠原及其衍生物。可以使用可溶于、或可以使之溶于液體制劑(當制劑為含水制劑時可溶于水)的其它聚合物，只要它們具有合適的長度以影響液體的動力學松弛常數。還可以使用不同聚合物或不同分子量的同類聚合物的組合。例如PVP40000可以與PVP360000聯合用于噴霧含水制劑。
作為實驗，一種電阻率為約5Ohm.m的高傳導率的含水制劑被選作待噴霧的液體。該液體的表面張力為約70mN/m并且對于未改進的制劑，這種液體不能采用EHD霧化法在空氣中噴霧。在這項實驗中，發現該含水制劑在僅添加2％的分子量為360000的PVP時能夠滿意地以約1.5ml/hr的流速噴霧。
選擇的聚合物分子量很重要，因為象這樣的聚合物僅當其分子量適當的大時才能夠提供明顯實效。我們發現不同聚合物需要不同的分子量并且隨所選分子量增加其有效作用逐漸改變。作為一般規律，給定的聚合物的分子量越高，則改進噴霧制劑所需的最佳濃度越低。隨著該聚合物濃度升高，霧化產物形式由液滴轉變為纖維。發生這種轉變的濃度所表現出的作用差異實際上可以從不同的聚合物類型預見到。作為采用不同分子量的同類聚合物的實例，含增加濃度的PVP360000的乙醇制劑被噴霧并與含PVP40000的乙醇制劑進行了比較。含PVP360000的制劑在35mg/ml濃度時開始產生纖維，而含PVP40000的溶液則在260mg/ml時開始產生纖維。因此其結果是，穩定一種特定制劑時，PVP360000的需要量應比PVP40000少。作為采用不同聚合物的實例，含70％乙醇和30％鹽水(水中含0.5MNaCl)的制劑分別用PVP360000和PVA125000噴霧。對于PVP360000，聚合物的轉變濃度為55mg/ml。對于PVP125000，從液滴向纖維的轉變出現在30mg/ml的濃度下。類似地，已表明不同分子量的聚合物的組合遵從該模式。例如，將同時含PVP40000和PVP360000(比例為50∶50)的含70％乙醇和30％鹽水(水中含0.5M NaCl)的制劑噴霧，在這種情況下，組合的聚合物的轉變濃度為70mg/ml。
在另一項實驗中，采用的制劑由70％的乙醇和30％的水組成。水中還含有一些0.5M的鹽(NaCl)以模擬添加活性分子、生物材料或藥物的影響，使電阻率降低到4.7Ohm.m。將0.2g/10ml分子量為360000的PVP加入該制劑中，采用如圖1或2所示裝置噴霧該制劑。圖10顯示從收集了所產生的霧化物質的顯微鏡載玻片上拍攝的特寫照片。所形成的液滴具有可呼吸的大小，測得約為5μm或更小。照片實際大小為75μm。
在另一項實驗中將10mg/ml的分子量125000的PVA加入到含70％體積乙醇和30％體積水的制劑中，其中水中含0.5M的鹽(NaCl)而且制劑的電阻率為5.5Ohm.m。與圖10類似，圖11顯示從收集了所產生的霧化物質的顯微鏡載玻片上拍攝的照片。照片的實際大小也是75μm而且所產生的液滴是可呼吸的。
類似的結果得自含0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7克每10毫升濃度的分子量125000的PVA的液體制劑和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2克每10毫升濃度的分子量360000的PVP的液體制劑。所述液體制劑由70％乙醇和模擬生物材料形式中的活性成分存在的30％的0.5摩爾水-NaCl溶液組成。類似的結果還得自加入濃度范圍為0.5g/10ml至0.8g/10ml的50％的分子量40000的PVP和50％的分子量360000的PVP的聚合物組合的制劑。高于一定水平的上述聚合物濃度可導致纖維形成而不是形成液滴，其實際水平取決于聚合物和制劑。通常該水平對于PVP360000約為0.5g/10ml，對于50∶50的分子量為40000和360000的PVP混合物約為0.6g/10ml而對于分子量為125000的PVA約為0.25g/10ml。
摻入長鏈聚合物使得制劑的松弛常數動態地降低從而獲得傳導率的液體的更高流速。此外，并且更重要的是，摻入聚合物的液體可以以任一極性噴霧。
方法6在該方法中，聯合應用聚合物和表面活性物質以優化EHD噴霧和電溶膠產物。
采用電溶解于水中的0.5M的鹽(NaCl)溶液組成的制劑作為實例。不能采用EHD霧化使之噴霧。然而，加入1.7％(17mg/ml)的分子量為125000的PVA和1％(10mg/ml)的吐溫20之后，該制劑(其性質是電阻率＝4.3Wm；表面張力＝32mN/m；且粘度＝13cP)能夠以0.2至0.6ml/hr的流速噴霧。
類似地結果可以用上述任何聚合物獲得。
實施例7我們的實驗表明通過加入聚合物可以穩定敏感分子如蛋白質。
在這種方法中，多種蛋白質可以在噴霧前與聚乙二醇(PEG)結合。已發現這樣可以增加它們穩定性，在機械張力下保護蛋白質并使它們在其液體載體或溶媒中能夠耐受更多的變化。具有類似于PEG的特性的其它聚合物產生類似的結果。
