同時檢測流感病毒h1、h3、h5、h7的試劑盒及方法

同時檢測流感病毒h1、h3、h5、h7的試劑盒及方法
【專利摘要】本發明公開了采用熒光定量PCR同時檢測流感病毒H1、H3、H5和H7四種亞型的試劑盒和方法，試劑盒中包括對應各流感病毒亞型的特異性引物和探針。本發明提供的試劑盒使用方便，所用的試劑少，檢測的特異性強，靈敏度高；檢測方法實現了對同一個樣本，可進行4種流感病毒分型的檢測，大大簡化了操作過程，減少了重復操作的過程，節省時間，減輕重復操作消耗的勞動力，并有效節約成本，實現快速篩查。
【技術領域】
[00011本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及同時檢測流感病毒111、!13、!15、!17的試劑 盒及方法。 同時檢測流感病毒H1、舊、吧、^的試劑盒及方法
【背景技術】
[0002] 流行性感冒病毒（inf luenza virus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表 種，簡稱流感病毒，包括人流感病毒和動物流感病毒，人流感病毒分為甲（A)、乙（B)、丙(C) 三型，是流行性感冒（流感）的病原體。流行性感冒簡稱流感，主要是指人群中，由普通流感 病毒引起的一種病毒性急性呼吸道傳染病。流感傳染性強，傳染迅速，會導致每年的流行， 并且歷史上每隔幾十年會造成流感大流行，在短時間內使很多人患病甚至死亡。對流感疫 情的防控最根本的途徑就是早發現、早診斷、早治療和切斷傳染源。由此可見，快速靈敏的 流感病毒檢測技術成為了保護人民生命健康、防控疫情在國內大范圍流行的第一道屏障。
[0003] 現有的快速檢測技術主要有兩類:第一類為免疫學方法，包括酶聯免疫吸附法、免 疫熒光法、同位素標記抗體法、乳膠凝集法、免疫傳感器法、免疫擴散法及免疫色譜法等;第 二類是以核酸為基礎的分子生物學方法，主要有核酸探針法和聚合酶鏈反應法 (Polymerase Chain Reaction，PCR)。免疫學方法是以抗原抗體結合來用于檢測，檢測需要 制備特異性抗原或抗體，制備過程復雜，且需要保持使用的抗原或抗體具有免疫原性活性， 該檢測的靈敏度較低，易出現假陰性。
[0004] PCR方法是核酸擴增技術的典型代表，該技術是由美國PE-CetUS公司人類遺傳研 究室的Mullin等人于1985年發明的，在過去的二十年里，PCR技術作為分子生物學的核心得 到了迅猛的發展和應用，特別是在疾病的臨床檢測病毒中，PCR技術以其快速、靈敏和特異 的優勢，不僅日益取代了傳統的檢測方法，而且使以往無法完成的檢測成為了可能。
[0005] 多重PCR，是指在同一個PCR反應體系中加入二對以上的引物，同時擴增出多個核 酸片段的PCR反應，具有的優點有高效性、系統性、經濟簡便性。但因 PCR成功的關鍵在于設 計出合理的引物，合適的引物是決定PCR擴增特異性和敏感性的關鍵。而多重PCR對引物的 要求更加嚴格，如多重PCR的各對引物必須具有相近的退火溫度，使得所有的靶位點可以用 相同的PCR程序在單個的反應中得到有效的擴增;而其之間不能形成穩定二聚體和發夾結 構。同時保證了擴增產物的大小能夠通過電泳分開。
[0006] 現有一般檢測2重、3重病原檢測較多，如現有專利公開號CN101895531B，名稱為檢 測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的引物，記載了其選取的引物間的序列在理論上可以很 好地區分Hl，H2，H3，H5，H7和H9 (選取的300條序列，全部正確的分到所該分的亞型中），但實 際當中，由于涉及到多重引物設計的條件，易出現引物間交叉反應，易導致假陰性的結果， 或無法區分出這幾種分型，目前也僅能檢測出H1、H3兩種分型。
[0007] 目前還沒有針對流感病毒!11、!13、!15、!17四種分型進行多重?0?的檢測方法。因多重 PCR對引物設計的要求苛刻，檢測的重數越多，限制的條件越多，要達到高靈敏、特異性強的 多重檢測也就需要付出越多，不僅需要在前期引物設計或探針設計需要人工分析、經驗判 斷，還需要上千次及上萬次的實驗篩選、驗證檢測結果。

【發明內容】

[0008] 為解決上述技術問題，本發明提供了一組用于同時檢測流感病毒流感Hl、H3、H5、 H7四種亞型的核酸。本發明還提供一組用于熒光定量PCR同時檢測流感病毒流感Hl、H3、H5、 H7四種亞型的試劑盒及其檢測方法。
[0009] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0010] -組用于多重PCR同時檢測流感病毒!11、!13、!15、!17亞型的核酸，包括流感病毒!11的 上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病毒H7的上、 下游引物；
