熒光化合物的制作方法

專利名稱：熒光化合物的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及新穎的熒光化合物和涉及可用作熒光染料的化合物，從微生物分離這樣化合物的方法和這樣的化合物在科學應用中的用途。
采用合成熒光探針，通常使用配體以賦予要觀察的生物化學反應的特異性，并且所述熒光染料提供相互作用的檢測或定量化的措施。這些應用包括，其中，蛋白質的檢測(例如在凝膠或水溶液中)、細胞跟蹤、通過熒光標記的抗體的蛋白質檢測、酶活性的評價、核酸的染色。
由于它降低來自細胞自身熒光的干擾和降低熒光團與光結合的細胞毒性效果，長波吸光度通常增加熒光探針的效用。盡管激光器特別用作熒光激發用的集中光源，目前激光器的輸出局限于特定波長的光。激發光譜與激光器輸出一致的化合物因此具有高效用。氬激光器是最通常的熒光激發光源，并具有488nm和514nm的光的主要輸出。由這些波長任意激發的熒光化合物因此具有特定的效用。或者，可以使用固態光源如發光二極管達到熒光的激發。由從這些另外來源發射的光激發的熒光化合物也具有特定的效用。
紅熒光化合物廣泛用于生物研究的許多領域。許多這些物質，包括Texas紅，四甲基羅丹明-異硫氰酸酯或發射紅色的BODIPY染料要求用綠色波長如542nm的光激發。這限制它們在許多應用中的用途，特別是其中將氬離子激光器用于激發的那些。化合物如溴化乙錠，可采用來自氬離子激光器的光(520nm譜帶)激發，但一般不適于不是核酸的有機分子的標記。其它化合物如藻紅蛋白，可以使用氬離子激光器(488nm)激發并發出橙色/紅色波長的光。然而，藻紅蛋白具有差的穩定性和高分子量，使得它不適于許多應用如細胞跟蹤，核酸的標記或染色蛋白質。
對于蛋白質的染色，有許多可利用的方法。這些方法可采用非熒光化合物，或熒光化合物。最通常使用的方法采用考馬斯藍，它是非熒光的，可要求大量有機溶劑的使用，是耗時的。其它熒光基蛋白質檢測方法是可利用的，它們比非熒光方法可能更靈敏。然而，這些方法一般比非熒光方法更為昂貴，這限制了它們的廣泛應用。因此，結合有用光譜特性的化合物，和相對高靈敏度會具有特定的效用。
有幾種方法用于溶液中蛋白質的定量。這些方法基于廣泛的技術，和包括其中將染料結合到溶解蛋白質上的方法。這些染料可以是非熒光或熒光化合物。熒光染料基方法經常比非熒光染料更靈敏，并允許在寬濃度范圍的蛋白質濃度的測量。結合有用光譜特性和具有結合蛋白質能力的化合物會具有特定的效用。
在酶研究中，廣泛使用熒光化合物用于特定酶活性的檢測。例如，熒光素二-β-D-吡喃乳糖苷(FDG)是非熒光化合物熒光的。FDG化合物的分裂可以通過溶液中熒光的增加而監測，并因此允許酶活性的靈敏定量化。目前，僅有有限數目的熒光團適于此程序。因此，可以共軛到各種基材上的新穎的熒光化合物會具有效用。
對于雙顏色染色，有低分子量熒光團的非常有限的選擇。主要的綠色熒光團是熒光素，它強烈地吸收來自氬離子激光器488nm譜帶的光，并在518nm再發射。目前有較少的相容紅色或橙色熒光團，它們具有低分子量并由氬離子激光器的488nm或514nm譜帶激發。因此，由氬離子激光器激發和在大于600nm波長發射的低分子量化合物會具有效用，特別是如果有與熒光素的最小光譜重疊。
本發明人已經分離出衍生自真菌的新化合物，它能夠容易地與許多有機分子結合以產生熒光配合物。
優選，本發明的第一方面提供具有通式(Ia)的化合物 優選，根據通式Ia的化合物具有如通式(Ib)所示的立體化學 優選，R是選擇性地被羥基和氧代基團取代的直鏈或支鏈C1-20共軛烯基；R’是選擇性地被羥基取代的直鏈或支鏈C1-20烷基和R”是直鏈或支鏈C1-20烷基。
更優選，R＝-C(OH)CHC(O)(CH)6CH3，R’＝-CH2OH和R”＝Me使得根據第一和第二方面的本發明在于具有通式(Ic)的化合物 5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮 在第二方面，本發明在于一種根據通式(I)的化合物，其中每個R，R’和R”是氫原子，鹵素原子或選擇性地被一個或多個鹵素、羥基和/或氧代基團取代的直鏈或支鏈C1-20烷基，烯基或炔基；環A，B和C選擇性地被一個或多個鹵素原子取代；和環A，B和C選擇性地包括一個或多個雙鍵；