此將描述進行噴霧胰蛋白酶、過氧化物酶和胰島素的實驗實施例。
臨床上可獲得的蛋白質例如胰島素和生長激素目前是通過注射釋藥，而不能通過口服途徑給藥，因為它們在胃腸道中被消化和滅活并且大部分在肝臟中被代謝。因此開發能夠將這些范圍廣泛的蛋白質傳遞到肺部的肺傳遞系統是非常重要的。胰島素被用于檢測以EHD技術噴霧蛋白質的效果。
酶在細胞中是必需的，并屬于大量不同類型的蛋白質。它們作為生物催化劑幾乎在生物系統中的所有生化反應中發揮作用。胰蛋白酶是發現于哺乳動物胰液的蛋白質水解消化酶。過氧化物酶是存在于植物和動物體內，特別是哺乳動物脾和肺中的另一種類型的酶，其作用于過氧化氫和有機過氧化物。因此，作為模型系統，采用這兩種酶檢測用EHD技術噴霧蛋白的效果。
方法8在此將描述采用PEG200的制劑實例。
胰蛋白酶首先將胰蛋白酶溶解于磷酸鈉(NaPO4)緩沖液中，然后用PEG200配制最終制劑20％磷酸鈉和80％PEG200中的胰蛋白酶。在+12.1kV下，以1.5μl/秒的流速，將100μl的這種制劑噴霧到含2ml NaPO4緩沖液的35mm的聚苯乙烯組織培養皿中。將浸末在磷酸鈉的鉑環用作地線。噴霧后通過移液管從培養皿中轉移胰蛋白酶/NaPO4溶液用于噴霧后的即刻，和1、2、3、4及5天后的酶檢測。全部實驗重復4次而且結果表明噴霧后99.53％的胰蛋白酶活性被保留。因此可以得出結論，當PEG200摻入胰蛋白酶制劑時，EHD噴霧技術(此實例中無放電(discharging))不導致酶活性的喪失。
過氧化物酶在20％的過氧化物酶稀釋液(含磷酸鉀緩沖液、小牛血清白蛋白和triton X-100)及80％的PEG200中配制過氧化物酶。與胰蛋白酶一樣，在+11.9kV下，以1μl/秒的流速，將100μl的這種制劑噴霧到含2ml過氧化物酶稀釋液的組織培養皿中。另外，將浸沒于過氧化物酶稀釋中鉑環用作地線。在單次實驗基礎上，在用EHD技術噴霧(無放電)后4天保留＞90％的過氧化物酶活性。
因此PEG(聚乙二醇)可以用于穩定蛋白質以易化EHD。
方法9在此將敘述一種能夠使EHD噴霧含醇和生物材料的制劑的方法。
如上文所述表明的，添加PEG200可增加蛋白質的穩定性；然而，從毒性上講，對于吸入來說制劑中80％的PEG200是高濃度的，因此考慮了替代溶劑。為此目的，用丙二醇(通常與水或甘油結合使用)配制胰蛋白酶和過氧化物酶。此外，為確定乙醇是否可能是酶噴霧的有效溶劑，還試驗了含有乙醇的制劑。
胰蛋白酶被配制在a)20％NaPO4緩沖液，80％丙二醇中[能夠在+(8.1-8.6)kV電壓下以0.6-2.4μl/秒的流速噴霧]，b)20％NaPO4緩沖液，40％丙二醇，40％乙醇中[能夠在+8.32kV下以0.6-1μl/秒的流速噴霧]，c)20％NaPO4緩沖液，60％丙二醇，20％乙醇中[能夠在+(7.42-7.62)kV電壓下以0.6-1μl/秒的流速噴霧]，溶液(b)和(c)在其配置后立刻變成乳狀的。
過氧化物酶被配制在d)20％過氧化物酶稀釋液，80％丙二醇中[能夠在+9.5kV下以0.6μl/秒的流速噴霧]，e)20％過氧化物酶稀釋液，40％丙二醇，40％乙醇中，f)20％過氧化物酶稀釋液，60％丙二醇，20％乙醇中，溶液(e)和(f)僅能夠以0.01-0.02μl/秒的流速噴霧；當流速較高時便產生電暈(corona)。這些溶液在其配置后立刻變成乳狀的。
蛋白質通常溶解于含有各種化學物鹽類的緩沖液中。當它們用醇配制時溶液變成乳狀，提示可能是醇使鹽發生沉淀。初步的實驗結果表明，當加入醇時磷酸緩沖液確實變成乳狀的。此外，進行胰蛋白酶檢測(見附錄)以測定與醇混合后酶是否穩定。在配制后0、1.5、3、4.5和6小時時測定酶活性。結果表明，與僅含磷酸鈉緩沖液的制劑相比，在各時間點上，含有20％磷酸鈉緩沖液和80％PEG2000，以及20％磷酸鈉緩沖液和80％乙醇的制劑中所測得的酶活性類似。這些結果表明在含醇的制劑中其活性能夠保持。
方法10在此將敘述通過EHD噴霧胰島素的方法。
用三種不同的配方配制豬胰島素7. 0.5％的Emulphogen，5％的磷酸鈉(NaPO4)緩沖液，30％的甘油和64.5％的水8.0.2％的0.01M HCl，19.8％磷酸鈉緩沖液和80％的PEG 2009.20％的0.01M HCl和80％的PEG 200將100μl的各制劑噴入含2ml NaPO4緩沖液的35-mm的聚苯乙烯組織培養皿中。將浸沒于NaPO4緩沖液的鉑絲環用作地線。噴霧后，用移液管將胰島素/NaPO4溶液轉移出培養皿而用ELISA方法檢測胰島素。
結果
由此發現胰島素可以配制在三種不同的可噴霧的制劑中。噴霧后的胰島素活性用ELISA法測定。
因此，胰蛋白酶、過氧化物酶和胰島素可以在多種制劑中采用EHD釋藥。
其它方法用EHD噴霧表面活性蛋白質的實驗也已進行。肺表面活性物質在降低肺泡上皮內表面的表面張力，防止氣體交換過程中的肺泡塌陷中起著重要作用。這些蛋白的失活或缺乏與呼吸道疾病如呼吸窘迫綜合征(RDS)有關。RDS仍然是新生兒死亡率的最常見病因。將外源性表面活性物質給予患RDS的新生兒成為明確的治療手段。
