一種微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及單細胞克隆的培養(yǎng)分離，特別涉及一種微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板及單細胞克隆分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單細胞克隆指的是分離單個細胞，其增殖產(chǎn)生的后代都是來源于同一個細胞，即為單細胞克隆。傳統(tǒng)的單細胞克隆分離可采用有限稀釋法或克隆環(huán)法。
[0003]有限稀釋法:即把細胞稀釋到理論上的5~10 μ I培養(yǎng)液中含I個細胞，然后用移液器吸取相應容積的細胞懸液至96孔板中，每孔補足培養(yǎng)液至200 μ 1，在顯微鏡下找到有單細胞克隆生長的培養(yǎng)孔，進行單細胞克隆分離。實際的操作中，該法效率不高，大量存在的空白孔和多細胞孔(細胞數(shù)大于或等于2)需要研宄人員觀察排除，費時費力。
[0004]克隆環(huán)法:在顯微鏡下找到要挑取的單克隆，用記號筆在培養(yǎng)板的背面標示出來。用鑷子夾取克隆環(huán)，在環(huán)的底部均勻的涂上凡士林，扣在標記的單克隆上，形成相對封閉的空間，然后在克隆環(huán)內(nèi)滴入適量的胰酶，細胞消化下來后用槍頭吸出，放到新的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。該方法對操作技巧要求較高，初學者不易掌握。
【實用新型內(nèi)容】
[0005]為克服上述現(xiàn)有方法的缺陷與不足，本實用新型提供一種微片式單細胞克隆分離專用培養(yǎng)板及單細胞克隆分離方法。
[0006]本實用新型的技術(shù)方案是:
[0007]一種微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，培養(yǎng)板本體上方蓋有培養(yǎng)板蓋。
[0008]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)板本體為聚苯乙烯板。
[0009]優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片上表面邊角處設(shè)有凸起。
[0010]優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片的上表面中心區(qū)為細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)，細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)聚苯乙烯表面進行過改性處理，接枝羥基、羧基或氨基等親水基團。
[0011]優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁以及方形培養(yǎng)片的細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)以外的表面覆蓋有超疏水納米層。
[0012]優(yōu)選的，所述超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙稀層、聚L-乳酸層、聚四氟乙烯層、陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一種。
[0013]優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片底面標有字母和數(shù)字組成的組合編號。
[0014]一種使用微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板進行單細胞克隆分離的方法，包括步驟:
[0015]S1、將細胞懸液濃度稀釋至30~50 cells/ml，在培養(yǎng)板的方形培養(yǎng)孔內(nèi)加入定量的細胞稀釋液，細胞只能在方形培養(yǎng)片上表面的經(jīng)過表面親水改性處理的細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)粘附生長，而不能在其它經(jīng)過超疏水處理的部位粘附生長；
[0016]S2、每天在顯微鏡下觀察方形培養(yǎng)片內(nèi)的細胞，選擇有單細胞克隆生長的方形培養(yǎng)片，根據(jù)其編號，用鑷子夾起方形培養(yǎng)片上的凸起，無菌轉(zhuǎn)移至24孔板的培養(yǎng)孔中；
[0017]S3、將生長有單細胞克隆的方形培養(yǎng)片依次在3個培養(yǎng)孔中用PBS輕柔漂洗3次，轉(zhuǎn)移至第四個孔中，加入0.25%的胰酶消化細胞；
[0018]S4、收集消化好的單細胞懸液，經(jīng)PBS重懸，在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，再次在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸，將細胞轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，繼續(xù)擴大培養(yǎng)，所得即為單細胞克隆。
[0019]優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片預先通過可溶性生物材料粘附在方形培養(yǎng)孔內(nèi)，可溶性生物材料在加入培養(yǎng)液后可溶解，使方形培養(yǎng)片與方形培養(yǎng)孔分開。
[0020]優(yōu)選的，所述可溶性生物材料包括膠原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。
[0021]本實用新型的優(yōu)點是:
[0022]本實用新型所述的微片式單細胞克隆分離專用培養(yǎng)板及單細胞克隆分離方法，培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干個方形培養(yǎng)孔，每個培養(yǎng)孔內(nèi)放置呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁、以及方形培養(yǎng)片的底面、周緣、凸起及頂面的周邊均覆蓋有超疏水納米層，細胞只能在方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過親水改性的中心區(qū)粘附生長，而不能在覆蓋有超疏水納米層其它部位粘附生長，經(jīng)過有限稀釋的細胞粘附于方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過親水改性的中心區(qū)后，只要每個方形培養(yǎng)片只有一個細胞克隆生長，即可根據(jù)編號，用鑷子夾住相應方形培養(yǎng)片的凸起，可方便的進行單細胞克隆的分離操作。
【附圖說明】
[0023]下面結(jié)合附圖及實施例對本實用新型作進一步描述:
[0024]圖1為本實用新型所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板的培養(yǎng)板本體的俯視圖；