[0011]其中，所述流感病毒Hl的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
[0012] 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示；
[0013] 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No. 7所示，下游引物序列如SEQ ID No. 8所示；
[0014] 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11所示。
[0015] 一組用于熒光定量PCR同時檢測流感病毒!11、!13、!15、!17亞型的核酸，包括流感病毒 Hl的上、下游引物和探針、流感病毒H3的上、下游引物和探針、流感病毒H5的上、下游引物和 探針、及流感病毒H7的上、下游引物和探針；
[0016] 所述流感病毒Hl的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探針序列如SEQ ID No.3所示；
[0017] 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探針序列如SEQ ID No.6所示；
[0018] 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示，探針序列如SEQ ID No.9所示；
[0019] 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11所示，探針序列如SEQ ID No. 12所示。
[0020] 一種用于同時檢測流感病毒111、!13、!15、!17亞型的試劑盒，該試劑盒包括:上述流感 病毒Hl、H3、H5、H7的上、下游引物和相應的探針，各條探針的5'端和3'端分別對S#EFAM-BHQl、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3 〇
[0021] 如上所述的試劑盒，優選地，還包括2 X RT-PCR緩沖液(Buffer)、25 X反轉錄酶和 Taq聚合酶混合酶（25XRT/Taq mix)。
[0022] 一種用于熒光定量PCR同時檢測流感病毒Hl、H3、H5、H7亞型的方法，該方法是非診 斷目的的檢測方法，包括以下步驟：
[0023] (1)從樣品中提取病毒RNA;
[0024] (2)對所述步驟(1)提取的病毒RNA進行熒光定量PCR擴增;其中，熒光定量PCR擴增 時，在反應體系中，采用流感病毒Hl的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其5'端和3'端分別對應標記FAM和BHQl; 流感病毒H3的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探針的核苷 酸序列如SEQ ID No.6所示，其5'端和3'端分別對應標記Texred和BHQ2;流感病毒H5上、下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，其Y端和Y端分別對應標記JOE和TAMRA;流感病毒H7上、下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，其5'端和 3'端分別對應標記CY5和BHQ3;
[0025] (3)收集熒光信號，選擇上述熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3~15個循環 的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；
[0026] (4)結果判定:待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判 斷為陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。
[0027] 如上所述的方法，優選地，所述步驟(2)中熒光定量PCR擴增的反應體系具體如下：
[0028] IXRT-PCR Buffer,
[0029] 1XRT/Taq mix,
[0030] 所述流感病毒Hl的上游引物的終濃度為SOnmo I /L，下游引物的終濃度為SOnmo I / L，探針的終濃度為40nmo I /L;所述流感病毒H3的上游引物的終濃度為400nmo I /L，下游引物 終濃度為400nmol/L，探針的終濃度為200nmol/L;所述流感病毒H5的上游引物終濃度為 200nmol/L，下游引物終濃度為200nmol/L，探針的終濃度為lOOnmol/L;所述流感病毒H7上 游引物終濃度為200nmol/L，下游引物終濃度為200nmol/L，探針的終濃度為lOOnmol/L;