花粉粒/塵螨引發的過敏反應，以及由呼吸道合胞體病毒(RSV)導致的肺感染是世界性的嚴重問題。迄今為止，還無法獲得用于預防或治療這些疾病的安全和有效的藥物。有可靠證據表明肺表面活性物質(SPs)，如SP-A和SP-D，與先天性免疫力有關，其中它們結合并清除過敏原如花粉、隱藏塵螨的液滴以及病原體如病毒和真菌。
目前可獲得兩種主要類型的外源性表面活性蛋白—天然的和合成的。天然表面活性物質通過肺泡灌洗方法從動物或人獲得或者從羊水中獲得。它們的優點是具有調節表面張力的所有必須的功效成分；然而，它們的收集不定時而且花費昂貴。此外，它們有被感染性的病毒性因子污染的危險。在臨床上，天然表面活性物質比合成的具有更高的效力，可能是由于天然表面活性物質的蛋白含量所致。因此，開發了重組肺表面活性蛋白并且可以將這些敏感分子傳遞至肺部以預防和治療呼吸道疾病，例如支氣管哮喘，氣管炎和肺炎，并在肺移植中增強免疫防御力。
目前用于將蛋白質傳遞到，例如小鼠的肺部的方法是一種侵入技術-氣管內滴注。在這種方法中，將皮下注射針頭插入小鼠氣管內，通過該針頭將蛋白質傳遞到肺部。將皮下注射針頭插入氣管容易造成周圍組織損傷，這可能引起小鼠不必要的免疫反應。此外，通過氣管內滴注傳遞的蛋白質溶液并非是以液滴，而可能是以聚集的形式給藥的。因此，蛋白質不大可能到達下呼吸道。
另一種傳遞蛋白質的途徑是通過液體滴管，通過它將蛋白質經鼻腔內傳遞給動物如小鼠。與氣管內滴注類似，這種給藥方法的顯著缺陷是不能精確地傳遞蛋白質并由此導致蛋白質的無效傳遞。
與氣管內滴注相反，EHD能夠將物質溫和地傳遞到小鼠和人的肺部，而不損傷沿著呼吸道的組織。EHD還能夠精確傳遞物質，因為可以準確控制電溶膠的大小并且能夠根據液滴的質量和大小調整肺部的最佳沉降區。例如EHD可以用于，如圖5所示，產生單分散性液滴噴霧，其中所有液滴具有基本相同的直徑，其液滴直徑對于人是在1.0-10微米范圍內而對于小動物則成比例縮小。EHD除了能夠使所得液滴帶電外，如上述至少部分專利和公開的申請書所述的放電或部分放電以及保持少量電荷可能是有利的，特別是對于沉降于氣管末端和肺泡而言。
EHD噴霧表面活性蛋白質的實施例采用WO 99/07478公開的裝置用EHD噴霧的重組SP-D(rSP-D)蛋白用三種配方(a)，(i)和(j)配制。另一個電極為接地電位。配方細節和所獲最大流速為
檢測這三種制劑(a)、(i)和(j)對未噴霧的SP-D分子的影響。將重組SP-D加入到每個樣品中并分析各制劑的試驗活性，與對照樣品，Eagan 4A比較。表示各混合物活性的曲線圖如圖23所示。制劑(a)、(i)和(j)中的rSP-D的活性僅有輕微減少。然而，制劑(i)中的SP-D不產生正信號(positive signal)。尚未證實實際是甘油使rSP-D變性還是僅僅是分析機理的干擾。
rSP-D含水制劑在上述含水PVA和表面活性物質制劑的成功的基礎上，以3％PVA(100k分子量)、0.1％吐溫20和96.9％的PBS配制0.1mg/ml的rSP-D。該制劑以1ml/hr的流速噴霧。以簡單的點對面(simple point-to-plane)(噴嘴到收集面)實驗進行噴霧，采用類似于圖1所示裝置，但沒有第二電極并采用輸液管或無中心葉片的Delrin尖頭噴嘴。采用接地鉑絲環將噴霧液收集于培養皿中。這種點到面間的距離為20mm。采用1ml注射器和IV管，在各制劑重復進行兩次后，在使無效空間(Dead space)最小的條件下保存樣品。進行生物測定以確定蛋白質是否保持全部活性，或在EHD處理的剪切力下變性。結果表明未見由EHD噴霧引起的對rSP-D的不良影響。
在體外，EHD噴霧SP-A和SP-D也已經達到接近單分散性噴霧或形成云霧狀并且沒有變性。通過采用如WO94/12285(其全文通過參考結合于本說明書中)所述的雙噴嘴EHD裝置還已經實現對液滴電荷的控制。
上述實驗已經表明敏感材料如生物材料，例如DNA、蛋白質和酶，可以被電場流體動力學粉碎而不導致電場引起的變性，因為待噴霧制劑的液體載體或溶媒比常規EHD制劑的傳導率高(即具有小于10000Ohm.m或更優選1000Ohm.m的電阻率)。這種特別高的導電性有助于排斥外加電場并因此保護其免受電場所致的變性。此外，在EHD處理期間發生的剪切力也極度減小。目前的知識是，為大體積液體和霧化電溶膠之間的電場誘導轉變區域的EHD錐體是電場建立起來的以環狀旋渦流動的高速湍流(Hayati I，倫敦皇家學院1985年博士論文(1985-Ph.D，Thesis，Imperial College London))。然而，湍流的量與導電性及液體粘度以及霧化區或點的物理尺寸有關。本文所述的導電性制劑使得所存在的對液體的剪切力顯著降低，而這可以進一步減少不斷增高的粘度或縮小的EHD錐體的基礎直徑。總體上，我們計算出EHD處理期間實驗所用液體的剪切力，其值與氣體噴嘴及超聲霧化器噴出相同大小的液滴相比降低約1000倍。
