定性檢測stat4基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對。所述引物對包括正向擴增引物、反向擴增引物、測序引物，所述反向擴增引物的5’端分別進行生物素標記。本發明還涉及一種定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序試劑盒。所述試劑盒包括擴增引物、PCR反應液、測序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本發明具有檢測結果準確、特異性高、檢測周期短、操作簡單并能有效滿足臨床檢驗要求的優點；此外，還具有可實時監測反應進程、反應時間短、PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序及高通量樣品檢測，并比金標準方法，即毛細管電泳測序法靈敏度更高的優點。
【專利說明】
定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及體外核酸檢測技術領域，尤其涉及一種定性檢測STAT4基因分型的焦 磷酸測序引物對及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 肝癌是全世界致死率高居第三的惡性腫瘤，也是中國常見的一種惡性疾病。全球 每年約有70萬人死于肝癌。肝癌中肝細胞肝癌(HepatoCellular Carcinoma，HCC)最常見， 國際癌癥研究機構2000年的調查顯示，HCC患者中80%與異性肝炎病毒和丙型肝炎病毒有 關。病史調查表明，中國的肝癌病人中80 %以上都有乙肝病史。根據衛生部發布的數據，中 國目前總計有9300萬乙肝病人，占全世界乙肝患者總數的三分之一以上。
[0003] 我國1992年普及乙肝疫苗注射后，肝癌發病率已有所下降。但在之前出生的人，約 8 %~9 %呈乙肝表面抗原(HBsAg)陽性。因此，中國大陸在未來40~50年肝細胞癌仍將是一 個重要的公共健康問題。由于原發性肝癌(HCC)患者出現臨床表現常屬疾病晚期，死亡率 高，因此，篩查高危因素用于臨床預測乙肝病毒感染的患者并發HCC的風險，有利于疾病的 早期發現和治療。
[0004] 信號轉導和激活因子（STAT)家族是近年來發現的一類轉錄因子，包括STATl， STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6。STAT家族是介導細胞因子、生長因子信號通路 上啟動蛋白轉錄的重要轉錄因子，它們在許多信號通路的細胞分子事件中都起到重要作 用，例如細胞分化、細胞增殖和存活。
[0005] STAT4位于染色體2q32.2-2q32.3;是T細胞，NK細胞，樹突狀細胞，核巨噬細胞等免 疫調控細胞內IL-12/STAT4/IFN-y信號傳導途徑的關鍵組成元件，是IL-12誘導免疫調控 細胞產生IFN-γ的關鍵調控因子，介導IL-12的免疫反應與調節T細胞的分化。國外研究證 實，STAT4基因多態性參與多種自身免疫性疾病的發生。
[0006] STAT4通過信號傳導，使白細胞介素12誘導產生IFN-γ JFN-γ是一種多效性細胞 因子，在宿主防御中具有重要的作用。由于STAT4基因多態性，激活的IFN-γ可能會降低它 的抗病毒和抗腫瘤活性，通過研究證實:STAT4中的G等位基因的單核苷酸多態性與乙肝癌 變的尚風險有關。
[0007] 2012年12月，復旦大學遺傳學研究所、遺傳工程國家重點實驗室教授余龍，在《自 然?遺傳學》（Nature Genetics)雜志上發表的《Genetic variants in STAT4and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma〉〉，石角定 人的STAT4和HLA-DQ基因是乙肝患者罹患肝癌的關鍵易感基因。
[0008] 余龍課題組聯系了海內外30個課題組，66位學者開展協作攻關，收集了國內7個地 區、總計11799例乙型肝炎患者的血細胞DNA樣本。包括5480例有乙肝病變的肝癌病例和 6319例有乙肝病史但無肝癌的對照者。運用全基因組關聯分析技術比對分析了這兩組人群 的全基因組序列中近73萬個單核苷酸多態位點的等位基因頻率，最終在STAT4基因和HLA-DQ基因簇上發現了與乙肝癌變風險顯著關聯的易感基因位點。
[0009] STAT4基因是乙肝患者罹患肝癌的關鍵易感基因，為人類進一步研究如何降低肝 癌發病風險、治療乙肝和肝癌指出了新的方向。通過檢測STAT4基因的分型，篩查肝癌的易 感人群，從而提前對易感人群進行相應的綜合干預和預防措施，降低肝癌發病風險。因此進 行STAT4位點的基因分型檢測對于預防乙肝癌變有著非常重要的意義。
[00?0] 焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序（即，確定DNA中核 苷酸的順序)方法，屬于新一代DNA序列分析技術，具備同時對大量樣品進行測序分析的能 力，并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優點。其基本原理為，由4種酶催化的同 一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與 模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團（PPi)，PPi 可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值，每個峰值的高度與反應中摻 入的核苷酸數目成正比；然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成；最后通過分析出峰值的 情況，達到測定DNA序列的目的。不過，現有技術中還沒有利用焦磷酸測序技術檢測STAT4基 因分型的產品。
