一種TRβ基因突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開一種TRβ基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液、酶溶液和外顯子特異性擴增引物，其中該試劑盒中設置有5管PCR反應液、1管酶混合液和20管1?10號外顯子特異性擴增引物母液。本實用新型給出的TRβ基因突變檢測試劑盒引物通過專業設計和多次篩選，保證了引物特異性，同時引入UNG酶防污染系統，能夠更加準確，穩定地對樣品進行監測。使用本實用新型的TRβ基因突變檢測方法利用特異性強，靈敏度高的擴增引物快速準確地檢測TRβ基因突變，具有檢測效率高，方法簡單，結果準確，成本低等特點。
【專利說明】
-種TRP基因突變檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本實用新型設及一種檢測試劑盒，特別是設及一種T祕基因突變檢測試劑盒，屬于 生物技術及醫學領域。
【背景技術】
[0002] 甲狀腺激素抵抗綜合征(RTH)是由于甲狀腺激素受體(TR)基因突變，導致祀器官 對甲狀腺激素(TH)的敏感性降低，使得TH對全身組織器官作用障礙的一種綜合征。目前認 為該病是一種常染色體顯性或隱性遺傳性疾病，有家族發病傾向，也有散發病例。根據突變 受體亞型不同，分為TRa基因突變致RTH(RTHa)和TRP基因突變致RTH(RT郵）。1967年 Ref etoff首次報道RT冊，目前全世界共報道3000多RT冊病例，RT地是一類罕見的內分泌疾 病，其中80%由T祕基因突變所致，W家族性發病多見，呈常染色體顯性或隱性遺傳。T祕基 因突變是確診RT地的金標準。
[0003] RT冊臨床表現呈高度異質性，主要由于T郎基因缺陷的嚴重程度及各祀器官對TH 的依賴性和反應性不同。依據抵抗程度的組織分布，可分為全身型RT冊、垂體型RT冊。臨床 可表現為甲亢（甲狀腺高代謝癥狀）或甲減（乏力、怕冷和記憶力減退等）或無明顯甲功異 常，或同時合并甲亢和甲減癥狀。臨床醫師易誤診為甲亢，予W抗甲狀腺激素藥物、放射性 艦治療或合用kT4治療，導致疾病癥狀加重，因此正確診斷很重要。
[0004] 目前臨床診斷RT冊主要通過kT3抑制實驗和TRH興奮試驗，但由于國內不生產k T3和T畑，從國外購買困難，導致該疾病長期W來無法診斷。
[0005] 金婷等W31歲女患為研究對象，該患者W甲狀腺腫就診，伴屯、慌、出汗和月經減少 等甲亢癥狀；同時有血脂異常等甲減癥狀。停賽治1個月后甲狀腺功能顯示FT3和Fl'4升高， 而T甜不適當升高。L-T3抑制試驗顯示垂體組織和外周組織均存在不同程度的ra抵抗。基因 序發現患者T祕基因出現M442T突變。診斷為全身型RT冊(T祕基因 M442T點突變的散發病 例）。2004年Bayer在國際上首次報道一個M442T突變家系，先證者表現為結節性甲狀腺腫和 房顫(非屯、臟病因），FT3和FT4升高，T甜正常高限。目前國際上僅1例M442巧良道，國內尚無該 突變位點的報道。T地的M442T突變導致其T3依賴性轉錄活性受損，同時突變的T祕干擾正常 T祕的功能，即顯性負效作用，運是M442T導致RT地發病的分子機制。
[0006] 綜上，建議臨床遇到血清FT3和Fl'4升高，而T甜正常或升高患者，或確診為甲亢后 抗甲藥治療甲狀腺功能一直不能恢復正常的患者，要警惕T祕基因突變，因此臨床迫切需要 一種檢測效率高，方法簡單，結果準確，成本低的T祕基因突變檢測試劑盒及檢測方法，用W 提高RT地的確診率。
【發明內容】
[0007] 本實用新型的目的就在于解決現有技術存在的上述問題，提供一種檢測效率高， 方法簡單，結果準確，成本低的T祕基因突變檢測試劑盒，用W提高RT地的確診率。
[000引本實用新型給出的技術方案是：一種T祕基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR 緩沖液、酶溶液和外顯子特異性擴增引物，其中該試劑盒中設置有5管PCR反應液、I管酶混 合液和20管1-10號外顯子特異性擴增引物母液。
[0009] 所述PCR緩沖液包括0.5mM的MgCh，0.5mM的dNTPs，其中 dNTPs表示dATP，dUTP， dGTP，dCTP。
[0010] 所述酶溶液為高保真化q酶和UNG酶。