如上文所述，上述方法可以用EHD分配裝置實施例如圖1或2所示的裝置實施。這些EHD裝置可以，此將在后文敘述，結合到吸入裝置中而使之能夠控制周圍的環境條件。
圖12圖解說明了適合使小的實驗動物如小鼠易于吸入液滴的吸入裝置的一個實例。
泵101驅動空氣以恒定速率通過吸入裝置。空氣從泵流過空氣調節器102進入EHD霧化裝置或單元103。然后空氣和霧化物流入吸氣室104，室內放置小動物，通常為小鼠，以呼吸霧狀液滴。廢氣通過過濾器105排入大氣。
在此實施例中，設計空氣調節器102以清除所進入空氣中的蒸氣。
圖16表示一種可行的空氣調節器102的剖面圖，它包括用干燥硅膠111填充的U形管110。氣流通過U形管入氣口120被強制通過U形管中填充的硅膠111并通過排氣口113排出。通過橡膠或其它合適材料制成的彈性塞子114的方法使得入氣口和排氣口都被加固并具有氣密性。在空氣進入EHD霧化器103之前通過這種方法將所進入的空氣中的濕氣清除。這樣增強液滴的蒸發，使之能夠產生更小的液滴。對于本領域內技術人員而言顯然可以將其它材料放入U形管以清除氣體和蒸氣以幫助減小液滴大小。
圖19和20表示兩種可供選擇的適合用作氣體調節器102以清除氣體中蒸氣的冷阱。在圖19中金屬桿311插入吸氣箱104的內外室之間。將這根桿浸入盛于燒杯331中的液氮321或其它極冷液體或固體中，由此使這根桿變得非常冷。這根桿伸入吸氣箱中的部分將凝結出任何蒸氣，并通過簡單的蒸氣擴散而顯著降低整個吸氣箱中的蒸氣濃度。圖20表示另一種以類似家用冰箱的方式運行的冷阱。在此用壓縮機411將合適的制冷劑如氟利昂12(二氯二氟甲烷)泵入金屬管401周圍。使氟利昂12在通過閥431后能夠膨脹而顯著降低其溫度并冷卻金屬管。這種吸入裝置如果與合適的監控裝置(未表示)接合則可以在實驗過程中自動調節以保持特定的蒸氣濃度。其它合適的冷阱對于本領域內技術人員來說是顯而易見的。
圖15表示用于圖12所示吸入裝置的適合于小鼠的吸氣室104的實例。組成該室的箱體200由有機玻璃制成，它具有對稱安裝于密封外室202(隔離與過濾器105連通的廢氣)的具孔眼的內室201。EHD霧化器或裝置103安裝于盒蓋中央以將霧化物導入具有孔眼的內室201。該吸氣室104可以具有環境調節器以調節和控制EHD霧化器103所產生的液滴的蒸發和吸收進而促進液滴蒸發而使液滴大小容易被減小。此環境調節裝置可以通過在內外室201和202之間的間隙中放置吸收材料，如硅膠或活性炭來提供，以便從吸氣室中吸收任何不需要的蒸氣，由此促進EHD霧化器產生的液滴的表面蒸發而降低它們的大小。
圖18表示在吸氣室中加入150g硅膠如何能夠在長時間里基本改變吸氣室104的濕度。在此情況下將20％體積的水、80％體積的乙醇混合物按2.4μl/s的速度噴入箱內。曲線圖清楚表明硅膠的存在確保了箱內相對濕度在整個實驗期間不會升高到比40％高很多。當然，應當指出，該實驗是在箱內沒有動物的條件下進行的。它們的呼吸產生大量的水蒸氣，并因為如此可以將如圖19和20所示的冷阱引入內外室之間以清除水蒸氣以及來源于吸氣室104內氣體的其它蒸氣。
對這種吸入裝置來說，典型氣體流速可以從0變化至60L/min及更高，但優選盡可能低，同時保持吸氣室內合適的氧氣水平。在一項實驗中，將10只小鼠放入吸氣室104中，泵被設置成提供流速41/min(升/分鐘)的氣體而EHD霧化器103被設置成以流速2.4μl/s噴霧DNA濃度為1mg/ml的上文方法2的所述制劑。在2小時中用EHD霧化器103使17.3mg DNA霧化，約6μg保留在小鼠肺中。
這種吸入裝置提供了一種控制液滴直徑和電荷使之準確降低到適合小鼠的大小(例如1-3μm及以下)的方法。因此這種吸入裝置能夠產生小鼠和類似的小實驗動物可以呼吸的氣溶膠，否則這些小實驗動物(作為所有人體呼吸療法的必需預先進行的步驟)由于其解剖構造小以及非順從性呼吸將很難使對動物例如小鼠(由于其解剖結構上的基本差異使其對于吸入的要求與人有極大差異)的活體毒性和治療活性的檢測順利進行。
將吸氣室用于氣溶膠的強制性呼吸是熟知的。然而，從動物實際吸入的產物量與釋放量的比較來看，常規吸入裝置是無效率的。例如，氣體噴射霧化器產生1μm的液滴，該直徑適合于小鼠吸入，其氣體流通量必須達約6-8L/min(升/分鐘)。結果，難以在空氣中形成很高濃度的氣溶膠，因為它被在產生氣霧的第一地點的氣體不斷稀釋。相反，在上述吸入裝置中，EHD霧化器103產生液滴并且僅需相對少量的空氣流(＜1L/min)，以維持吸氣室104中的氧氣濃度。這意味著電溶膠濃縮了一個數量級，因此該吸入裝置的效率比常規氣體噴霧器高出一個數量級。使用超聲霧化器同樣不需要氣流。然而，它們還是使敏感生物材料變性；它們不能用于粘性液體(例如DNA濃縮液)；并且當形成約1μm的液滴時它們易于阻塞。