[0031] 所述病毒RNA為2yL;
[0032] 同時設置無核酸酶水為陰性對照。
[0033]如上所述的方法，優選地，所述步驟（2)中熒光定量PCR擴增的反應程序為：50 °C 3〇!1^11，951€51^11，然后95°(：1〇8,551€4〇8，在55°(：進行熒光檢測，共進行45個循環。
[0034] 如上所述的方法，優選地，所述步驟(4)結果判定中，所述閾值為35,當Ct值<35 時，有明顯擴增曲線為陽性結果;Ct值>40時，無明顯擴增曲線為陰性結果。
[0035]本發明提供了檢測流感病毒H1、H3、H5和H7亞型的核酸組，該組核酸可用于單一病 毒亞型的檢測，也可用于幾種病毒亞型同步檢測的多重擴增使用。用于同步檢測這四種流 感病毒亞型時，其檢測靈敏度高，特異性強，經過驗證，相互之間不發生交叉反應。
[0036] 本發明還提供了，一種用于熒光定量PCR同時檢測流感病毒Hl、H3、H5和H7四種亞 型的試劑盒，同時建立了一種比較高效、靈敏的，可同時檢查四種亞型的流感病毒，具體為 流感病毒H1、H3、H5和H7亞型的快速檢測方法。該方法能有效提高檢測的靈敏度，避免假陰 性。提供的檢測試劑盒使用方便，操作簡便，自動化程度高，有效替代傳統病毒分離來獲得 檢測結果，且試劑盒所用的試劑少，大大簡化了操作過程，減少了重復操作的過程，也就減 少了在操作過程的污染，避免重復操作而消耗過多的勞動力，節省時間，有效節約成本，實 現了快速篩查，所用試劑盒的檢測效果好，特異性強，靈敏度高。
[0037] 提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷、通過直接探測PCR過程 中熒光信號的變化來獲得定量的結果，不需要PCR后處理或電泳檢測，克服了常規PCR技術 的易污染、出現假陽性，能有效避免非特異性擴增難題，并且適合大批量樣本的檢測。
[0038] 被流感病毒感染，一般很難發現和控制，而本發明提供的試劑盒具有較高的檢測 靈敏度，且對1個樣本的檢測可實現對四種亞型流感病毒的排查，且主要是檢測待測樣本中 是否含有流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型的核酸，并不是針對疾病的診斷，該檢測屬于非診斷 性的檢測。但可以有助于提前發現感染流感病毒攜帶者出現無病癥癥狀的潛伏期及不發病 的隱性感染者，為能及時有效控制流感病毒H1、H3、H5和H7亞型的傳播與擴散，提供有效的 技術支持。
【附圖說明】
[0039]圖1為本發明的方法檢測流感病毒Hl亞型靈敏度的擴增曲線。
[0040]圖2為本發明的方法檢測流感病毒H3亞型靈敏度的擴增曲線。
[00411圖3為本發明的方法檢測流感病毒H5亞型靈敏度的擴增曲線。
[0042]圖4為本發明的方法檢測流感病毒H7亞型靈敏度的擴增曲線。
[0043]圖5為本發明的方法檢測流感病毒Hl亞型的標準曲線。
[0044]圖6為本發明的方法檢測流感病毒H3亞型的標準曲線。
[0045]圖7為本發明的方法檢測流感病毒H5亞型的標準曲線。
[0046]圖8為本發明的方法檢測流感病毒H7亞型的標準曲線。
【具體實施方式】
[0047]以下結合具體實例對本發明做進一步詳細說明，并非對本發明的限定，本發明的 實施方式并不限于此，本發明提供的核苷酸序列的互補序列也可實現本發明，如無特殊說 明，所用試劑為常規試劑，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發 明的保護范圍。
[0048]實施例1引物、探針的設計
[0049] 首先分別篩選四種流感病毒亞型的特異目標基因，根據檢測目的，對每種病毒從 GenBank下載多條病毒基因序列，進行比對分析，選取保守區，采用Array Designer 4 .Osoftware軟件輔助設計擴增引物及適合焚光定量PCR反應體系的雜交探針。
[0050] 由于本發明是多重熒光定量，首先探針標記的選擇比較關鍵，其次軟件設計出來 的探針要經過篩選，四個基因的探針信號不能相互干擾，這就需要在設計探針時考慮四對 引物和四條探針之間都不能相互干擾。