條件是(i)當R’＝-CH2OH，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a之間的雙鍵時，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(ii)當R’＝Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a之間的雙鍵時，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iii)當R＝Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iv)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(v)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)6Me；(vi)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)5Me；(vii)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)6Me；(viii)當R’＝-Ac，R”＝Me，C4＝C1，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(ix)當R’＝-Ac，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(x)當R’＝-Ac，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-(CH)2C(Me)CH-異丙基；(xi)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xii)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiii)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A，B和C不包括雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiv)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)6Me；(xv)當R’＝-C(CH2)Me，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xvi)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me。
優選，根據本發明第二方面的化合物是根據通式(Ia)和更優選，具有如通式(Ib)所示的立體化學。
甚至更優選，R＝-C(OH)CHC(O)(CH)6CH3，R’＝-CH2OH和R”＝Me使得根據第二方面的本發明在于具有通式(Ic)的化合物5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮。
可以理解的是根據通式(I)-(Ic)的化合物包括所有相應的互變體結構。
在化學上，通式(I)-(Ic)的化合物，如5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮，是阿扎非隆(azaphilone)族化合物的成員。阿扎非隆化合物由各種真菌產生，并已經研究它們的抗生素功能，它們抑制酶功能的能力，和它們在食品添加劑中作為著色劑的作用。
也已經在由單子囊孢子(Monascus spp)產生的顏料中發現阿扎非隆核。包含通常阿扎非隆核的顏料包括二氫紅曲霉素和紅曲紅色素。沒有它們作為熒光染料用于生物分子或有機化合物染色的效用的記錄。
申請人已知的現有技術中沒有教導或建議通式(I)-(Ic)中所述結構的化合物會是熒光的，也沒有建議它適用于生物分子或有機化合物的熒光染色。因此有與此化合物有關的不可預料和有利的性能，包括凝膠中蛋白質的靈敏檢測，細胞跟蹤和雙顏色染色。
