用cyp1a基因監測水中菲污染的方法

用cyp1a基因監測水中菲污染的方法
【專利摘要】本發明公開了一種用細胞色素P4501A(CYP1A)基因監測水中菲污染的方法，用魚作為監測水污染的生物樣本，所述魚的CYP1A基因作為監測水中菲污染的敏感生物標記物；本發明的優點在于：CYP1A基因作為監測水污染的敏感生物標記物，測試CYP1A基因的相對表達量，來監測水體污染的程度，該方法能靈敏反應出水體是否污染及污染程度，甚至能敏感地測出微量污染源的水體污染；同時也能從生物的角度敏感地監測菲污染的危害性和危害程度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。
【專利說明】
用CYP1A基因監測水中菲污染的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及水污染監測技術領域。更具體地說，本發明涉及一種用CYPlA基因監測 水中菲污染的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著城鎮化和工農業的迅猛發展，水體多環芳烴污染日益加劇，其中菲是多環芳 烴污染的典型代表。菲是水生動物非必需但高致毒元素，具有親脂強、易富集和難降解的特 性，不僅能引起動物腎、肝、睪丸損傷，肺水腫和骨軟化，而且與腎、肺、前列腺的癌變等相 關，對環境、人和其他動物健康造成嚴重威脅。用化學方法可以定性、定量檢測菲等多環芳 烴污染，但是無法檢測其危害性和危害程度。敏感生物標記物則可敏感地監測菲等多環芳 烴污染的危害性和危害程度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速 的科學方法。

【發明內容】

[0003] 本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供一種用CYPlA基因監測水中菲污 染的方法，通過魚的CYPlA基因作為敏感生物標記物，測試并計算CYPlA基因的相對表達量， 能敏感的表達出水體中菲污染的程度，方法簡單，易操作，能快速靈敏的檢測出水體污染程 度，更好的監測水體污染，以便及時控制和治理污染。
[0004] 為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種用CYPlA基因監測水中 菲污染的方法；
[0005] 本發明提供的技術方案為：
[0006] -種用CYPlA基因監測水中菲污染的方法，用魚作為監測水污染的生物樣本，魚的 CYPl A基因作為監測水中菲污染的敏感生物標記物。
[0007] 優選的是，建立魚的CYPlA基因的相對表達量與污染濃度關系的標準曲線， 獲取與建立標準曲線同類同大小的待測水域的魚，然后將計算得所述待測水域的魚的 CYPlA基因的相對表達量與標準曲線比對，獲得污染濃度。
[0008] 優選的是，計算CYPlA基因的相對表達量具體包括以下步驟：
[0009] 1)用魚作為監測水污染的生物樣本；
[0010] 2)利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈 cDNA；
[0011] 3)實時熒光定量PCR檢測，以首鏈cDNA為模板，分別根據所述CYPlA基因的特異性 引物，所述18s_rRNA基因引物，在羅氏PCR儀上進行實時熒光定量PCR擴增反應，熒光定量 PCR反應體系為：SYBR試劑12.5yL、上游引物F IyU下游引物R lyL、cDNA2yL、滅菌蒸餾水 8.5yL，反應體系總體積為25yL;反應程序采用三步法程序:95 °C預變性30s; 95°C 15s; 60°C 30S;72°C30s，40個循環，采集熒光信號數值Ct，Ct值是每個反應管內的熒光信號到達設定 的域值時所經歷的循環數；
[0012] 4)獲得CYPlA基因熒光信號數值CtCYPlA和內參基因熒光信號數值Ctl8s-rRNA后， 采取 2-法進行數據分析，ACt = CtCYPlA-Ctl8s-rRNA，
[0013] AACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)測試組-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白組，CYPlA 基 因的相對表達量=2^^，計算2^^得出CYPl A基因的相對表達量。
[0014] 優選的是，通過CYPlA基因的相對表達量來監測水污染的程度，值越大，污染 程度越大，反之，值越小，污染程度越小。
[0015]優選的是，所述魚為仔魚，將仔魚分成若干組，其中一組作為無污染對照組，其他 組為待測水域組;分別將仔魚放入無污染對照水體和待測水域水體中飼養;7天后隨機抽取 仔魚，檢測并計算CYPlA相對表達量，如果待測水域組的值大于無污染對照組的 值，那么待測水域受到菲污染，其污染源菲的濃度與待測水域組的 2-^&值呈正相關。
[0016] 優選的是，CYPlA基因的特異性引物為：
[0017] 上游引物如SEQ ID NO · 1 所示：CYPlA-F: 5 ' -TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3 '，
[0018] 下游引物如SEQ ID NO · 2所示：CYPlA-R: 5 ' -AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3 ' ；
[0019] 魚的內參基因為18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物為：
[0020]上游引物如SEQ ID NO · 3所示：18s-rRNA-F: 5 ' -TTGACCCAACACGGGAAACCT-3 '，
[0021 ]下游引物如SEQ ID NO · 4所示：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 '。