圖13表示設計用于大動物和人的吸入裝置的示意圖。在這種吸入裝置中，吸氣室104被代之以中間室106以及如圖所示的面罩107，它能夠裝到大動物例如人的口和鼻上(例如如圖3所示)或者是管嘴(mouthpiece)或氣管內插管。面罩可以是任何標準吸氣面罩例如可以從Medic Aid，Bognor Regis，UK獲得的，產品標準為1100 Syetem22的面罩。中間室106可以以圖15所示的吸氣室104為基礎并可以裝備調節器以在傳遞至管嘴或面罩107之前調節和控制EHD霧化器103所產生的液滴的蒸發和吸收。
圖14表示設計用于人的吸入裝置實例圖。在此情況下下，EHD霧化器、中間室和面罩被單一的EHD吸入裝置108所代替，如WO99/07478中所述。應當指出這種吸入裝置能夠在沒有泵101或空氣調節器102下理想地工作，盡管如上文所述采用空氣調節器可能具有能夠使液滴大小減小的優點。
如上文所述設置空氣調節器102也可能是吸氣或中間室104或106以清除室內空氣中的蒸氣而促使液滴表面蒸發以減小液滴大小。然而，有時在進行EHD處理的環境中或其附近的環境中可能需要增加氣體中的溶劑或揮發性成分的蒸氣壓。例如可以升高溶劑蒸氣壓而阻止蒸發，例如，減慢或阻止流出EHD霧化器103出口的液體凝固。這對于含有聚合物的液體制劑特別有用，因為它能夠防止凝固并因此能夠使更高濃度的聚合物比在相反情況下更有可能形成液滴。
圖17表示氣泡室剖面圖，它可以結合到空氣調節器102(和/或吸氣室或中間室)中并且可以用于升高液體制劑所用的任何溶劑的蒸氣分壓，例如使進入EHD霧化器103的空氣飽和。參照圖17，空氣通過入口115被泵入并且通過裝在容器117中的液體116形成氣泡。然后通過出口118排出氣體。進出口均固定在橡膠或其它合適材料制成的氣密性塞子119上。實驗表明采用這種含溫水作為液體116的氣泡室可以防止含有聚合物的含水制劑干燥并形成固體產物。
如圖15所示，當EHD霧化器103插入吸氣或中間室時，則可以在該室內安裝控制氣體濕度的空氣調節器102而不是在EHD霧化器103內安裝或在該霧化器內再安裝空氣調節器，因而不需要獨立的調節器。
如上文所述可以通過控制液滴形成處的環境(如上文所述通過采用空氣調節器和/或控制吸氣或過渡室104或106的環境)而控制EHD霧化器103所形成的液滴直徑。因此通過減小環境中的水(或揮發性組分)的蒸氣分壓而促進液滴中的水(或揮發性組分如制劑中的溶劑，如乙醇)的蒸發可以減小液滴大小。因此如上文所述使環境氣體干燥以降低其濕度將增加液滴的水分蒸發并由此降低其大小。相反，升高濕度(例如采用如圖17所示的氣泡室)或升高制劑的揮發性組分的蒸氣分壓將阻礙蒸發并因此妨礙液滴大小的降低。此外，當液體制劑含有吸濕性物質時，液滴也可以在飄飛期間吸收水分并增大直徑。
圖21和22分別表示圖1和2所示的EHD裝置中的調節方式。這些裝置1b和1c與圖1和2所示的那些不同，其中裝配的第二液體貯庫50通過管51與環繞于液體輸出管9的管套(shroud)或環管(collar)52連結。液體貯庫50裝有補給溶劑，該溶劑以基本等同于容器52中溶劑的蒸發速度通過通向所述管套的管51來補充。在這個實例中容器52含有吸附性材料例如毛氈(felt)。應當理解，盡管輸液管9為固定容器52提供了便利處所，但容器52可以固定于第二室內5的任何便利之處。這種改進的EHD裝置可以單獨使用或作為上述任何吸入裝置中的EHD裝置103以增加第二室中的溶劑蒸氣壓并且可以代替入圖17所示的氣泡室，使空氣調節器可以省去。通常所述溶劑就是噴霧的液體制劑中使用的溶劑，例如乙醇。
也可能在需要清除蒸氣時采用管套或環管(無液體貯庫50)，它貯有合適的干燥劑(例如硅膠)以干燥第二室的氣體而促使液滴的溶劑蒸發進而減小它們的大小，也使之能夠在需要干燥環境空氣時省去空氣調節器。
在上述實例中EHD處理產生液滴。當液體制劑中含有聚合物時則聚合物可能是這樣的量，它使霧化不能發生，但卻形成可以斷裂成纖絲的連續纖維。通常這樣的制劑不能用于吸入目的(除非纖維斷裂成小纖絲)，但可以用于局部給藥到例如傷口表面或口腔內。在此情況下，圖21和22所示改進裝置可以用于控制從輸液管流出的液體的固化速度，以控制纖維形成過程而不是完全防止固化。
當液體制劑中含有聚合物，尤其是當它含有相對大量的聚合物時，通常不會產生典型的Taylor錐形，而是所流出的液體更有可能.在輸液管出口形成半球形或氣泡樣的形狀。本文所用術語錐形是指同時包括典型的Taylor錐形和這些形狀。
具體實施本發明的方法、設計和吸入裝置可以用于將生物材料、水溶性藥品或藥劑、疫苗及其它敏感分子傳遞到身體內或外表面包括肺、氣管、喉、口、鼻道、眼、皮膚及傷口表面。
附錄(A)胰蛋白酶檢測1 原理胰蛋白酶BAEE+H2O →Na-苯甲酰基-L-精氨酸+乙醇(BAEE＝Na-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯)2條件溫度＝25℃，pH＝7.6，波長＝253nm3試劑3.1標準胰蛋白酶檢測(1)67mM磷酸鈉緩沖液，25℃下pH7.6(2)試劑(1)中的0.25mM Na-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)(3)1mM鹽酸(4)臨用前，以冷的試劑(3)制備含500BAEE單位/ml的胰蛋白酶溶液。