本發明人已經不可預料地發現根據通式(I)-(Ic)的化合物在水溶液中不是熒光的，但能夠與有機化合物相互作用以產生強烈熒光的染色。在優選的實施方案中，根據本發明通式(I)-(Ic)的化合物用于有機分子的檢測和標記。
優選，根據通式(I)-(Ic)的化合物，當結合到一種有機分子上時，在藍色波長的光的激發之后發射熒光。更優選，根據通式(I)-(Ic)的化合物由吸收范圍300-560nm的光激發。
在優選的實施方案中，根據通式(I)-(Ic)的化合物與蛋白質相互作用以產生熒光配合物，該配合物可由標準UV透照器產生的光(307nm)激發。在激發時，熒光配合物在寬范圍波長內發射光，可以檢測到蛋白質配合物。蛋白質/染料配合物的激發波長包括與DNA配合的溴化乙錠的波長(吸收最大518nm，發射最大605nm)。由于它允許相同設備用于檢測DNA和凝膠中的蛋白質兩者，這有特定效用。寬范圍的激發波長使化合物強烈地由氬離子激光器的488nm和514nm譜帶激發，以及吸收從二極管光源發射的光如在約400nm發射的那些。
在另一個優選的實施方案中，根據通式(I)-(Ic)化合物的熒光形式能夠強烈吸收來自氬離子激光器488nm輸出的光，并在長于600nm的波長再發射光。
在另一個優選的實施方案中，根據通式(I)的化合物，與分析用載體一起包含在組合物中，并可以與熒光染料如在雙染色應用中的熒光素結合使用。這樣的熒光染料可包括在組合物中或單獨使用。
根據通式(I)-(Ic)的化合物可由真菌種產生。優選，真菌種是在澳大利亞政府分析實驗室(AGAL)，在1998年1月15日保藏的，由登記號NM98/00507識別的菌株。
先前沒有描述過新穎的熒光團5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮和相關化合物的精制，分離方法以及結構。
根據通式(I)-(Ic)化合物對有機分子的結合可包括直接化學或物理結合或可以通過使用本領域已知的“連接分子”而達到。可以由當用作熒光染料時的本發明化合物結合的有機分子包括，例如，蛋白質、肽、糖、核酸、抗體、細胞表面分子、洗滌劑和細胞。由于化合物具有熒光的和結合有機化合物的特性，可以理解所述化合物可用于許多應用，包括要求連接到有機化合物上的熒光染料的檢測。
在第三方面，本發明在于根據本發明第一和第二方面的化合物的生產方法，方法包括在一定的條件下培養真菌種使得真菌種產生所述化合物，和從培養物分離所述化合物。
當在粗培養物提取物中時或當通過萃取和分離技術精制時，根據通式(I)-(Ic)的化合物可用作熒光染料。
已經由本發明人發現在識別為AGAL登記號NM98/00507的菌株在生長介質上的接種和溫育之后，由真菌產生適于作為熒光染料的化合物。可以理解應當可以通過使用不是從合適真菌培養物的上清液的技術，產生根據本發明的第一和第二方面通式(I)-(Ic)的化合物。例如，如果真菌產生“前體”，然后可以通過化學，物理或酶措施將前體改性成它的熒光形式。這樣的化合物可以從微生物獲得的知識應當允許其它化合物或具有有用特性的相當不同化合物的發現和生產，其它化合物適于作為屬于相同族的熒光染料。也可以采用合成方式通過直接化學合成，或通過在由真菌使用的生物合成路途中的中間體的改性，生產根據通式(I)的化合物。
也可以采用合成方式通過化學措施生產本發明根據通式(I)-(Ic)的化合物。除在要求條件下培養真菌以外，新熒光化合物由真菌產生的知識可導致生產化合物的其它措施。
本發明根據通式(I)-(Ic)的化合物具有顯著的優點在于它以它的熒光形式結合到細胞和其它有機化分子上，使得當采用化合物標記細胞或其它有機分子時，可用作跟蹤細胞或其它有機分子的措施。
在第四方面，本發明在于根據本發明第一和第二方面的化合物作為熒光染料或標記物，優選在用于染色，標記和/或檢測有機分子的科學技術中的用途。
根據本發明第一和第二方面的化合物用途的例子包括，但不限于用于顯微術的細胞跟蹤染料、膜流動性染料、與抗體的共軛、對核酸的共軛、細胞表面配合體成象染料、對糖的共軛、細胞計數、和共焦顯微術。然而，可理解化合物會適于，其中要求在紅色波長中的熒光，包括當在48 8nm下激發時的任何用途。
在第五方面，本發明在于一種熒光標記有機化合物的方法，該方法包括使根據本發明第一或第二方面的化合物結合到一種有機化合物上，使得采用所述化合物熒光標記所述有機化合物。