[0025]圖2為本實用新型所述的方形培養(yǎng)片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]圖3為本實用新型所述的方形培養(yǎng)片的俯視結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖4為本實用新型所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板蓋上培養(yǎng)板蓋的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0028]如圖1和4所示，本實用新型所揭示的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，包括由聚苯乙烯制成的培養(yǎng)板本體I，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有6個方形培養(yǎng)孔2，每個培養(yǎng)孔內(nèi)放置1X 10 (方形培養(yǎng)片的矩陣排列方式也可以為7X7、8X8、9X9或其它組合方式)呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片3，培養(yǎng)板本體上方蓋有培養(yǎng)板蓋4。
[0029]如圖2和3所示，所述方形培養(yǎng)片3上表面右上方的邊角設(shè)有凸起31，方便用鑷子夾起，方形培養(yǎng)片底面標有字母和數(shù)字組成的組合編號，字母代表該方形培養(yǎng)片所在行，數(shù)字代表該方形培養(yǎng)片所在列，方便區(qū)分。
[0030]所述方形培養(yǎng)片的上表面中心區(qū)為細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)32，將細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)聚苯乙烯表面進行改性處理，接枝羥基(OH)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等親水基團。所述方形培養(yǎng)片除上表面中心區(qū)為細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)外，其它部位的聚苯乙烯區(qū)表面覆蓋有超疏水納米層。超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水納米層還可以為超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，上述超疏水納米層的制作方法為現(xiàn)有技術(shù)采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蝕刻具有一定粗糙度的微觀結(jié)構(gòu)從而構(gòu)建超疏水表面，采用氣相沉積的方法制備超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
[0031]本實用新型的使用微片式單細胞克隆分離專用培養(yǎng)板進行單細胞克隆分離的方法，包括步驟:
[0032]S1、將細胞懸液濃度稀釋至30~50 cells/ml，在培養(yǎng)板的方形培養(yǎng)孔內(nèi)加入2 ml的細胞稀釋液，細胞只能在方形培養(yǎng)片上表面的經(jīng)過表面親水改性處理的細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)粘附生長，而不能在其它經(jīng)過超疏水處理的部位粘附生長；
[0033]S2、每天在顯微鏡下觀察方形培養(yǎng)片內(nèi)的細胞，選擇有單細胞克隆生長的方形培養(yǎng)片，根據(jù)其編號，用鑷子夾起方形培養(yǎng)片上的凸起，無菌轉(zhuǎn)移至24孔板的培養(yǎng)孔中；
[0034]S3、將生長有單細胞克隆的方形培養(yǎng)片依次在3個培養(yǎng)孔中用PBS輕柔漂洗3次，轉(zhuǎn)移至第四個孔中，加入0.25%的胰酶消化細胞；
[0035]S4、收集消化好的單細胞懸液，經(jīng)PBS重懸，在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，再次在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸，將細胞轉(zhuǎn)移至新的24孔中，繼續(xù)擴大培養(yǎng)，所得即為單細胞克隆。
[0036]所述方形培養(yǎng)片預先通過可溶性生物材料粘附在方形培養(yǎng)孔內(nèi)，可溶性生物材料在加入培養(yǎng)液后可溶解，使方形培養(yǎng)片與方形培養(yǎng)孔分開。所述可溶性生物材料包括膠原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。
[0037]上述實施例只為說明本實用新型的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人能夠了解本實用新型的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本實用新型的保護范圍。凡根據(jù)本實用新型主要技術(shù)方案的精神實質(zhì)所做的修飾，都應涵蓋在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，培養(yǎng)板本體上方蓋有培養(yǎng)板蓋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:所述培養(yǎng)板本體為聚苯乙烯板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:所述方形培養(yǎng)片上表面邊角處設(shè)有凸起。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:所述方形培養(yǎng)片的上表面中心區(qū)為細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁以及方形培養(yǎng)片的細胞貼壁培養(yǎng)區(qū)以外的表面覆蓋有超疏水納米層。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:所述超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯層、聚L-乳酸層、聚四氟乙烯層、陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一種。
【專利摘要】本實用新型公開了一種微片式單細胞克隆分離培養(yǎng)板，培養(yǎng)板包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，本實用新型所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁、以及方形培養(yǎng)片的底面、周緣、凸起及頂面的周邊均覆蓋有超疏水納米層，細胞只能在方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過親水改性的中心區(qū)粘附生長，而不能在覆蓋有超疏水納米層其它部位粘附生長，經(jīng)過有限稀釋的細胞粘附于方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過親水改性的中心區(qū)后，只要每個方形培養(yǎng)片只有一個細胞克隆生長，即可根據(jù)編號，用鑷子夾住相應方形培養(yǎng)片的凸起，可方便的進行單細胞克隆的分離操作。
【IPC分類】C12M3-00
【公開號】CN204608027
【申請?zhí)枴緾N201520253470
【發(fā)明人】何向鋒, 施文, 王建紅, 強福林, 沈康
【申請人】何向鋒, 南通市腫瘤醫(yī)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月24日