[0011] 目前，在現有技術中，采用有"金標準"之稱的PCR-直接測序法對STAT4基因進行檢 測，但該方法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織及外周 血，對于突變細胞比率小于10%的腫瘤組織及外周血，常規PCR-直接測序法幾乎無能為力； 此外，該方法還存在成本高、檢測周期長及操作繁瑣的缺點。
【發明內容】
[0012] 為了解決上述方法檢測STAT4基因分型過程中存在敏感性不高、檢測周期長、操作 繁瑣及成本高的技術問題，本發明提供一種敏感性高、特異性強、檢測周期短、操作簡單并 有效滿足臨床檢驗要求的定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。
[0013] 本發明提供了一種定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對，所述引物對包 括：
[0014] STAT4正向擴增引物：
[0015] 5'-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3'（SEQ ID N0.1);
[0016] STAT4反向擴增引物：
[0017] 5'-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3'(SEQ ID NO.2)；
[0018] STAT4測序引物：5'-AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3'（SEQ ID N0.3);
[0019] 其中，所述STAT4反向擴增引物的5'端進行生物素標記。
[0020] 本發明還提供了一種定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序試劑盒，所述試劑盒 包括：
[0021] PCR反應液，所述PCR反應液含有STAT4正向擴增引物：
[0022] 5 '-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3 '；
[0023] STAT4反向擴增引物：
[0024] 5 '-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3 '；
[0025] STAT4測序引物：5 ' -AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3 ' ；
[0026]其中，所述STAT4反向擴增引物的5'端進行生物素標記。
[0027]在本發明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中，所述試劑盒還包括：
[0028] STAT4陽性對照品1，其為插有SEQ ID勵.5所示核苷酸序列的3了4了4野生純合子質 粒；
[0029] SEQ ID NO.5：
[0030] 5 '-ACACATATGGAAAGGTTCACACTTGACTGTTAATACGGATGTCTTTGAAGGTAGTGGTGTGGATGG AGGTAAGGAAAAAAGAAGTGGGATAAAAAGAAGTTTGTAATTAAAAAGCTACATGTATATTATGATCTACTTTATGG AAAATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAAAGTATGAAAAGTTGGTGACCAAAATGTGAATAGTGGTTATCTTATTTCA GTGGAATTTCAGGGGATTTTTTTTCTTTCTTCTTAGACTTTTCATTATCATTTGACTTTTTACAAAGATTTGCATTA TTTAAGCAATCAGAAAGAAATTATAAAGCTATTTTCATCATAACAAAAATTCCATTGGTAAAAAATTTTTAATTAAT TTACATAATGTGCAAAAATTAGAAAATTAGAACTCCTAAAGCAAGAAGTGGAAAAATTATTCCAATCTGAAGAAATA AAACCATTCTCTGATGACTTGGAAACTGAAGGGATTGCTAATAGCTC-3'；
[0031] STAT4陽性對照品2,其為所述STAT4野生純合子質粒與插有SEQ ID NO.6所示核苷 酸序列的STAT4突變純合子質粒組成的質粒混合物；
[0032] STAT4陽性對照品3,其為插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的STAT4突變純合子質 粒；
[0033] SEQ ID NO.6：
[0034] 5 '-ACACATATGGAAAGGTTCACACTTGACTGTTAATACGGATGTCTTTGAAGGTAGTGGTGTGGATGG AGGTAAGGAAAAAAGAAGTGGGATAAAAAGAAGTTTGTAATTAAAAAGCTACATGTATATTATGATCTACTTTATGG AAAATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAAAGTATGAAAAGTTGGTGACCAAAATGTTAATAGTGGTTATCTTATTTCA GTGGAATTTCAGGGGATTTTTTTTCTTTCTTCTTAGACTTTTCATTATCATTTGACTTTTTACAAAGATTTGCATTA TTTAAGCAATCAGAAAGAAATTATAAAGCTATTTTCATCATAACAAAAATTCCATTGGTAAAAAATTTTTAATTAAT TTACATAATGTGCAAAAATTAGAAAATTAGAACTCCTAAAGCAAGAAGTGGAAAAATTATTCCAATCTGAAGAAATA AAACCATTCTCTGATGACTTGGAAACTGAAGGGATTGCTAATAGCTC-3'；
