豬圓環病毒2型的pcr檢測方法、所用引物及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種豬圓環病毒2型的PCR檢測方法、所用引物及檢測試劑盒，所述PCR檢測方法操作簡單、技術要求低，適合于臨床檢測。所述PCR檢測方法，包括以下步驟：（1）以樣品中提取的DNA為模板進行PCR擴增，其中PCR擴增的引物序列為：上游5?TGGGATGATCTACTGAGAC?3；下游5?ATTTCATATGGAAATTCAG?3；（2）對擴增產物進行電泳；（3）分析、判定結果，樣品出現268bp擴增條帶，且陰性對照無相應的擴增條帶時，結果為陽性。
【專利說明】豬圓環病毒2型的PCR檢測方法、所用引物及檢測試劑盒
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及一種豬圓環病毒2型的PCR檢測方法、所用引物及檢測試劑盒。
[0003]
【背景技術】
[0004]豬圓環病毒(Porcine circovirus , PCV)是已發現的最小的動物病毒，屬于圓環病毒科圓環病毒屬的成員，為單鏈環狀病毒。PCV有I型(PCVl)和2型(PCV2)兩種基因型，其中PCVl不致病，而PCV2是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的主要病原之一。PMWS于1997年在加拿大首次被發現，發病豬主要表現為生長遲緩，皮膚蒼白，呼吸困難伴有死亡。在我國，2000年郎洪武通過ELISA的方法檢測從北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南7省采集的559份各類豬血清樣品，發現其檢出陽性率42.9%，且抗體陽性率隨著豬年齡的增長而升高。其后2002年11月至2002年8月，王忠田采用PCR的方法對北京、天津、廣東等地的12個規模化養豬場PCV2感染發病群的55份組織病料進行了PCV2的檢測，發現12個豬場中11個發病豬群主要表現為斷奶仔豬多系統衰竭綜合征，I個為皮炎和腎病綜合征。由此可見該病在我國的一些規模化豬場普遍存在。
[0005]PCV2主要損傷感染豬的免疫器官，引起機體免疫功能的下降及紊亂，其常與豬細小病毒、豬肺炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等微生物協同作用，發揮其致病性。PCV2引起的疾病主要有斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合癥、繁殖與呼吸綜合征、滲出性皮炎等，在整個發病過程中PCV2常起到主要作用。
[0006]由于目前尚無針對該病的有效預防和控制措施，且該病常以亞臨床感染的形式存在，所以做好該病的診斷對該病的監控尤為重要。
[0007]
【發明內容】
[0008]發明目的
本發明的目的是提供一種豬圓環病毒2型的PCR檢測方法，操作簡單、技術要求低，適合于臨床檢測。
[0009]本發明的另一個目的是提供用于所述豬圓環病毒2型的PCR檢測方法的引物。
[0010]本發明的另一個目的是提供與上述檢測方法相應的檢測試劑盒。
[0011]發明概述根據本發明的第一方面，提供了一種豬圓環病毒2型的PCR檢測方法，包括以下步驟:
(I)以樣品中提取的DNA為模板進行PCR擴增，其中PCR擴增的引物序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ；
下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ；
(2 )對擴增產物進行電泳； (3)分析、判定結果，樣品出現268bp擴增條帶，且陰性對照無相應的擴增條帶時，結果為陽性。
[0012]優選的，PCR擴增的條件及程序為:95°C預變性5min; 94°C變性30s，43_56°C梯度退火30s，72°C延伸30s，共36個循環，最后72°C延伸6min。進一步優選的，PCR擴增的條件及程序為:95°C預變性5min; 94°C變性30s，49°C退火30s，72°C延伸30s，共36個循環，最后72°C 延伸 6min。
[0013]優選的，PCR反應體系為:
PCR緩沖液；
MgCh 終濃度 2.5mmol/L；dNTP 終濃度(h2mmol/L;
TaqDNA聚合酶I unit;
上下游引物終濃度均為0.5ymol/l ；
模板2.Ομ? ；
加ddH20(雙蒸水)至終體積50μ1。
[0014]其中，TaqDNA聚合酶的終濃度為本領域常規參數，模板的終濃度可以由本領域技術人員經試驗確定，以能獲得有效的PCR擴增反應為目標。所述有效的PCR擴增反應是指當DNA模板中含有足量目標DNA序列可以進行PCR擴增反應時，擴增產物的量足以被檢出，顯示結果為陽性。
[0015]所述陰性對照可以由本領域技術人員進行選擇，優選的，所述PCR檢測方法以豬偽狂犬病病毒作為陰性對照。
[0016]根據本發明的第二方面，還提供了用于所述豬圓環病毒2型的PCR檢測方法的引物，其序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ；