3.2噴霧前和后的胰蛋白酶檢測(1)空白溶液(a)將1ml 67mM的磷酸鈉與4ml PEG200混合(b)將100μl的(5a)轉移到2ml 67mM的磷酸鈉中(c)將900μl的(5b)轉移到100l 10mM的鹽酸中(1)噴霧前溶液(等于1070 BAEE單位/ml胰蛋白酶)；(a)將1ml胰蛋白酶(12480單位/ml)的67mM的磷酸鈉溶液與4ml PEG200混合(b)將100μl的(6a)轉移到2ml 67mM的磷酸鈉中(c)將900μl的(6b)轉移到100l 10mM的鹽酸中
(1)后噴霧溶液(a)通過12kV噴嘴將100μl的(6a)以1.5μl/秒的流速噴霧到2ml 67mM的磷酸鈉中(b)將900μl的(7a)轉移到100μl 10mM的鹽酸中4操作4.1標準胰蛋白酶檢測空白1.5ml試劑(2)+100μL試劑(3)試驗1.5ml試劑(2)+100μL試劑(4)4.2噴霧前和后的胰蛋白酶檢測空白1.5ml試劑(2)+100μL試劑(5c)噴霧前1.5ml試劑(2)+100μL試劑(6b)噴霧后1.5ml試劑(2)+100μL試劑(7b)由于可以利用微量比色杯，所述反應混合物的終體積可以減少到1.6ml。反應混合物的終濃度保持不變的有0.2344mM BAEE緩沖液，62.8125mM磷酸鈉緩沖液和0.0625mM HCl。
5單位定義以BAEE為底物，在25℃下pH7.6的3.2ml反應體積中，一個BAEE單位每分鐘能夠產生0.001的ΔA253nm。
6計算BAEE單位/ml胰蛋白酶＝ΔA253nm/(0.001)(0.2)0.001＝在25℃下的pH7.6的3.2ml反應混合物中一個單位胰蛋白酶的變化/分鐘值。
0.2＝所用的胰蛋白酶體積(ml)(B)過氧化物酶測定1 原理過氧化物酶ABTS+H2O2 氧化的ABTS+2H2O
(線綠)(深綠)(ABTS＝2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并三唑啉-6磺酸))2條件溫度＝25℃，pH＝5.0，波長＝405nm3試劑3.1標準過氧化物酶測定(1)100mM磷酸鉀緩沖液，25℃下pH5.0[試劑(1)](2)試劑(1)中的9.1mM ABTS底物溶液，新鮮配制(3)過氧化物酶稀釋液(含0.25％(W/V)牛血清白蛋白和0.5％(v/v)Triton X-100的40mM磷酸鉀緩沖液，25℃下pH6.8)(4)過氧化物酶溶液。
(臨用前即刻配制，以冷的試劑(3)配制含0.5單位/ml的過氧化物酶溶液)(5)0.3％(w/w)過氧化氫溶液。
3.2噴霧前和后的過氧化物酶測定(6)空白溶液(a)將100μl的20％過氧化物酶稀釋液80％PEG200加入到2ml過氧化物酶稀釋液中(7)噴霧前溶液(a)將1ml過氧化物酶(12單位/ml)加入到20％過氧化物酶稀釋液80％PEG200中(b)將100μl的7(a)加入到20％過氧化物酶稀釋液80％PEG200(0.57單位/ml)中。
(8)后噴霧溶液(a)通過11.9kV噴嘴將100μl的(7a)以1μl/秒的流速噴霧到2ml過氧化物酶稀釋液中
4操作4.1標準過氧化物酶測定空白2.9ml試劑2(ABTS)+50μl試劑3(過氧化物酶稀釋液)+100μl試劑5(H2O2)檢測2.9ml試劑2(ABTS)+50μl試劑4(過氧化物酶溶液)+100μl試劑5(H2O2)通過倒置立即混合并記錄100秒內A450nm的增加。
4.2噴霧前和后的胰蛋白酶測定空白 2.9ml試劑(2)+50μl試劑(6a)+100μl試劑5(H2O2)噴霧前2.9ml試劑(2)+50μl試劑(7b)+100μl試劑5(H2O2)噴霧后2.9ml試劑(2)+50μl試劑(8a)+100μl試劑5(H2O2)通過倒置立即混合并記錄100秒內A450nm的增加。
5單位定義在25℃ pH5.0下，一個單位每分鐘氧化1.0μmole的ABTS6最終測定濃度在3.05ml的反應混合物中，最終濃度為96mM磷酸鉀8.7mM ABTS0.01％(w/w)過氧化氫0.004％(w/v)牛血清白蛋白0.008％(v/v)Triton X-1007計算單位/ml過氧化氫酶＝(ΔA405nm)(3.05)/(36.8)(0.05)3.05＝測定液總體積(ml)36.8＝405nm處氧化的ABTS的微摩爾消光系數0.05＝所用過氧化氫酶的體積(ml)
權利要求
1.一種傳遞生物材料的方法，該方法包括提供一種含生物材料的液體制劑，將該液體制劑輸送到一個出口并使從該出口流出的液體進入電場，由此導致該液體的電場流體動力學處理而不使該生物材料變性。