[0035] 其中，質粒載體為pMD18-T質粒;所述STAT4陽性對照品2中所述STAT4突變純合子 質粒和所述STAT4野生純合子質粒的數量比為1:1。
[0036]在本發明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中，所述試劑盒還包括：質控品 (controloligo)和空白對照品，所述質控品的序列為:TAYGGTTTGCA(SEQIDN0.4) ;所述 空白對照品為超純水;質控品的序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測 PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。
[0037] 所述PCR反應液中其他組分為常規的IOx PCR Buffer、dNTPS和H2O,各組分按常規 體積比配置（l〇x PCR Buffer、dNTPs、H20和反應液中引物的體積比為5:3:37.5:1)。
[0038]所述試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑，如由DNA聚合 酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5 磷酰硫酸和熒光素 組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
[0039] 本發明還提供了如上所述的引物對在制備用于檢測STAT4基因分型的試劑中的應 用。
[0040] 相較于現有技術，本發明提供的定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對及 試劑盒具有以下有益效果：
[0041] -、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑 盒，使得所述試劑盒在檢測STAT4基因分型時，具有定性準確，靈敏度高及特異性強的優點； 此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機反應、直接 給出檢測位點頻率分析及結果直觀的優點；
[0042]二、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑 盒，使得所述試劑盒在檢測STAT4基因分型時，可實時監測反應進程、反應時間短、PCR產物 簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標準方法，即毛細 管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗；
[0043] 三、通過在所述試劑盒中設置了空白對照品、陽性對照品和質控品，使得所述試劑 盒在檢測STAT4基因分型時，可以更好的確保檢測結果的準確性。
【附圖說明】
[0044]圖1為臨床樣品STAT4野生型的焦磷酸測序圖；
[0045]圖2為臨床樣品STAT4突變雜合型的焦磷酸測序圖；
[0046]圖3為臨床樣品STAT4突變純合型的焦磷酸測序圖；
[0047]圖4為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序圖；
[0048]圖5為臨床STAT4空白對照品的焦磷酸測序圖；
[0049] 圖6至圖8為STAT4多組設計引物的焦磷酸測序圖；其中圖6和圖7的測序結果不準 確，圖8的測序結果真實可靠。
【具體實施方式】
[0050] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0051 ]實施例1:試劑盒的制備
[0052] 一、引物和探針的設計與合成
[0053] 針對人STAT4基因選擇特異的突變位點，使用PyroMark Assay Design2.0軟件，設 計引物；其中擴增引物和測序引物先經過PAGE純化，再經HPLC純化，其中SEQ ID NO. 2的5 ' 端進行生物素標記。
[0054]表1.突變位點與類型 L 0056] 擴增序列如表2:
[0057]表2.特異性擴增引物及引物序列
[0059] 二、對照品選擇
[0060] 使用人工合成的一段寡聚核苷酸鏈TAYGGTTTGCA control OligO為質控品； DNase/RNase-Free水為空白對照品。
[0061 ] 三、PCR反應液組成 [0062] 表3 .PCR反應液組成
[0064]實施例2:試劑盒的使用 [0065] 一、樣品檢測
[0066]溶解引物干粉（引物溶解后有效期為1個月）。按照模板數配制體系:取PCR反應液， 加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶，分裝體系，加入樣品DNA、空白對照品 或陽性對照品為模板，組成PCR反應體系。按照PCR反應程序進行PCR擴增。
[0067] STAT4體系各主要成分如下：
[0068] 表4.STAT4體系各主要成分
[0070]該體系反應程序如下： 1 表5 .PCR反應程序
[0073]擴增完成之后，瓊脂糖凝膠檢驗PCR結果，以進行下一步程序。
[0074]二、焦磷酸測序
[0075] 按照焦磷酸測序標準操作規程進行測序操作，主要步驟為:樣品的制備和純化，然 后將純化后的樣品加入含有退火液和測序引物的MIX中上機測序。焦磷酸測序儀試劑倉中 加入運行程序相應的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。質控品contro 1 〇 I i go 自帶測序引物，最終濃度為〇. 2μΜ。