[0011] 所述10對1-10號外顯子特異性擴增引物編號為沈Q ID NO: 1和沈Q ID N0:2、SEQ 10側：3和沈910側：4、56910側：5和沈910側：6、56910側：7和沈910側：8、56910 NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0012] 本實用新型還提供一種T祕基因突變檢測方法，包括W下步驟。
[0013] (1)制備本實用新型的T祕基因突變檢測試劑盒。
[0014] (2)提取待測樣品，進行PCR反應。
[001引 （3 )PCR產物純化測序，獲得T祕基因突變檢測結果。
[0016] 利用T祕基因 1-10號外顯子特異性擴增引物對待測樣品進行點突變檢測，包括。
[0017] 利用所述擴增引物和待測樣本建立PCR擴增反應體系和程序，獲得PCR產物，純化 后測序。
[001引所述PCR擴增反應體系如下。
[。0101
[0020]所述PCR擴增反應程序如下。
[0021]
[0022] 所述PCR產物純化處理所用試劑可W為市面上任何一款PCR產物純化試劑。
[0023] 所述PCR產物純化處理后測序，經過對測序圖譜的分析來確定T郎基因的突變與 否。
[0024] 與現有技術相比，本實用新型的有益效果是。
[0025] 本實用新型給出的運種T祕基因突變檢測試劑盒引物通過專業設計和多次篩選， 保證了引物特異性，同時引入UNG酶防污染系統，能夠更加準確，穩定地對樣品進行監巧M吏 用本實用新型檢測試劑盒的檢測方法具有檢測效率高，方法簡單，結果準確，成本低等特 點，因此本實用新型具有實質性的技術效果，便與推廣。
【附圖說明】
[0026] 圖1:T祕基因突變檢測試劑盒的結構示意圖。
[0027] 圖2:患者T祕基因第10外顯子部分測序圖，患者T祕基因第10外顯子的第442位密 碼子處存在點突變，密碼子由ATG改變為ACG，編碼的蛋白質由蛋氨酸變為蘇氨酸(M442T)。 進一步分析其基因測序圖，該突變為雜合子突變。患者父母的T祕基因未發現該突變。
[002引圖3.對實施例2的患者T祕全長外顯子1-10進行PCR擴增及測序，A:患者，B:患者父 親，C:患者母親，D:患者姐姐，測序結果顯示，患者第10號外顯子的第453位密碼子存在點突 變，密碼子從CCT突變為ACT,導致其所編碼的蛋白質由脯氨酸變為蘇氨酸。而患者父母和姐 姐均未發現該突變。
[0029] 圖中標記：1. PCR反應液，2.酶混合液，3 .外顯子特異性擴增引物母液，4.試劑盒， 5.試劑架。
【具體實施方式】
[0030] W下通過特定的具體實例說明本實用新型的實施方式，本領域技術人員可由本說 明書所掲露的內容輕易地了解本實用新型的其他優點與功效。本實用新型還可W通過另外 不同的【具體實施方式】加 W實施或應用，本說明書中的各項細節也可W基于不同觀點與應 用，在沒有背離本實用新型的精神下進行各種修飾或改變。
[0031] 在進一步描述本實用新型【具體實施方式】之前，應理解，本實用新型的保護范圍不 局限于下述特定的具體實施方案;還應當理解，本實用新型實施例中使用的術語是為了描 述特定的具體實施方案，而不是為了限制本實用新型的保護范圍；在本實用新型說明書和 權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"運個"包括復數形式。
[0032] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本實用新型另有說明，每個數值范圍的兩 個端點W及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本實用新型中使用的所 有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方 法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本實用新型的記載，還 可W使用與本實用新型實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方 法、設備和材料來實現本實用新型。
[0033] 除非另外說明，本實用新型中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技 術領域的常規技術。