2.一種傳遞生物材料的方法，該方法包括提供一種含生物材料的液體制劑，將該液體制劑輸送到一個出口并使從該出口流出的液體進入足以導致液體霧化而產生含生物材料的液滴的電場而不使該生物材料變性。
3.一種根據權利要求1或2的方法，它包括通過從含有在醇中不變性的生物材料的制劑中去除鹽類來提供液體制劑，然后在該液體制劑被輸送到出口之前將一種醇加入到該制劑中。
4.一種根據權利要求3的方法，它進一步包括在將所述液體制劑輸送到出口之前向該液體制劑中加入一種酸。
5.一種根據權利要求4的方法，其中的酸是乙酸。
6.一種根據權利要求3、4或5的方法，其中的醇是乙醇或聚乙二醇。
7.一種根據權利要求1或2的方法，它包括在液體制劑被輸送到出口之前，通過向含生物材料的制劑中加入表面活性物質來提供液體制劑。
8.一種根據權利要求1或2的方法，它包括在液體制劑被輸送到出口之前，通過向含生物材料的制劑中加入聚合物來提供液體制劑。
9.一種根據權利要求1或2的方法，它包括通過向含生物材料的制劑中加入表面活性物質和聚合物來提供液體制劑，然后將所述液體制劑輸送到出口。
10.一種通過處理相對高的傳導率液體例如含有生物材料的含水制劑來傳遞生物材料的方法，該方法包括在所述液體中加入聚合物，然后將含聚合物的液體輸送到出口，并使含聚合物的液體從出口流向足以形成錐形射流的電場。
11.一種根據權利要求8、9或10的方法，其中的聚合物具有至少40000的分子量。
12.一種根據權利要求8至11中任何一項的方法，其中的聚合物選自PVA、PVP、聚透明質酸鹽、蔗聚糖和其它多糖如淀粉、纖維素和殼聚糖及其化學衍生物、Palaemon acid、改性膠原及其衍生物。
13.一種根據權利要求8至11中任何一項的方法，它包括加入0.2g/10ml的分子量為360000的PVP作為聚合物。
14.一種根據權利要求8、9或10的方法，其中所加入的聚合物是濃度范圍為0.1-0.6g/10ml的分子量為360000的PVP。
15.一種根據權利要求8、9或10的方法，其中所加入的聚合物是制劑濃度范圍為0.1-0.7g/10ml的分子量為125000的PVA。
16.一種根據權利要求8、9或10的方法，其中所加入的聚合物是濃度為10mg/ml的分子量為125000的PVA。
17.一種根據權利要求10至16中任何一項的方法，它還包括向制劑中加入表面活性物質。
18.一種根據權利要求7、9或17的方法，它包括加入選自溴化二月桂基二甲基銨、苯扎氯銨、吐溫20、吐溫80和Brij 30的物質作為表面活性物質。
19.一種根據權利要求1和3至18中任何一項的方法，其中所述電場引起液體的霧化作用。
20.一種根據權利要求8至18中任何一項的方法，其中所加入的聚合物的量是使從出口流向電場的含聚合物的液體能夠導致纖維或纖絲的形成。
21.一種根據權利要求1至20中任何一項的方法，其中所述液體含有選自DNA、DNA片段、質粒、RNA、蛋白質、肽、激素、脂、酶和細胞因子的生物材料。
22.一種能夠用電場流體動力學處理含有生物材料的含水制劑的方法，該方法包括從含水制劑中去除鹽類，然后將醇和酸加入所述制劑中，再使液體從出口流向足以導致錐形射流形成的電場。
23.一種根據權利要求22的方法，它包括加入至少乙醇和聚乙二醇一種作為醇。
24.一種根據權利要求22或23的方法，它包括加入乙酸作為酸。
25.一種根據權利要求21、22或23的方法，其中加入醇的步驟包括加入醇以提供醇體積占70％、80％或最多可至90％的制劑。
26.一種根據權利要求21至25中任何一項的方法，它包括在加酸步驟中加入0.2至1mM的酸。
27.一種根據權利要求22至26中任何一項的方法，其中所述生物材料由DNA、DNA片段、質粒、RNA、蛋白質、肽、激素、脂、酶和細胞素因子中的至少一種組成。
28.一種能夠用電場流體動力學處理含有至少一種DNA、DNA片段和質粒的含水制劑的方法，該方法包括從含水制劑中去除鹽類，然后將乙醇和乙酸加入所述制劑中，再使液體從出口流向足以導致錐形射流形成的電場。
29.一種根據權利要求28的方法，它包括加入乙醇以便提供乙醇體積最高可達90％的制劑。
30.一種根據權利要求28的方法，它包括加入乙醇以便提供乙醇體積約占70％或80％的制劑。
31.一種根據權利要求28、29或30的方法，它包括加入0.2至1mM的乙酸。
32.一種能夠用電場流體動力學處理相對高的傳導率的液體如含水制劑的方法，該方法包括將表面活性物質加入該液體中，以使所述液體的表面活性物質濃度顯著大于臨界膠束濃度，然后使液體從出口流向足以導致錐形射流形成的電場。
33.一種處理相對高的傳導率的液體如含水制劑的方法，該方法包括將表面活性物質加入該液體中以使表面活性物質濃度顯著大于臨界膠束濃度，然后將這種含表面活性物質的液體輸送到出口并使含表面活性物質的液體從出口流向足以導致錐形射流形成的電場。