[0076] 三、結果判斷
[0077] 質控品堿基檢出率為100% ;空白對照品檢出率為0。
[0078] 四、質控標準
[0079]各類對照質控品判斷結果如下表： 「00801 丟fi踣掉品烷準烚測結里
[0082] 五、結果報告：
[0083] 結果如圖1、圖2及圖3所示，樣品結果的判斷標準如下：
[0084] 表9.報告樣品檢測結果
[0086]圖1顯示的是臨床樣品檢測結果中STAT4的野生型，圖2顯示的是臨床樣品檢測結 果中STAT4的突變雜合型，圖3顯示的是臨床樣品檢測結果中STAT4的突變純合型，圖4及圖5 分別顯示的是臨床檢測結果中質控品control oligo及STAT4空白對照品的焦磷酸測序圖； 圖6至圖8顯示的是設計的STAT4多組引物的焦磷酸測序效果圖，其中圖8的引物為最佳，是 我們產品中選定的STAT4引物。
[0087] 本發明提供的定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有 益效果：
[0088] -、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑 盒，使得所述試劑盒在檢測STAT4位點時，具有定性準確，靈敏度高及特異性強的優點；此 外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機反應、直接給 出檢測位點頻率分析及結果直觀的優點；
[0089] 二、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑 盒，使得所述試劑盒在檢測STAT4位點時，可實時監測反應進程、反應時間短、PCR產物簡單 處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標準方法，即毛細管電 泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗；
[0090] 三、通過在所述試劑盒中設置了空白對照品、陽性對照品和質控品，使得所述試劑 盒在檢測STAT4位點時，可以更好的確保檢測結果的準確性。
[0091] 以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發 明說明書內容所作的等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關的技術領域，均同理包 括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1. 一種定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序引物對，其特征在于，所述引物對包括： STAT4正向擴增引物： 5，-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3，； STAT4反向擴增引物： 5 '-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3 '； STAT4測序引物：5 ' -AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3 ' ； 其中，所述STAT4反向擴增引物的5 '端進行生物素標記。2. -種定性檢測STAT4基因分型的焦磷酸測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： PCR反應液，所述PCR反應液含有STAT4正向擴增引物： 5，-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3，； STAT4反向擴增引物： 5 '-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3 '； STAT4測序引物：5 ' -AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3 ' ； 其中，所述STAT4反向擴增引物的5 '端進行生物素標記。3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括： STAT4陽性對照品1，其為插有SEQ ID勵.5所示核苷酸序列的3了4了4野生純合子質粒； STAT4陽性對照品2，其為所述STAT4野生純合子質粒與插有SEQIDN0.6所示核苷酸序 列的STAT4突變純合子質粒組成的質粒混合物； STAT4陽性對照品3，其為插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的STAT4突變純合子質粒； 其中，質粒載體為PMD18-T質粒。4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述STAT4陽性對照品2中所述STAT4突 變純合子質粒和所述STAT4野生純合子質粒的數量比為1:1。5. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：質控品和空白對照 品，所述質控品的序列為:TAYGGTTTGCA。6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述空白對照品為超純水。7. 權利要求1所述的引物對在制備用于檢測STAT4基因分型的試劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106086231SQ201610773331
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月30日
【發明人】滕祥云, 曾好
【申請人】長沙三濟生物科技有限公司