[0051] 熒光定量PCR檢測是在普通PCR檢測的基礎上，進一步通過特異性的熒光探針，該 探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告焚光基團和一個淬滅焚光基團。探針完整時，報 告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時，Taq酶的5 ' 一3 '外切酶活性將探針酶 切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每 擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同 步。所以熒光定量PCR檢測的前提是要進行PCR擴增反應，擴增反應之間的引物及產物需盡 量避免交叉反應，再進一步保證特異性探針與各個擴增產物、引物均不應有交叉反應。又由 于本發明是多重熒光定量，所以探針標記的選擇也比較關鍵，不僅要對軟件設計出來的探 針要經過篩選，四個基因的探針信號還不能相互干擾。
[0052] 分別設計出流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型特異的HA基因多條引物序列和雜交探針 序列，采用NCBI Blast在線分析軟件(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/blast)對擬選用的 探針和引物組合進行序列同源性和適配性分析評估，并通過檢測試驗最終選定這流感病毒 4種亞型特異且適合多重熒光定量反應體系的引物與探針組合。
[0053]對于每種病毒亞型設計的擴增引物首先要進行單病毒的擴增檢測，確認單個病毒 擴增檢測沒有非特異性擴增后，再進行多重病毒的擴增，設計引物就需要盡量避免發生交 叉反應，還要考慮擴增條件要盡量一致，最終通過雜交反應排除交叉反應;根據上述設計、 生物信息學分析和發明人的經驗設計及大量實驗檢測試驗篩選結果確定以下序列：
[0054] 流感病毒Hl亞型特異的擴增引物對和雜交探針：如SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2所 示的特異擴增引物對，以及如SEQ ID No.3所示的雜交探針序列，具體如下：
[0055] H1-F(SEQ IDNo · 1): 5' -AGCTCATGGTCYTACATTGTGG-3'其中 Y代表嘧啶，此處為T或 Co
[0056] H1-R(SEQ IDNo.2) :5' -CCTTTCRAATGATGACACTGAGC-3'其中R為代表嘌呤，此處為A 或G。
[0057] Hl-P(SEQ IDNo.3):57-TGTTACCCAGGAGATTTCA-37
[0058] 其中，為了提高對Hl亞型變異株的檢出率，在SEQ ID No. 1上游引物序列第12個堿 基Y代表嘧啶，此處為T或C、SEQ ID No.2下游引物序列第7個堿基R代表嘌呤，此處為ASG; [0059] 流感病毒H3亞型特異的擴增引物對和雜交探針：如SEQ ID No.4、SEQ ID No. 5所 示的特異擴增引物對，以及如SEQ ID No.6所示的特異探針序列，具體如下：
[0060] H3-F(SEQ IDNo.4):57-TGATGGAAAAAACTGCACACTG-37
[0061] H3-R(SEQ IDNo.5):57-GCGTTCAACAAAAAGGTCCC-37
[0062] H3-P(SEQ IDNo.6):57-AGACCCTCATTGTGATGGCT-37 ；
[0063] 流感病毒H5亞型特異的擴增引物對和雜交探針：如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所 示的特異擴增上下游引物，以及如SEQ ID No.9所示的雜交探針序列，具體如下：
[0064] H5-F(SEQ IDNoJhS'-TGGTAYGGRTACCAYCATAGCAA-S'，其中Y為T或C，R為A或G。
[0065] H5-R(SEQ IDNo.ShS'-GAGTTKACYTTATTRGTGATTCCAT-S'，其中K為G或T，Y為T或C， R A或 G 〇
[0066] H5-P(SEQ IDNo · 9): 5' -AGTGGATAYGCTGCAGACA-3'其中Y為T或C。
[0067] 流感病毒H7亞型特異的擴增引物對和雜交探針：如SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11 所示的特異擴增引物對，以及如SEQ ID No.12所示的特異探針序列，具體如下：
[0068] H7-F(SEQ IDNo.lOhS'-AGAATAGAATACAGATWGACCCAGT-S'，其中W為A或T。
[0069] H7-R(SEQ IDNo.lDj'-GTGCACYGCATGTTTCCAm'，其中Y為T或C。
[0070] H7-P(SEQ IDNo·12):5' -TTTAGCTTCGGGGCATCATGTTT-3'。
[0071] 采用上述簡并引物和探針，有效地提高了檢測的特異性同時避免漏檢。