[0034] 本實用新型實施例提供一種TRP基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液， 酶溶液，10對特異性擴增引物，其中10對特異性引物序列分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4、SEQ ID NO:5和沈Q ID NO:6、SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8、 沈Q ID N0:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID N0:20〇
[0035] 具體地，所述PCR緩沖液含有0.5mM的MgCb，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP， dUTP，dGTP，dCTP。
[0036] 具體地，所述10對特異性引物序列如表1所示。
[0037] 表110對特異性引物序列。
[00；3 引
[0039]
[0040] 優選地，本實用新型T祕基因突變檢測特異性引物針對T祕基因 1-10號外顯子設計 且通過多次篩選，保證了引物特異性。
[OOW 優選地，本實用新型實施例中的酶溶液中含有Taq酶，其為PCR反應所必需，且該酶 溶液還含有UNG酶，在PCR反應中，使用UNG酶可防非特異性PCR擴增污染。
[0042] 本實用新型還提供一種T地基因突變檢測方法，包括W下步驟(1)制備如權利要求 1-9中任一項所述的T祕基因突變檢測試劑盒；（2)取10只PCR管，分別向其中加入步驟（1)中 的PCR緩沖液、酶溶液；向所述10只PCR管中分別加入步驟(1)中的10對特異性引物；（3)提取 待測樣品DNA，分別加入至所述10只PCR管中，進行PCR反應。
[0043] 具體地，上述步驟(2)中的PCR緩沖液包括1.0-5. OmM的MgCb，1.0-5. OmM的dNTPs， 即 dATP，dUTP，dGTP，dCTP各1.0-5.OmM。
[0044] 優選地，WSOiil反應體系為例，向步驟(2)中加入待測樣品后得到的混合物中各組 分終濃度及含量如下。
[00451
[0046] 上述體系僅為例證性，在實際應用中可按照比例擴大或縮小該混合物體積及其中 各組分含量。
[0047] 具體地，在上述SOiil反應體系中，所述各對引物包括步驟（1)中的10對特異性引 物，所述樣品為基因組DNA。
[004引具體地，在步驟(3)中的PCR反應條件為。
[0049]
[0050] 在上述PCR反應后，對結果進行分析，所得結果可分為W下二種。
[0化1] (1)測序結果比對后與野生型一致，無突變。
[0052] (2)測序結果比對后出現突變，如圖2所示。
[0化3]實施例1。
[0054]制備本實用新型的T祕基因突變檢測試劑盒，包括W下步驟：
[005引1.引物合成:針對人類T地基因 1-10號外顯子序列設計并合成10對特異性引物，序 列分別為沈Q ID NO:巧P沈Q ID N0:2、SEQ ID N0:3和沈Q ID N0:4、SEQ ID N0:5和沈Q ID 側：6、569 10側：7和沈9 10側：8、569 10側：9和沈9 10顯：10、569 10側：11和沈9 10 NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0056]將上述各對引物分別配制成IOOiiM母液儲存。
[0057] 2.制備其他試劑：制備PCR緩沖液1，其中含有1. OmM MgCl2，dATP，加 TP，dGTP，dCTP 各1.0 mM;制備酶混合液2，其中含有Taq酶0.5 X l〇3u/ml，UNG酶O. I X l〇3u/ml。
[005引4.組裝試劑盒，見圖1。該試劑盒中包含5管PCR反應液1、1管酶混合液2和20管1-10 號外顯子特異性擴增引物母液3。根據PCR反應體系各成分使用量，計算12人份和24份兩種 規格成分使用量，配制試劑盒各種成分并組裝。
[0化9]實施例2。