優選，當曝露于寬范圍的波長，優選300-560nm的波長時，檢測到熒光標記的有機化合物。
所述有機化合物可包括，但不限于，蛋白質、肽、糖、核酸、抗體、細胞表面生物分子、洗滌劑和細胞。所述化合物可由于化學或物理締合直接結合到所述有機化合物上或可以通過連接分子結合到所述有機化合物上。如果將所述化合物連接到特異用于所述有機化合物的配體上，例如抗體或植物凝血素，然后配體對所述有機化合物的結合會引起熒光標記有機化合物。
在第六方面，本發明在于檢測包含有機化合物的樣品中的一種有機化合物的方法，該方法包括根據本發明第五方面的方法標記所述有機化合物，并通過監測或檢測它的熒光而檢測樣品中的所述有機化合物。優選，當將樣品曝露于來自寬范圍波長，優選300-560nm波長，更優選藍色波長的光時，檢測到標記的有機化合物。
通過本領域已知的任何措施進行標記的有機化合物的熒光監測或檢測。這樣的措施包括，但不限于，透照、光譜學、顯微術和細胞計量術。
在此整個說明書中，理解詞語“包括”，或其變化如“包含”或“含有”，暗示所述元素、整數或步驟、或元素、整數或步驟的組的包括，但不排除任何其它元素、整數或步驟、或元素、整數或步驟的組。
已經包括在本發明中的文獻、行為、材料、器件、文章等的討論僅用于提供本發明上下文的目的。當它在本申請每個權利要求的優先權日之前存在于澳大利亞時，不能認為任何或所有這些內容形成了現有技術的基礎部分或是關于本發明領域中的常規知識。
為更清楚地理解本發明，參考以下實施例和附圖描述優選的形式。
圖2顯示當結合到牛血清白蛋白(BSA)或結合到DNA上的安妥碘時，由

圖1識別的化合物的發射光譜的例子。用于結合到過量BSA上的精制化合物的摩爾數，等于用于結合到過量DNA上的安妥碘的摩爾數。有兩個激發譜帶，導致發射605nm的光。如所見，由390-400nm光的激發導致最大發射為605nm的光。
具體實施例方式
實施例1提取物A的生產獲得具有所有由AGAL登記號NM98/00507識別的菌株的識別特性的微生物的生物純培養物。
通過向1L水中加入40g蔗糖(CSR)，5g酵母提取物(Difco)，10g蛋白胨(Difco)制備用于真菌，AGAL登記號NM98/00507的生長介質。將混合物在115℃下高壓釜蒸煮15分鐘用于以下兩種目的將介質消毒和溶解瓊脂。將液體傾入培養盤中，并使其在室溫下凝固。在冷卻之后，將真菌的培養物在介質表面上接種，并于25℃溫育三天。將培養物轉移到冰箱中和在4℃溫育直到培養物轉變成深紅色和產生較高量的染料(通常3-5天)。
一旦培養物產生足夠用于收獲的染料，在一體積培養物介質對兩體積乙醇的比例下，將包括真菌生物量的培養物介質轉移到乙醇中。通過在4℃溫育和搖動16小時，將染料萃取入乙醇相。將液體相從殘余的培養介質潷析，并于4℃在3000轉/分鐘下離心10分鐘。
將澄清的提取物(提取物A)貯存待用，或根據在實施例2和3下描述的程序之一進一步精制。實施例2提取物A的精制以生產提取物B將根據實施例1中所述方法生產的提取物A的粗乙醇提取物在高真空下降低體積，使用甲醇作為溶劑在纖維素粉末上用色譜分析并施加到交聯葡聚糖LH-20柱上，也采用甲醇洗脫。在48小時內收集級份并收集靠近末端洗脫的紫色譜帶。將此級份冷凍干燥和在最小體積甲醇(0.1％乙酸)中再懸浮和貯存。實施例35，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮的精制將根據實施例2中所述方法生產的提取物B進行HPLC精制(Supelco C16-酰胺柱，在75％甲醇/水，0.05％乙酸，然后50％乙腈/水，0.05％乙酸中解析)。冷凍(-20℃)最終的級份以除去水并將剩余的乙腈在氮氣流下蒸發。
此程序生產分析純的，5，6-二氫-3-[(1 Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮，它是橙色固體。實施例45，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮的結構確定使用NMR光譜和高分辨率質譜的結合分析根據實施例3生產的化合物以確定5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮的結構。核磁共振光譜通過在CDCl3(0.5mL；99.96原子％，Aldrich)中溶解從實施例3獲得的HPLC精制化合物，并將它過濾入NMR管(PP527，Wilmald)，而制備NMR樣品。將樣品脫氣和在氮氣氣氛下平衡。