[0072] 經大量實驗驗證，采用上述引物、探針時，可單獨用于檢測各對應的流感病毒亞 型的檢測，其探針的5'端和3'端分別可選用標記FAM-BHQl、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3。但進行同時檢測四種流感病毒的亞型時，各探針標記則應對應標記這四種組合關系 也就是說采用FAM-BHQl、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3分別標記Hl的探針，H3的探 針，H5的探針，H7的探針，各探針5'端和3'端標記是不重合的，但是可隨意進行組合，檢測結 果不受影響，當然單獨一個病毒亞型進行檢測時，探針也可選用其它熒光基團如VIC、NED等 作為發光基團，使用如BHQ和MGB等作為非熒光淬滅基團。
[0073]實施例2 4重流感病毒亞型熒光定量PCR檢測試劑盒
[0074] 流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型熒光定量PCR檢測試劑盒包括以下成分：
[0075] 2XRT-PCR Buffer；25XRT/Taq mix；
[0076] 流感病毒Hl的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所 示，探針序列如SEQ ID No.3所示，探針SEQ IDNo.3的SlgEFAMJlgEBHQl;
[0077] 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No . 5所示，探針序列如SEQ ID No . 6所示其中，探針SEQIDNo . 6的Y #ETexred，3l*E BHQ2；
[0078] 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No. 7所示，下游引物序列如SEQ ID No. 8所示，探針序列如SEQ ID No. 9所示，其中，探針SEQIDNo . 9的5'標記JOE，3'標記TAMRA; [0079] 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11所示，探針序列如SEQ ID No. 12所示，其中，探針SEQ IDNo. 12的SlgECYSJlgE BHQ3〇
[0080] 其中，所述2XRT-PCR Buffer和25XRT/Taq mix上海輝睿生物科技有限公司的 HR One-step qPCR Master Mix，Code:SJ-2106B;引物、探針委托英濰捷基(上海）貿易有限 公司合成。
[0081] 實施例3 4種亞型流感病毒熒光定量PCR檢測的方法
[0082] 采用熒光定量PCR同時檢測流感病毒!11，!13，!15，!17亞型的方法包括以下步驟：
[0083] (1)病毒RNA提取
[0084] 病毒RNA提取可選用QIAmp RNA Mini Kit提取試劑盒(如可購自德國QIAGEN公司） 進行提取。
[0085] (2)熒光定量PCR擴增
[0086]采用實施例3制備的試劑盒配置反應體系，其組分及其體積優選采用下表1中組分 配置。
[0087]表1反應體系
[0090] 設置陽性對照時，采用流感病毒111、!13、!15、!17亞型提取的1^^替換樣本1?^，設置陰 性對照時，采用無核酸酶水替換樣本RNA。
[0091] 擴增條件:優選以下擴增條件：5〇￡€3〇!1^11，951€51^11，然后95°(：1〇8,55 1€4〇8，在55 °C進行熒光檢測，共進行45個循環。
[0092] (3)收集熒光信號信號，分別選擇?艦、1'以代(1、1(^、0￥5的熒光檢測模式，基線調整 取3~15個循環的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；
[0093] (4)結果判定:待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，待測 樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判斷為陽性，如無典型的擴增曲 線，判斷為陰性。
[0094]進一步地，本實施例中，閾值為35,當Ct值<35,有明顯擴增曲線為陽性結果，Ct值 > 40，明顯擴增曲線為陰性結果。
[0095] 上述熒光定量PCR反應可使用的儀器包括ABI實時PCR系統（例如7000,7300,7500， 7900等）；BioRad實時PCR檢測系統、Stratagene定量多聚酶鏈反應儀（例如MX4000，MX3000， MX3005)。