[0022]優選的是，所述魚為海水青鏘或淡水青鏘。
[0023]優選的是，仔魚均為10天齡幼魚。
[0024]本發明至少包括以下有益效果：
[0025] DCYPlA基因作為監測水污染的敏感生物標記物，測試CYPlA基因的相對表達量， 來監測水體污染的程度，該方法能靈敏反應出水體是否污染及污染程度，甚至能敏感地測 出微量污染源的水體污染；同時也能從生物的角度敏感地監測菲污染的危害性和危害程 度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。
[0026] 2)魚的CYPlA為細胞色素 P4501A基因能敏感反應水中微量的菲污染，CYPlA基因作 為監測水污染的敏感生物標記物，同時CYPlA相對表達量能敏感地表明與水中菲的濃度呈 正相關，該基因對其他污染源具有相對的穩定性，能單一準確地測出水中菲的污染，這樣為 治理水污染提供科學參考。
[0027] 本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本 發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【具體實施方式】
[0028] 結合下面實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書 文字能夠據以實施。
[0029] 實施例1
[0030] (1)水污染魚生物樣本飼養準備
[0031] 采用10天齡海水青鏘仔魚作為監測水污染的生物樣本，將仔魚分成6組，分別在表 1所述的菲濃度水環境中飼養，其中〇濃度的作為對照組，每組3個平行進行，飼養7天后，每 個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3 = 9個數據，將每組9個數據數理統計后得到各組魚 的CYPlA基因的相對表達量結果。：
[0032]表1 6組仔魚飼養的水域的菲濃度
[0034] 飼養的其他條件均為：鹽度：30 ± 2，水溫為28± 2°C，pH為8.10，溶氧量彡6. IOmg/ L，光暗比為14h:10h，每天三次投喂200目飼料，總投喂量為魚體重的5%，飼養7天后隨機采 集魚樣品測定。
[0035] 2、利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈 cDNA；
[0036] (1)快速稱取冷凍的仔魚IOOmg左右，記錄實際重量為M，然后放入提前預冷的研缽 中倒入液氮，用研杵研磨稱量好的仔魚樣品，直至研磨成粉末狀，然后用不銹鋼小藥匙迅速 將樣品粉末移入冰浴中的玻璃勻漿管底部。
[0037] (2)用移液槍往玻璃勻漿管中加入0.6mL RNAiso試劑，充分勻漿至勻漿液呈無顆 粒透明狀后，將勻漿液轉入1.5ml離心管中。然后再向勻漿管中加入0.2mL RNAiso試劑，洗 滌勻衆棒和勻衆管管壁一次，之后將勻衆液轉入之前的離心管中，重復上述操作一次，使加 入的RNAiso試劑總體積為lmL。蓋好離心管并顛倒混勻數次后室溫靜置5min。
[0038] (3)用1000 yL微量移液槍往上一步的1.5mL離心管中加入200yL氯仿，蓋緊離心管 蓋，混勻至溶液乳化后，再室溫靜置5min。
[0039] (4)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4°C，離心15min。
[0040] (5)小心從離心機中取出離心管，用1000 yL微量移液器吸取500yL上清液至一個新 的1.5ml離心管中。
[00411 (6)然后往新的1.5mL離心管中加入500yL異丙醇，蓋好離心管并充分顛倒混勻，室 溫靜置l0min。
[0042] (7)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4°C，離心10min。
[0043] (8)將1.5mL離心管中上清液倒掉，再12000g，4°C，離心lmin，用小槍頭（IOOyL)將 上清液吸凈。
[0044] (9)往離心管中加入現配的預冷的75%乙醇Iml(無水乙醇3: IDEPC水），蓋好離心 管并輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁及RNA，再12000g，4°C，離心Imin后小心去除乙醇。
[0045] (10)在超凈工作臺中打開離心管蓋，室溫干燥沉淀lOmin，加入50yL DEPC處理水 溶解沉淀，靜置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存待用。
[0046] (11)使用Thermo Scientific Nanodrop 2000c測定總的RNA的含量，獲得測定濃 度，RNA含量的計算公式：
[0047] 樣品RNA濃度(yg/mg)=測定濃度(ng/μL) X50X 1000+M。
[0048] (12)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，若測定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 間，且總RNA電泳條帶清晰呈現為28S，18S和5S三條帶，28S的條帶亮度約為18S的兩倍，說明 RNA純度和濃度符合要求，可繼續進行后續實驗；
[0049 ] (13)利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA;
[0050] (14)逆轉錄:用普通PCR儀將RNA反轉錄成首鏈cDNA，按照表2配制反轉錄反應液：
[0051 ]表2反轉錄反應液組成