將NMR數據在Bruker DRX600(600MHz)NMR光譜儀上在27℃下獲得和使用xwinNMR(版本2.6；Bruker)處理。采用正交檢測運行所有的2D NMR試驗，1H光譜寬度為6009Hz和循環延遲為2s。將化學位移參比殘余的CHCl3(δH7.26ppm，δC77.01ppm)。高能1Hπ/2脈沖測量為9.5ms和低能(用于MLEV旋轉鎖定)在25.15ms。13C高能π/2脈沖是10.5ms和使用65ms的低能脈沖用于GARP去偶。使用100步驟正弦程序沿z軸釋放梯度脈沖。
使用32K真實點獲得1D試驗的數據和將零填充到64K和然后將Gaussian相乘用于分辨率增強。使用回聲/反回聲-TPPI梯度選擇，通過靈敏度增強的雙INEPT轉移達到碳-氫關聯(HSQC)(Palmer，A.G；III，Cavanagh，J.，和Wright，P.(1991))J.Magn.Reson.93，151-70；Schleucher，J.，Schwendinger，M.，Sattler，M.，和Schmidt，P.(1994)J.Biomol，NMR4，301-6；Kay，L.E.，Keifer，P.和Saarirnen，T.(1992)J.Am.Chem.Soc.114(26)，10663-5)。在采集期間采用去偶，采用1.3s循環延遲，在t2(128掃描每增量)收集2K數據點。在t1中，使用512增量(10-170ppm)和將INEPT程序優化用于145Hz的X-H去偶。使用80∶20.1的梯度比以選擇回聲/抗回聲-TPPI相靈敏度。
使用選擇性Gaussian脈沖在感興趣的質子上測量一個二維ROSEY光譜(Kessler，H.，H.Oschkinat，C.Griesinger & W.Bermel，(1986)J.Magn.Reson.70，106；Stonehouse，J.，P，Adell，J.Keeler & A.J.Shaka.(1994)J.Am.Chem.Soc.116，6037；Stokk，K.，J.Stonehouse，J.Keeler，T.L.Hwang & A.J.Shaka(1995)J.Am.Chem.Soc.117，4199 4200)。使用1000步驟Gaussian程序(60ms，64.6dB)以達到π/2脈沖。使用100ms的混合時間(13dB)用于連續波旋轉鎖定。采用15％梯度沿z軸達到梯度選擇。在6009Hz上積累10K暫態。將ROE增強測量為照射峰的百分比和不補償來自載體頻率的偏移。
使用由2ms低能量調整脈沖側翼的MLEV17(Bax，A.，& Davis，D.G.(1985)J.Magn.Reson.63(1)，207-13)脈沖順序，測量兩個二維同核Hartman-Hahn轉移譜(TOCSY)。在兩個二維的處理中使用正弦鐘轉移的(90°)變跡。
采用采集時間期間的無去偶和使用用于選擇的梯度脈沖(50∶30∶40.1)，獲得通過采用低通J-濾波器(145Hz)對于長范圍偶合(HMBC)用于抑制一譜帶關聯(Bax，A.，& M.F.Summers，(1986)J.Am.Chem.Soc.108，2093-2094)的異核零和雙量子相關性的2D1H-13C關聯。優化用于長范圍偶合進展的延遲用于在單獨試驗中20，10，5和2Hz的偶合。在F1中使用210ppm的光譜寬度并計算最終光譜大小以破壞相的信息。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ1.75，s，C9a-Me；1.84，dd，J 6.7，1.1Hz，C9’-Me；2.80，dd，J 17.2，3.6Hz，H5α；2.89，ddd，J 17.1，11.5，1.9Hz，H5β；3.85，dd，J 12.2，5.5Hz，C6CH2OH；3.97，dd，J 12.2，3.4Hz，C6CH2OH；4.39，m，H6；5.97，m，H9’；6.10，d，J 15.1Hz，H4’，6.19，ddd，J 15.1，10.6，1.6Hz，H8’；6.25，dd，J 14.6，11.2Hz，H6’；6.58，dd，J 14.5，10.5Hz，H7’；6.79，s，H2’；7.16，bs，H4，7.32，dd，J 15.2，11.2Hz，H5’；7.85，s，H8.