[0060] 患者女性，12歲，2011年6月自覺頸部增粗，伴輕微手抖及多汗，就診于當地醫院， 甲功示FT3和FW升高及TS啡華低，甲狀腺超聲示雙側甲狀腺增大，伴多發結節，診斷為"甲狀 腺功能亢進癥"，予賽治15mg日一次口服。2011年10月復查甲功，示FT3、FT4及T甜均升高，予 賽治30mg日一次口服，頸部增粗加重，甲狀腺功能不能恢復正常。之后賽治間斷使用。2013 年5月為求進一步診治于我院就診，口診囑其停用賽治1個月后收入病房。
[0061] 體格檢查：身高 147cm，體重 41kg，BMI 18.97kg/m2。血壓 110/70 ~120/80mmHg，屯、 率90~110次/分，BMR25%(-15%-W%)。甲狀腺III度大，質初，無壓痛，無震顫及血管雜 音。四肢及關節無崎形，四肢肌張力V級，肌張力正常。無泌乳、肢端肥大和眼病癥狀。
[0062] 方法和結果。
[0063] 生化與物理檢查：入院時甲狀腺功能：血清FT3:14.25pmol/L(2.63-5.7pmol/L)， FT4:28.79pmol/L(9.01-19.05pmol/L)，T甜：21.12mIU/L(0.35-4.94mIU/L)，甲狀腺自身抗 體均陰性；垂體激素（GH、PRL、ACTH、F細及LH)均正常；血清糖蛋白激素 a亞單位（a-G洲） 0.3化g/ml (0.22-0.39ng/ml)，a-GSU/T甜比值0.15(<1)(表1);甲狀腺超聲：彌漫性甲狀腺 月中；甲狀腺1"3攝艦率：211:52.5%(正常范圍10%-32%)，2411:94.4%(正常范圍25%-62 % );雙耳電測聽及骨齡檢查均正常。
[0064] 基因測序：收集患者和其家人外周血，應用基因組DNA提取試劑盒(Qiagen),提取 出外周血基因組DNA，委托北京華大公司對T祕全長外顯子1-10進行PCR擴增及測序。引物序 列及擴增產物長度見圖3。測序結果顯示，患者第10號外顯子的第453位密碼子存在點突變， 密碼子從CCT突變為ACT,導致其所編碼的蛋白質由脯氨酸變為蘇氨酸。而患者父母和姐姐 均未發現該突變。
[0065] 垂體MRI:垂體MRI平掃可見垂體左外側有一6mm巧mm微腺瘤，造影劑增強后不被強 化;為了明確垂體微腺瘤是T細瘤還是意外瘤，經神經外科醫生共同診治，在征求患者及其 家屬同意下，對女童進行經蝶竇腺瘤切除術。腺瘤組織質軟，包膜完整。考慮到患者年齡和 垂體低功的風險，術者僅取出腺瘤組織，未切除周圍垂體組織。
[0066] 垂體病理組織免疫組化:手術標本經4%多聚甲醒固定，石蠟包埋切片，進行皿染 色;切片采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法，進行TSH-0亞單位、GH、PRL、ACTH、FW、LH 及HCG-a亞單位的免疫組化染色。結果：垂體腺瘤80-90 %細胞TSH-e亞單位、HCG-a亞單位染 色陽性(染色強度+~++)、40-50%細胞細、P化染色陽性(染色強度++~+++)、10-15%細胞 ACTH染色陽性(染色強度+~++)呈散在性分布。LH和FSH染色陰性。
[0067] 術后隨訪女患14個月，監測甲功和甲狀腺超聲，隨訪結果見表3。術后3個月，女患 自述月經來潮。術后4個月，女患身高增長5cm，監測細從0.47mIU/L升至13.70mIU/L，LH從 1.35mIU/mL 升至 3.46mIU/mL。
[0068] kT3抑制試驗：術后4個月，按照Refetoff等建立的標準進行kT3抑制試驗。患者 予W劑量逐漸遞增的1^-了3(50ug/d，lOOug/d，200ug/d)，每日劑量分兩次給藥(早、晚8點）， 各劑量給藥3天，在給藥前及每個劑量結束后分別檢測TSH、TC、CK、Fer及甜BG等。L-T3逐步 加量使得正常人TSH完全抑制，Fer和S皿G水平上調，TC和CK水平下調；患者給藥后，T甜未被 完全抑制，且CK反常升高，Fer和甜BG升高趨勢不顯著。說明女患垂體、肌肉和肝臟組織均出 現對外源性kT3的不同程度抵抗。
[0069] 討論。
[0070] 該女患者，其血清FT3、FT4和T甜均升高，基因測序發現T祕第10外顯子出現P453T突 變，因此該患診斷RT地無疑。但該患者同時合并垂體微腺瘤，使得診斷變得困難，到底是RTH 0合并垂體TSH微腺瘤還是RT地合并垂體意外瘤。