下游5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3。
[0017]根據本發明的第三方面，還提供了一種用于豬圓環病毒2型的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括:
PCR緩沖液；
引物對，序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3，
下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ；
MgCl2;
dNTP；
Taq DNA聚合酶；
CldH2O;
陰性對照；
DNA Ladder0
[0018]優選的，所述陰性對照為豬偽狂犬病病毒。
[0019]本發明所述豬圓環病毒2型的PCR檢測方法操作簡單，技術要求較低，便于臨床檢測或流行病學調查，所檢測的泰州地區67份疑似PMffS的病料，其中42份表現為陽性，其陽性率可達62.6%。
[0020]
【附圖說明】
[0021]圖1是實施例1的PCR擴增電泳圖，其中，M:1OObp DNA Ladder; 1、2:PCV2擴增產物；
圖2是敏感性試驗的PCR擴增電泳圖，其中，M:1OObp DNA Ladder; 1、2、3、4、5、6、7分別代表稀釋 I O—1、I O—2、I O—3、I O—4、I O—5、I O—6、I O—7倍數的 PCV2擴增產物。
【具體實施方式】
[0022]下邊結合實施例作具體的說明。
[0023]1.1主要試劑及儀器
基因組DNA快速抽提試劑盒、10bp DNA LadderX DNA Loading Dye、dNTP Mix均為上海生工生物工程有限公司產品；TaqDNA聚合酶為Fermentas產品，型號EP0404，濃度為lu/μ1;25πιΜ MgCl2及 10 X Buffer為Fermentas產品；PCR擴增儀(PTC-200rev)、JS-380A自動凝膠圖像分析儀、Mikro200R冷凍高速離心機、DYY-7C型電泳儀、DYCP-3IDN瓊脂糖水平電泳槽、恒溫箱、微量移液器等。
[0024]1.2引物的設計及合成
參照GenBank上發表的PCV2全基因序列JX682407和發明人分離鑒定的5株PCV2序列(GenBank登錄號::KC788750、KF039888、KF039889、KF039890、KF039891)，設計一對擴增PCV2片段的特異性引物，擴增片段位于717-985bp，長度為268bp，引物的序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ；
下游5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3。
[0025]引物的合成由上海生工生物工程有限公司合成，-20°C冰箱保存備用，濃度均為25ymol/L0
[0026]1.3 DNA模板的提取
采集有PMffS典型癥狀發病豬的脾臟、淋巴結和肺等病變組織，按照基因組DNA快速抽提試劑盒的說明書操作。提取的DNA模板-20°C保存備用。
[0027]實施例1
以豬偽狂犬病病毒為陰性對照，以1.3提取的DNA為模板，用上述特異性引物進行擴增，反應體系為:10 X Buffer和25mM的MgCl2各5μ1，2.5mmol/L dNTP 4μ1，TaqDNA聚合酶Ιμ?，上下游引物各Ιμ?，模板2.Ομ?，加(IdH2O至終體積50μ1，混勻后放入PCR擴增儀中。反應的程序為:95°C預變性5min; 94°C變性30s，采用43_56°C范圍內不同溫度退火30s，72°C延伸30s，共41個循環，最后72°C延伸6min，發現退火溫度為49°C時擴增效果最好。反應結束后，將PCR產物在1.5%瓊脂糖上進行電泳，凝膠成像系統進行觀察。在約268bp處見一特異性條帶，與預期的大小一致。結果如圖1(圖1中的I為退火溫度為49°C時的擴增產物結果，2為陰性對照的擴增產物結果)。
[0028]將PCR產物按DNA凝膠回收試劑盒的要求進行回收，將回收產物送去生物公司進行測序，測序的結果與GenBank中的PCV2序列進行比對，結果顯示擴增的條帶為PCV2序列。
[0029]
實施例2特異性測定
以1.3提取的DNA、豬瘟脾淋苗、豬偽狂犬病病毒的DNA、豬大腸桿菌的DNA為模板，用上述所設計的PCV2的特異性引物按照實施例1的方法進行擴增，電泳、觀察結果。結果顯示，所設計的引物僅能擴增出PCV2的DNA片段，約268bp，而其它擴增結果均沒顯示條帶。其中豬瘟脾淋苗圩大北農科技集團股份有限公司商品疫苗，豬偽狂犬病病毒的DNA和豬大腸桿菌的DNA由
【申請人】按照現有技術分離鑒定保存。
[0030]
實施例3敏感性測定
將1.3提取的DNA作不同程度的稀釋，分別用實施例1的方法進行PCR擴增，擴增結束后以1yL的PCR產物進行電泳，檢測PCR方法的敏感性。結果如圖2所示，說明DNA模板在經過10—MO—7稀釋后，采用所述優化的條件擴增仍能在10—4時擴出片段，表明其敏感性較高。
[0031]
實施例4 PCR檢測方法的驗證試驗