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ18.8，C9’-Me；28.0，C9a-Me；29.3，C5；63.4，C6-CH2OH；79.0，C6；86.2，C9a；101.0，C2’；112.2，C8a；113.4，C4；115.3，C3；126.5，C4’；128.6，C6’；131.7，C8’；136.0，C9’；140.9，C4a；142.0，C7’；142.6，C5’；159.0，C8；168.2，C2/C3a；177.7，C1’；185.0，C3’；190.0，C9.
使用異核單量子相關性(HSQC)以關聯和將所有質子分配到質子化的碳。此外，通過運行一系列采用8毫秒(msec)，20毫秒，100毫秒混合時間的總關聯光譜(TOSCY)試驗，表征每個自旋體系。最短的混合時間得到對于僅直接偶合質子的關聯而最長的混合時間識別整個自旋體系和得到關于非常小的長范圍偶合的信息，它有價值用于分配許多(顯然地)未偶合質子的位置。通過一系列一個二維選擇性旋轉框架關聯光譜(ROESY)試驗，達到整體空間連通性。由低能量Gaussian90度脈沖達到選擇性激發和使用梯度部分以僅觀察沒有TOCSY轉移的ROE。發現100毫秒的混合時間是最優的。發現采用20，50，100和250毫秒混合時間的長范圍異核多量子相關性(HMBC)對于分配所有的非質子化碳是必須的。甚至在此之后，發現C2不與任何質子關聯和與在168.2ppm的C3a一致。
根據光譜數據，幾個三環主鏈理論上是可能的，但一個(5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮)，確實地適合獲得的數據。質譜將根據實施例3生產的化合物進行高分辨率質譜分析以確定化合物的分子式為C23H22O7。
質譜(ESI，正離子)m/e 411(M+H+，55％)，317(5)，249(12)，163(10)，121(100)，93(4)。負離子ESI-FTICR測量值M-H+，409.1304，C23H21O7計算值409.1293；測量值247.0617，C13H12O5計算值247.0685。λ最大和ν最大λ最大(MEOH)432，555nm，ε10000，4000。λ最大(堿性MEOH)432nm，ε16000。λ最大(酸性MEOH)390，560nm，ε6000，10000。
ν最大(凈)3400(br)，2925，2854，1744，1712，1589，1259，1010cm-1。實施例5使用提取物A的蛋白質凝膠染色根據許多標準方案的任意一個制備蛋白質凝膠。例如，根據Laemmli的方案制備SDS頁凝膠(U.K.1970，自然，227680-685)。在完成電泳之后，將凝膠從電泳設備中取出。將凝膠固定在包含100mL染色溶液的容器中，染色溶液由90mL水，10mL甘油和5mL提取物A組成。采用輕微搖動將凝膠和染色溶液溫育90分鐘。在90分鐘染色程序之后，將溶液取出和將凝膠簡單地在水中洗滌三次。在這些簡單的洗滌之后，將凝膠放入100mL含10％甘油的水中，并采用搖動溫育另外30分鐘。
為顯現凝膠中的蛋白質，將凝膠轉移到UV透照器(307nm)中，和使用polaroid 667黑和白膜照相和設計過濾器組用于溴化乙錠凝膠的檢測(如，分子探針E-7591)。實施例6孢子形成的和植物細胞的表面熒光在一定條件下培養微生物以促進孢子形成并將提取物B用于進行在主要植物細胞培養物中孢子形成細胞的識別。例如，在包含10g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，和10g/L蛋白胨的水基肉湯中生長釀酒酵母。在30℃下的16小時溫育之后，將細胞通過離心收獲并在1mL水中再懸浮。將培養物的5μL等分試樣點在由5％乙酸鉀，2％瓊脂和水組成的半固體介質上。將培養物在22℃下溫育4天以允許酵母細胞的孢子形成。將孢子形成的培養物在水中再懸浮到1×109細胞每mL的密度，將5μL提取物B加入到1mL孢子形成的培養物中。為對比染色，將5μL的5(6)-羧基熒光素二乙酸酯(CFDA)的10mM溶液(在DMSO中)，加入到孢子形成的培養物中。在5分鐘之后，將孢子形成的培養物用離心方法收獲并在1mL水中再懸浮。在落射熒光顯微鏡(激發488nm)下的檢驗允許在孢子形成的和植物細胞之間的快速差異。