[0071] 血清糖蛋白激素 a亞單位(a-GSU)升高和TSH對TRH興奮實驗無反應是診斷垂體TSH 瘤的有效指標，但是其敏感性較差，例如：垂體T甜瘤患者中僅有70%的人血清a-GSU升高， 80 %的人血清a-GSU/T甜比值大于1。盡管理論上講T甜瘤患者TWl興奮實驗TSH無反應，但仍 有10-20%的TSH瘤患者TRH興奮實驗T甜呈現正常反應。
[0072] 隨著高分辨率的MRI的應用，垂體TSH微腺瘤的報道也越來越多，T甜微腺瘤顯示出 與T甜大腺瘤不同的生化特點，例如T細微腺瘤經常不會伴隨血清其它垂體激素升高，也不 會出現腫瘤壓迫癥狀。與T甜大腺瘤相比，TSH微腺瘤往往血清糖蛋白激素 a亞單位(a-GSU) 正常或血清a-GSU/TS化k值小于1，例如對15名TSH微腺瘤患者的隨訪研究報道其中10人a-GSU正常，而僅有4人a-G洲/T甜比值大于IdT甜微腺瘤患者往往TWl興奮實驗T甜呈現正常反 應，一項對16名TSH微腺瘤患者的隨訪研究報道，10名TSH微腺瘤患者中7人TWl興奮實驗TSH 呈現正常反應。因此根據生化指標無法鑒別RT冊合并垂體TSH微腺瘤還是RT地合并垂體意 外瘤。
[0073] 本病例支持RT冊合并垂體T細微腺瘤的證據之一:通過對有P453T突變的8個家系 的甲狀腺功能的分析，我們發現P453T突變患者的T細水平均在正常范圍。但本研究報道的 患者術前T甜值顯著高于正常范圍，其垂體瘤術后血清T甜恢復到正常范圍，運說明垂體腺 瘤組織分泌的T甜可能是該患T甜水平顯著升高的原因。
[0074] 支持RT地合并垂體T甜微腺瘤的證據之二：14個月的術后隨訪結果，患者垂體瘤術 后甲狀腺峽部明顯縮小，血清FT3和T甜水平逐步下降，血清T甜恢復至正常范圍。但由于患 者依然存在甲狀腺激素抵抗，其血清FT4，FT3仍然高于正常范圍。RefetofT報道，RT冊患者 的血清T4水平較高，T4/T3比值明顯高于T甜瘤患者。我們推斷，RT冊主要升高T4,而T甜瘤主 要升高T3,運與我們術后隨訪發現患者血清FT3和T甜水平逐步下降，而血清FT4未見明顯變 化的趨勢相一致。因此，隨訪結果強烈支持該RT地患者合并有TSH瘤。
[0075] 本例患者腺瘤組織的激素染色與血清中激素水平呈現不一致的現象。回顧文獻， 我們發現既往報道的T細瘤的腺瘤組織免疫組化也常見合并其他垂體激素染色陽性（WGH 和TOL為主），但其血清垂體激素檢測仍可正常，提示腺瘤組織中GH和TOL陽性細胞分泌的GH 和TOL不足W導致血清中GH和TOL水平的升高。本研究報道的T甜微腺瘤組織質軟，組織切片 未發現間質纖維化和巧化，推測可能與其處于疾病早期階段有關。
[0076] 綜上所述，本實用新型檢測效率高，方法簡單，結果準確，成本低，具有實質性的技 術效果，便與推廣。
[0077] 盡管上述對本實用新型做了詳細說明。任何熟悉此技術的人±皆可在不違背本實 用新型的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通 常知識者在未脫離本實用新型所掲示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變， 仍應由本實用新型的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種TRi3基因突變檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括PCR緩沖液、酶溶液和外顯 子特異性擴增引物，其中該試劑盒中設置有5管PCR反應液、1管酶混合液和20管1-10號外顯 子特異性擴增引物母液。2. 根據權利要求1所述的TRi3基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述10對1-10號外顯 子特異性擴增引物編號為SEQ ID ΝΟ:1 和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
【文檔編號】C12Q1/68GK205473835SQ201521134516
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年12月31日
【發明人】滕曉春, 滕衛平, 單忠艷, 金婷, 王冉冉, 梁越, 何雪, 張涵祎
【申請人】中國醫科大學附屬第醫院, 中國醫科大學附屬第一醫院