采用實施例1的方法，對發明人分離鑒定的5株PCV2(發明人最近幾年從蘇中地區(泰州市及周圍地區)發病豬場分離到多株不同生物學特性的PCV2毒株，并對其進行了 Cap基因序列測定(GenBank登錄號:KC788750、KF039888、KR)39889、KF039890、KF039891)和進化樹分析)的PKl5細胞培養物進行了PCV2的檢測，同時設陰性對照(豬偽狂犬病病毒PKl5細胞培養物)，計算與病毒分離鑒定方法檢測結果的符合率。結果顯示，2種方法檢測5株PCV2和陰性對照，陰性和陽性結果完全符合，符合率為100%。
[0032]
實施例5 PCR檢測方法的應用
采用實施例1的方法，對江蘇農牧科技職業學院教學動物醫院收集的泰州周邊地區發病豬的疑似病料進行了 PCV2的檢測。
[0033]
采用實施例1的擴增條件，對所采的67份疑似PMWS的病料行了 PCV2的檢測。結果顯示，其中42份表現為陽性，其陽性率可達62.6%。
[0034]
PCV2的基因組全長為1767bp或1768bP<3PCV2侵害宿主后，能夠促進淋巴細胞的凋亡和抑制淋巴細胞的增殖，造成淋巴細胞的缺失及亞群的變化，使機體免疫系統低下，不能及時的對免疫原進行有效的免疫應答，易引起繼發感染。因此常與豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌等混合感染，加重其危害性。迄今為止，對于PCV2感染的控制仍然缺乏有效的措施，市場上還沒有較好的疫苗和藥物來防治該病。因此，建立快速、簡易的診斷方法，對加強該病的監控及預防有著極其重要的意義。
[0035]PCR技術已在多個領域中得到廣泛應用，其具有較強的靈敏度、準確度和特異性，能夠快速的進行診斷，彌補了傳統檢測方法的費時、費力的缺點。本發明根據GenBank中已發布的PCV2的序列設計了一對特異性引物，通過對其反應條件的優化，建立了 PCV2的PCR檢測方法，具有較好的特異性和敏感性，并對泰州及周邊地區的67份臨床病料進行了檢測，其陽性率可達62.6%，說明PCV2對該地區存在一定危害性。該方法的建立有利于規模化豬場對 PCV2的監控，為提早預防PCV2的發病提供基礎。
【主權項】
1.一種豬圓環病毒2型的PCR檢測方法，其特征在于，順序包括以下步驟: (I)以樣品中提取的DNA為模板進行PCR擴增，其中PCR擴增的引物序列為: 上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ； 下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ； (2 )對擴增產物進行電泳； (3)分析、判定結果，樣品出現268bp擴增條帶，且陰性對照無相應的擴增條帶時，結果為陽性。2.如權利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR檢測方法以豬偽狂犬病病毒作為陰性對照。3.如權利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于，PCR擴增的條件及程序為:95°C預變性5min; 94°C變性30s，43-56°C梯度退火30s，72°C延伸30s，共36個循環，最后72°C延伸6min04.如權利要求3所述的PCR檢測方法，其特征在于，PCR擴增的條件及程序為:95°C預變性5min; 94°C變性30s，49°C退火30s，72°C延伸30s，共36個循環，最后72°C延伸6min。5.如權利要求1-4中任一項所述的PCR檢測方法，其特征在于，PCR反應體系為: PCR緩沖液； MgCh 終濃度 2.5mmol/L； dNTP終濃度0.2臟01/1; TaqDNA聚合酶I unit; 上下游引物終濃度均為0.5ymol/l ； 模板2.0μ1; 加ddH20至終體積50 μ?ο6.一種用于豬圓環病毒2型PCR檢測方法的引物，其序列為: 上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ； 下游5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3。7.—種用于豬圓環病毒2型的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: PCR緩沖液； 引物對，序列為: 上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3， 下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ； MgCl2; dNTP； Taq DNA聚合酶；CldH2O; 陰性對照； DNA Ladder08.如權利要求7所述的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為豬偽狂犬病病毒。
【文檔編號】C12N15/11GK106086238SQ201610524436
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】曹軍平, 董亞青, 郭廣富, 朱愛萍
【申請人】江蘇農牧科技職業學院