本領域技術人員可以理解的是，可以對如在具體實施方案中所示的本發明進行許多改變和/或改進，而不背離如廣泛描述的本發明精神或范圍。因此，在所有方面認為本實施方案為說明性的而不是限制性的。
權利要求
1.一種具有通式(I)的化合物，包括通式(I)的互變體， 其中每個R，R’和R”是氫原子，鹵素原子或選擇性地被一個或多個鹵素、羥基和/或氧代基團取代的直鏈或支鏈C1-20烷基，烯基或炔基；環A，B和C選擇性地包括一個或多個雙鍵；環B和C選擇性地被一個或多個鹵素原子取代；并且所述化合物能夠與一種有機化合物相互作用，并且當與該有機化合物相互作用時，所述化合物以在寬范圍波長的光的激發之后發出熒光。
2.權利要求1的化合物，其具有通式(Ia)的結構，包括它的互變體
3.權利要求2的化合物，其具有通式(Ib)所示的立體化學，包括它的互變體
4.權利要求1-3任意一項的化合物，包括它的互變體，其中R是選擇性地被羥基和氧代基團取代的直鏈或支鏈C1-20共軛烯基；R’是選擇性地被羥基取代的直鏈或支鏈C1-20烷基和R”是直鏈或支鏈C1-20烷基。
5.權利要求3的化合物，包括它的互變體，其中R是-C(OH)CHC(O)(CH)6CH3，R’是-CH2OH和R”是Me，為具有通式(Ic)的化合物5，6-二氫-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羥基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羥甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮
6.一種具有通式(I)的化合物，包括它的互變體， 其中每個R，R’和R”是氫原子，鹵素原子或選擇性地被一個或多個鹵素、羥基和/或氧代基團取代的直鏈或支鏈C1-20烷基，烯基或炔基；環A，B和C選擇性地被一個或多個鹵素原子取代；和環A，B和C選擇性地包括一個或多個雙鍵；條件是(i)當R’＝-CH2OH，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a之間的雙鍵時，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(ii)當R’＝Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a之間的雙鍵時，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iii)當R’＝Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iv)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(v)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)6Me；(vi)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)5Me；(vii)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)6Me；(viii)當R’＝-Ac，R”＝Me，C4＝C1，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(ix)當R’＝-Ac，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(x)當R’＝-Ac，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-(CH)2C(Me