[0053] 反應液配制方法:配置前先根據反轉錄樣品的數量計算出各反應液實際需要量， 統一加入無菌離心管中混合均勻，然后分裝到各個反應管中，最后添加樣品并小心點動離 心混勻，使反應更加充分并減少誤差。配制過程需在冰浴且無菌體系中進行，
[0054] 反轉錄反應條件：5CTC，20min495°C，5min45°C，5min4l5°C，15min。
[0055] 3、實時熒光定量PCR檢測目的基因
[0056] ⑴引物設計
[0057]所述CYPlA基因的特異性引物為：
[0058] 上游引物為：CYPlA-F: 5 ' -TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3 '，（ SEQ ID NO · 1)
[0059] 下游引物為：CYP1A-R:5'-AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3'；（SEQIDN0·2)
[0060] 所述魚的內參基因為18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物為：
[0061] 上游引物為：18s-rRNA-F:5'-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，（SEQIDN0·3)
[0062] 下游引物為：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO · 4)
[0063] (2)PCR檢測目的基因
[0064] PCR擴增反應用普通PCR儀擴增cDNA，按表3配制PCR反應液：
[0065] 表3 PCR反應液組成
L0067J 根據反轉錄樣品數量計算谷PCR反應試刑用量，配制反應混合液，點動離心混習， 然后分裝到RT-PCR反應結束后的PCR反應管中，再點動離心混勻。反應結束后，將PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0068] PCR擴增反應條件：95 cC，lmin- (94Γ，30sec-60 cC，30sec-72 cC，Imin，40個循 環)-72°C，5min4l5°C，pause〇
[0069] 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，條件為100V，30min。若PCR反應產物的條帶單 一，出現位置在100bp-200bp之間，可初步確定PCR產物為目的基因。
[0070] PCR產物純化與濃縮，PCR產物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測符合實驗要求后，取經純 化濃縮后的？〇?產物測序，測序結果經131^51'(111^。://\^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)比對后，確定 PCR擴增產物是目的基因片段，方可進行后續的熒光定量實驗。
[0071 ]本實驗米用的是TaKaRa公司的 S.YBlTPremix Ex Taq?(Perfect Real Time)試劑 盒，本試劑盒是在PCR擴增合成雙鏈DNA的過程中，熒光分子SYBfTGreen I與雙鏈DNA結合能 夠發出熒光信號，通過連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號的強弱變化，來及時分 析目的基因 CYPlA的拷貝數目，從而對目的基因的表達量進行實時準確定量。實時熒光定量 PCR的反應體系如表4:
[0072] 表4 RTQ-PCR反應體系組成
[0074] RTQ-PCR反應體系的配制必須在冰浴無菌條件下進行，試劑使用前需點動離心混 勻后才能使用，反應液配制、分裝均要使用無菌的新槍頭，以避免污染，而且配制的速度要 快，以免其中的反應酶失活。反應試劑添加完成后，使用配有八聯管轉頭的臺式離心機短暫 離心，確保試劑沉積在管底。
[0075] 熒光定量反應條件：95°C預變性3〇8;95°(：158;6〇1€3〇8;72 1€3〇8,40個循環；采集 熒光信號數值Ct;獲得CYPlA基因熒光信號數值CtCYPlA和內參基因熒光信號數值Ctl8s-rRNA 后，采取 2-法進行數據分析，ACt = CtCYPlA-Ct 18s-rRNA，
[0076] AACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)測試組-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白組，CYPlA 基 因的相對表達量= 2^^，計算2^^得出CYPlA基因的相對表達量;測定并經數理統計的結 果如表5所不：
[0077] 表5 6組魚樣品的CYPlA基因的相對表達量2_^et
[0079] 受到水域中菲的污染脅迫，魚樣本生理機能發生變化，通過CYPlA基因的相對表達 量來監測水污染的程度，值越大，菲濃度大，很直觀的說明水域受污染的程度越大，反 之值越小，菲濃度越小，說明水域受污染的程度越小，測試組的值大于對照組的 值時說明水體已經受菲污染，而且幅度越大污染越嚴重。
[0080] 通過表5的數據結果，建立魚的CYPlA基因的相對表達量與菲濃度的標準曲 線，獲取與建立標準曲線同類同大小的待測水域的魚，然后將計算得所述待測水域的魚的 CYPlA基因的相對表達量與標準曲線比對，獲得菲濃度大小。
[0081 ] 實施例2
[0082] 1、水污染魚生物樣本飼養準備
[0083]采用海水青鏘仔魚作為監測水污染的生物樣本，將仔魚分成2組，這2組分為無污 染對照組與待測水域組，將仔魚分別放入無污染水體和待測水域水體中飼養，每組3個平行 進行，7天后每個平行隨機取3尾魚樣品測定，每組測定3x3 = 9個數據，將每組9個數據數理 統計后得到各組魚的結果。。
[0084] 2、按照分組，利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄 合成首鏈cDNA;