[0096] 具體在本發明中，以ABI7500熒光定量PCR儀為例，第一到第四條檢檢測通過分別 以FAM、Texred、J0E和Cy5標記。第一條檢測通道檢測流感病毒Hl亞型，其熒光染料FAM的檢 測波長約為520nm;第二條檢測通道檢測流感病毒H3亞型，其熒光染料Texred的檢測波長約 為580nm;第三條檢測通道檢測流感病毒H5亞型，其熒光染料JOE的檢測波長約為550nm;第 四條檢測通道流感病毒H7亞型，其熒光染料CY5的檢測波長約為650nm。以下實施例采用最 優選的實施例來說明本發明。
[0097] 實施例4本發明試劑盒靈敏度的檢測 [0098]首先，進行陽性模板的制備如下：
[0099] 對流感病毒!11、!13、!15、!17亞型的菌株進行1?^的提取，采用實施例3中不加入探針 的體系，其它反應試劑及擴增條件不變，進行擴增。取電泳鑒定為陽性擴增的片段，相對應 的純化后的片段進行體外轉錄，SP6 5XBuffer 20yL，rNTP s 30yL，酶切純化產物30yL， SP6Enzyme MixlOyL，Nuclease_Free Water 10yL，混合均勾，短暫離心，放入PCR擴增儀中， 37°C，反應4h。加入IyL RQl DNase到IOOyL體系，放入PCR擴增儀中37°C，15min。再次取出反 應物，用酸氯仿法抽提RNA，得到的沉淀為流感病毒的陽性模板，用Nuclease-Free Water溶 解，-80 °C保存。
[0100]上述過程中相應步驟如無特殊說明均采用常規方法，其中，采用的試劑盒等試劑 及其來源如下，高純度質粒小提試劑盒為TIANGEN公司，Xhc^酶為New England BioLabs公 司，質粒回收純化試劑盒為QIAGEN公司，SP6體外轉錄試劑盒為Promega公司的試劑盒。 [0101] 將上述獲得的流感病毒111、!13、!15、!17亞型陽性模板，經測定，其濃度分別為283即/ μL、182ng/yl、262ng/yl、238ng/yl，按照拷貝數copies/μL = (ng/μL X 10-9) X (6 · 02 X IO23)/(660 X DNA長度）公式計算，流感病毒Hl、H3、H5、H7亞型陽性模板的拷貝數分別為6.19 X 101QcopiesAU、3 · 95 X 101QcopiesAU、5 · 74 X 101QcopiesAU、5 · 21 X 101QcopiesAU，進行 10倍比稀釋，即可獲得濃度從6.19copies/yL至6.19 X 109copies/yl的Hl亞型陽性模板樣 品，濃度從3.95(3〇?丨68/^1^至3.95\10 9(：〇?丨68/^1的!13亞型陽性模板樣品，濃度從 5 · 74copies/yL至 5 · 74 X 109copies/yl的H5亞型陽性模板樣品，濃度從5 · 21copies/yL至 5· 21 X IO9CopiesAil的H7亞型陽性模板樣品。
[0102] 利用實施例3檢測方法對上述流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型的陽性模板進行檢測， 其中，
[0103] 1)NTC:無核酸酶水；
[0104] 2)反應體系按照實施例3中表1進行配制，樣本RNA采用上述稀釋后的陽性模板進 行檢測，每個梯度做三個平行樣。
[0105] 結果判定:Ct值<35,有明顯擴增曲線為陽性結果，Ct值>40,明顯擴增曲線為陰 性結果。檢測流感病毒Hl亞型、H3亞型、H5亞型、H7亞型的陽性梯度樣品的熒光值圖，如圖1、 2、3、4所示。結果表明，本發明設計的引物和探針檢測流感病毒Hl亞型的檢測靈敏度為 6(3〇口丨68/^1^，!13亞型的檢測靈敏度為30(3(^丨68/^1^，!15亞型的檢測靈敏度為5(3(^丨6 8/^1^，!17 亞型的檢測靈敏度為50c〇pieSAiL。
[0106] 檢測流感病毒Hl亞型、H3亞型、H5亞型、H7亞型的陽性梯度樣品的標準曲線圖，分 別如圖5、6、7、8所示。由圖可知，流感病毒Hl亞型、H3亞型、H5亞型、H7亞型的R 2值分別為 0.999、0.999、0.999和0.998，具有良好的線性關系。
[0107] 實施例5本發明試劑盒的特異性檢測
[0108] 1)選擇流感病毒Hl、H3、H5、H7亞型病毒株提取的RNA作為陽性對照；
[0109] 2)陰性對照:無核酸酶水；
[0110] 3)模板:選擇流感病毒!11、!13、!15、!17亞型、!19亞型、乙型流感、博卡病毒、冠狀病毒、 偏肺病毒、呼吸道合胞病毒的RNA，上述菌株均為中國檢驗檢疫科學研究院衛生檢疫研究所 保存。
[0111] 4)反應體系按照實施例3中表2進行配制，之后進行熒光定量PCR擴增。
[0112] 結果表明，所建立的四種流感亞型病毒的熒光定量PCR方法及其試劑盒，流感病毒 !11、!13、!15、!17亞型有明顯擴增曲線，為陽性，對于除流感病毒!11、!13、!15、!17亞型外的其他病 毒為陰性，沒有特異性的擴增，表明設計的引物及探針特異性強。