)CH-異丙基；(xi)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A包括在C3和C3a之間的雙鍵；環B包括在C4和C4a之間的雙鍵；和環C包括在C8和C8a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xii)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiii)當R’＝-正丙基，R”＝Me，環A，B和C不包括雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiv)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)6Me；(xv)當R’＝-C(CH2)Me，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me；(xvi)當R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，環A不包括雙鍵；環B和環C包括在C8a和C4a和C5和C6之間的雙鍵時，R≠-C(O)(CH)4Me。
7.權利要求6的化合物，其具有通式(Ia)的結構
8.權利要求7的化合物，其具有通式(Ib)所示的立體化學
9.權利要求1-8任意一項的化合物，其中當所述化合物與一種有機化合物相互作用時，在藍色波長的光的激發之后發射熒光。
10.權利要求9的化合物，其中當被范圍300-560nm的光激發時，所述化合物發射熒光。
11.權利要求10的化合物，其中所述有機化合物是蛋白質，并且當所述化合物與蛋白質相互作用時，在307nm光的激發之后發射熒光。
12.權利要求10的化合物，其中當被約400nm，488nm和514nm的光激發時，所述化合物發射熒光。
13.權利要求12的化合物，其中在488nm的光的激發之后，所述化合物發射約600nm的熒光。
14.一種組合物，該組合物包含權利要求1-13任意一項的化合物、分析用載體和選擇性地，一種熒光染料。
15.一種權利要求1-13任意一項的化合物的制備方法，包括在一定的條件下培養真菌種使得真菌種產生所述化合物，并從培養物中分離所述化合物。
16.權利要求1-13任意一項的化合物作為熒光染料或標記物的用途。
17.權利要求16的用途，用于染色、標記和/或檢測有機分子的技術中。
18.一種熒光標記有機化合物的方法，包括以一定的方式使權利要求1-13任意一項的化合物結合到有機化合物上，使得采用所述化合物熒光標記所述有機化合物。
19.權利要求1-14和16-18任意一項的化合物、方法、組合物或用途，其中所述有機化合物是蛋白質、肽、糖、核酸、細胞表面分子或洗滌劑，或包含在抗體或細胞中。
20.權利要求19的化合物、方法或用途，其中所述化合物通過連接分子結合到有機化合物上。
21.一種檢測包含在有機化合物的樣品中的一種有機化合物的方法，該方法包括根據權利要求18的方法標記所述有機化合物，并通過監測或檢測熒光檢測樣品中的所述有機化合物。
22.權利要求21的方法，其中當將所述樣品曝露于如下波長的光時檢測所述標記的有機化合物寬范圍波長，優選300-560nm的波長，更優選藍色波長。
23.權利要求21或22的方法，其中所述標記的有機化合物的熒光監測或檢測是采用透照、光譜、顯微術或細胞計量術。
全文摘要
本發明公開了通式(I)的熒光染料化合物。當它與一種有機化合物以一定的方式相互作用使得采用某些波長的光的激發后發射熒光時，這些化合物是有用的。當被結合到這些熒光染料化合物上時，熒光的檢測和/或監測提供了有機化合物的定量或檢測的措施。通式(I)，其中每個R，R’和R”是氫原子，鹵素原子或選擇性地被一個或多個鹵素、羥基和/或氧代基團取代的直鏈或支鏈C1－20烷基，烯基或炔基；環A，B和C選擇性地包括一個或多個雙鍵；環B和C選擇性地被一個或多個鹵素原子取代。
文檔編號C09K11/06GK1426415SQ01808529
公開日2003年6月25日 申請日期2001年4月26日 優先權日2000年4月26日
發明者菲利普·約翰·利文斯頓·貝爾, 彼得·卡魯索 申請人:福羅若技術有限公司