34.一種根據權利要求32或33的方法，它包括加入選自溴化二癸基二甲基銨、苯扎氯銨、吐溫20、吐溫80和Brij 30的物質作為表面活性物質。
35.一種根據權利要求32或33的方法，它包括加入約0.5％質量的溴化二月桂基二甲基銨作為表面活性物質。
36.一種根據權利要求32或33的方法，它包括加入0.1％質量的苯扎氯銨水溶液作為表面活性物質。
37.一種根據權利要求32或33的方法，它包括加入0.8％質量的吐溫20水溶液作為表面活性物質。
38.一種根據權利要求32至37中任何一項的方法，其中所述液體含有生物材料例如至少一種DNA、DNA片段、質粒、RNA、蛋白質、肽、激素、脂、酶和細胞因子。
39.一種根據權利要求22至38中任何一項的方法，該方法包括向所述制劑中加入螯合劑或過氧化氫酶。
40.一種根據權利要求22至39中任何一項的方法，其中所述電場引起液體的霧化作用。
41.一種通過電場流體動力學處理含生物材料的液體制劑的傳遞生物材料的方法，它包括在電場流體動力學處理之前使所述生物材料與PEG結合。
42.一種根據權利要求22至41中任何一項的方法，其中所述液體含有選自至少一種DNA、DNA片段、質粒、RNA、蛋白質、肽、激素、脂、酶和細胞因子的生物材料。
43.根據上述權利要求中任何一項的方法，該方法包括控制液體從出口所流入的環境中的液體制劑中的溶劑的蒸氣壓。
44.一種處理液體的方法，它包括將液體輸送至出口，使液體從出口流向電場以形成至少一種纖維、纖絲或液滴并控制液體流入的環境中的液體組分的蒸氣分壓。
45.一種處理含水液體制劑的方法，它包括將液體輸送至出口，使液體從出口流向電場，以引起液體霧化而產生霧化物，并控制至少出口附近的濕度以控制霧化物的大小。
46.一種處理含水液體制劑的方法，它包括將液體輸送至出口，以使液體流入空氣中，使液體從出口流向電場以引起液體霧化而產生液滴，并干燥液體所流入的環境中或至少是出口附近的空氣以導致液體蒸發而減小液滴的大小。
47.一種處理包括至少一種聚合物和至少一種揮發性組分的液體的方法，它包括將液體輸送至出口，使液體從出口流向電場以引起至少一種聚合物纖維和纖絲的形成，并控制所述液體或所述液體中的至少一種揮發性組分在液體所流入的環境中或至少在出口附近的蒸氣分壓以控制纖維或纖絲的形成。
48.一種根據權利要求43或47的方法，它包括將至少一種揮發性組分輸送到液體所流入的環境中或至少出口附近，以控制至少一種揮發性組分的蒸氣分壓。
49.一種根據權利要求48的方法，它包括提供一個用于供應揮發性組分的環繞出口的管套或環管。
50.一種根據權利要求49的方法，它包括將其它揮發性組分輸送到管套或環管中。
51.一種根據權利要求49或50的方法，其中所述管套或環管包含吸收材料。
52.一種含有生物材料的相對高的傳導率液體例如含水制劑的電場流體動力學處理方法，該方法包括將聚合物加入該液體中，然后使液體從出口流向足以引起錐形射流形成的電場。
53.一種處理含有生物材料的相對高的傳導率液體例如含水制劑的方法，該方法包括將聚合物加入該液體中，然后將含聚合物的液體輸送至出口并使含聚合物的液體從出口流向足以導致錐形射流形成的電場。
54.一種根據權利要求44至53中任何一項的方法，其中所述液體含有選自至少一種DNA、DNA片段、質粒、RNA、蛋白質、肽、激素、脂、酶和細胞因子的生物材料。
55.一種根據權利要求8、9或10至16中任何一項的方法，它包括使所述液體制劑流向負極性電場。
56.一種根據權利要求8、9或10至16中任何一項的方法，它包括將所述液體輸送到兩個液體出口并使液體從兩個不同的出口流向相反極性的電場。
57.一種根據權利要求1或2的方法，它包括使所述生物材料與聚乙二醇(PEG)結合。
58.一種實施權利要求1至57中任何一項的方法的分配裝置，該裝置具有液體制劑貯庫；與所述貯庫連接并具有液體出口的輸液管；以及使液體從液體出口流向電場以使從出口流出的液體形成錐形射流的電壓供給裝置。
59.一種分配裝置，該裝置具有一個外罩，其內含有液體制劑貯庫；與所述貯庫連接并具有液體出口的輸液管；使液體從液體出口流向電場以使從出口流出的液體形成錐形射流的電壓供給裝置；以及用于向外罩內部輸送溶劑或揮發性成分以增加它們的蒸氣分壓的輸送裝置。
60.一種根據權利要求59的裝置，其中所述輸送裝置包括環繞輸液管的環管或管套。
全文摘要
描述傳遞生物材料的方法，該方法包括提供含生物材料的液體配制步驟，將液體制劑輸送到出口并使液體從出口流向電場，以在生物材料不變性條件下引起對該液體的電場流體動力學處理。在一個實施例中，提供一種通過去除含有在醇中不變性的生物材料的液體制劑中的鹽的液體制劑，然后在該液體被傳遞到出口之前加入醇。可以在液體制劑被傳遞到出口之前將酸加入到液體制劑中。
文檔編號B05B5/00GK1431919SQ01810590
公開日2003年7月23日 申請日期2001年4月3日 優先權日2000年4月3日
發明者L·A·達維斯, D·N·達維斯, M·萬, R·A·科菲 申請人:巴特勒記憶研究所