[0113] 實施例6:利用本發明試劑盒對樣品進行檢測
[0114] 本發明的試劑盒對病毒RNA提取液進行檢測。人鼻咽拭子、組織等標本的RNA提取 流程可參考WHO發布標準進行，推薦使用Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(目錄號： 11858882001)或Qiagen公司的OIAampViral RNA Mini Kit(目錄號：52904)進行病毒樣本 的RNA提取操作。
[0115] 針對目前，發熱人群中攜帶有流感病毒H1、H3、H5和H7亞型可能性大，對發熱人群 中流感病毒H1、H3、H5和H7亞型的篩查檢測顯得尤為重要，下面主要是對發熱人群是否攜帶 有的流感病毒H1、H3、H5和H7亞型進行模擬檢測。
[0116] 利用本發明試劑盒，對鼻咽拭子的提取的RNA進行模擬陽性樣品的檢測，其中，模 擬陽性樣品為在咽拭子中加有流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型的病毒株，具體實驗步驟如下：
[0117] (1)病毒RNA提取
[0118] 病毒RNA提取選用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒進行提取。
[0119] a.勻漿處理：
[0120] 從-80°C冰箱或液氮中取出咽拭子樣本，置于預先加入3顆直徑3mm的氧化鋯顆粒 的2mL圓底離心管中，再加入1.5mL研磨液(含10 %青鏈霉素的細胞培養基），用TOMY的組織 研磨器4000次/min震蕩60sec，直至成勾衆，于4°C，10,000印111離心1〇111；[11。
[0121] b.將上清轉移至1.5mL離心管，4°(：，12,000印111，離心21^11。取14(^1^上清液用于尺· 提取，其余勻漿液置于_40°C保存。
[0122] 總RNA提取
[0123] c.選用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒，根據樣本的數量分裝AVL液，每管560yL;
[0124] d.取HOyL研磨液上清加入到560yL分裝好的AVL液，渦旋震蕩15s，充分混勻，室溫 孵育IOmin;
[0125] e.每管分別加入560yL的無水乙醇(96%-100% )，震蕩15s充分混勻，快速離心；
[0126] f.從Kit中取出帶濾柱的2mL的收集管，做好標記，取混合液630yL加入到收集管 中，8000rpm 離心 Imin;
[0127] g.將濾柱放置到新的2mL收集管中，將剩余的液體加入濾柱，8000rpm離心Imin;
[0128] h.將濾柱移至新的收集管中，加入500yL AWl液，8000rpm離心lmin;
[0129] i.濾柱放置到一個新的收集管中，加入500yL AW2液，14,000rpm離心3min;
[0130] j.將濾柱移到干凈的1.5mL EP管中，加入60yL AVE，室溫靜置2min，8000rpm離心 Imin，即得到RNA，放置于-80 °C冰箱保存備用。
[0131] (2)熒光定量PCR擴增
[0132] 按照實施例3配置反應體系及擴增條件，進行檢測。檢測結果得出，加入流感流感 病毒H1、H3、H5和H7亞型的病毒株的樣品，檢測結果為陽性，說明本發明試劑盒可應用于檢 測咽拭子中流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型的檢測，且檢測結果準確、可靠。
【主權項】
1. 一組用于多重PCR同時檢測流感病毒!11，!13，!15，!17亞型的核酸，其特征在于，包括流 感病毒H1的上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病 毒H7的上、下游引物； 其中，所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示； 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所 示； 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所 示； 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11 所示。2. -組用于熒光定量PCR同時檢測流感病毒!11、!13、!15、!17亞型的核酸，其特征在于，包 括流感病毒H1的上、下游引物和探針、流感病毒H3的上、下游引物和探針、流感病毒H5的上、 下游引物和探針、及流感病毒H7的上、下游引物和探針； 所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所 示，探針序列如SEQ ID No.3所示； 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所 示，探針序列如SEQ ID No.6所示； 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所 示，探針序列如SEQ ID No.9所示； 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11 所示，探針序列如SEQ ID No. 12所示。3. -種用于同時檢測流感病毒!11、!13、!15、!17亞型的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包 括:如權利要求2所述的流感病毒!11、!13、!15、!17的上、下游引物和相應的探針，各條探針的5 / 端和Y 端分別對應標記FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3。4. 如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括2 X RT-PCR緩沖液及25 X反轉錄酶 和Taq聚合酶混合酶。5. -種用于熒光定量PCR同時檢測流感病毒!11、!13、!15、!17亞型的方法，其特征在于，該 方法是非診斷目的的檢測方法，其包括以下步驟： (1) 從樣品中提取病毒RNA; (2) 對所述步驟（1)提取的病毒RNA進行熒光定量PCR擴增;其中，熒光定量PCR擴增時， 在反應體系中，采用流感病毒H1的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其5'端和3'端分別對應標記FAM和BHQ1; 流感病毒H3的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探針的核苷 酸序列如SEQIDNo.6所示，其5/端和3/端分別對應標記Texred和BHQ2 ;流感病毒H5上、下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，其Y端和Y端分別對應標記JOE和TAMRA;流感病毒H7上、下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，其5'端和 3'端分別對應標記CY5和BHQ3; (3) 收集熒光信號，選擇上述熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3~15個循環的熒 光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線； (4) 結果判定:待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判斷為 陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光定量PCR擴增的反應體系 具體如下： 1XRT-PCR緩沖液， 1 X反轉錄酶和Taq聚合酶混合酶， 所述流感病毒H1的上游引物的終濃度為80nmol/L，下游引物的終濃度為80nmol/L，探 針的終濃度為40nmo 1 /L;所述流感病毒H3的上游引物的終濃度為400nmo 1 /L，下游引物終濃 度為400nmol/L，探針的終濃度為200nmol/L;所述流感病毒H5的上游引物終濃度為 200nmol/L，下游引物終濃度為200nmol/L，探針的終濃度為100nmol/L;所述流感病毒H7上 游引物終濃度為200nmol/L，下游引物終濃度為200nmol/L，探針的終濃度為100nmol/L ; 所述病毒RNA為2yL; 同時設置無核酸酶水為陰性對照。7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光定量PCR擴增的反應程序 為：5〇￡€3〇!1^11，95 1€51^11，然后95°(：1〇8,551€4〇8，在55°(：進行熒光檢測，共進行45個循環。8. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)結果判定中，所述閾值為35,當 Ct值<35時，有明顯擴增曲線為陽性結果;Ct值>40時，無明顯擴增曲線為陰性結果。
【文檔編號】C12R1/93GK106086236SQ201610467212
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】楊宇, 王靜, 王建成, 趙婷婷, 李輝
【申請人】中國檢驗檢疫科學研究院