[0085] (1)快速稱取冷凍的仔魚IOOmg左右，記錄實際重量為M，然后放入提前預冷的研缽 中倒入液氮，用研杵研磨稱量好的仔魚樣品，直至研磨成粉末狀，然后用不銹鋼小藥匙迅速 將樣品粉末移入冰浴中的玻璃勻漿管底部。
[0086] (2)用移液槍往玻璃勻漿管中加入0.6mL RNAiso試劑，充分勻漿至勻漿液呈無顆 粒透明狀后，將勻漿液轉入1.5ml離心管中。然后再向勻漿管中加入0.2mL RNAiso試劑，洗 滌勻衆棒和勻衆管管壁一次，之后將勻衆液轉入之前的離心管中，重復上述操作一次，使加 入的RNAiso試劑總體積為lmL。蓋好離心管并顛倒混勻數次后室溫靜置5min。
[0087] (3)用1000 yL微量移液槍往上一步的1.5mL離心管中加入200yL氯仿，蓋緊離心管 蓋，混勻至溶液乳化后，再室溫靜置5min。
[0088] (4)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4°C，離心15min。
[0089] (5)小心從離心機中取出離心管，用1000 yL微量移液器吸取500yL上清液至一個新 的1.5ml離心管中。
[0090] (6)然后往新的1.5mL離心管中加入500yL異丙醇，蓋好離心管并充分顛倒混勻，室 溫靜置l〇min。
[0091] (7)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4°C，離心10min。
[0092] (8)將1.5mL離心管中上清液倒掉，再12000g，4°C，離心lmin，用小槍頭（IOOyL)將 上清液吸凈。
[0093] (9)往離心管中加入現配的預冷的75%乙醇Iml(無水乙醇3: IDEPC水），蓋好離心 管并輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁及RNA，再12000g，4°C，離心Imin后小心去除乙醇。
[0094] (10)在超凈工作臺中打開離心管蓋，室溫干燥沉淀lOmin，加入50yL DEPC處理水 溶解沉淀，靜置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存，待用。
[0095] (11)使用Thermo Scientific Nanodrop 2000c測定總的RNA的含量，獲得測定濃 度，
[0096] RNA含量的計算公式：
[0097]樣品RNA濃度(yg/mg)=測定濃度(ng/μL) X50X1000+M。
[0098] (12)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，若測定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 間，且總RNA電泳條帶清晰呈現為28S，18S和5S三條帶，28S的條帶亮度約為18S的兩倍，說明 RNA純度和濃度符合要求，可繼續進行后續實驗；
[0099 ] (13)利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA;
[0100] a)逆轉錄:用普通PCR儀將RNA反轉錄成首鏈cDNA，按照表2配制反轉錄反應液：
[0101]表2反轉錄反應液組成
[0103] 反應液配制方法:配置前先根據反轉錄樣品的數量計算出各反應液實際需要量， 統一加入無菌離心管中混合均勻，然后分裝到各個反應管中，最后添加樣品并小心點動離 心混勻，使反應更加充分并減少誤差。配制過程需在冰浴且無菌體系中進行，
[0104] 反轉錄反應條件：50°C，20min-95°C，5min-5°C，5min-15°C，15min。
[0105] 4、實時熒光定量PCR檢測目的基因
[0106] ⑴引物設計
[0107]所述CYPlA基因的特異性引物為：
[0108] 上游引物為：CYPlA-F: 5 ' -TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3 '，（ SEQ ID NO · 1)
[0109] 下游引物為：CYP1A-R:5'-AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3' ；（SEQIDN0·2)
[0110] 所述魚的內參基因為18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物為：
[0111] 上游引物為：18s-rRNA-F:5'-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，（SEQIDN0·3)
[0112] 下游引物為：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO · 4)
[0113] (2)PCR檢測目的基因
[0114] PCR擴增反應用普通PCR儀擴增cDNA，按表3配制PCR反應液：
[0115] 表3PCR反應液組成
[0117] 根據反轉錄樣品數量計算各PCR反應試劑用量，配制反應混合液，點動離心混勻， 然后分裝到RT-PCR反應結束后的PCR反應管中，再點動離心混勻。反應結束后，將PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0118] PCR擴增反應條件：95 °C，lmin- (94°C，30sec-60 °C，30sec-72 °C，Imin，40個循 環)-72°C，5min4l5°C，pause〇
[0119] 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，條件為100V，30min。若PCR反應產物的條帶單 一，出現位置在100bp-200bp之間，可初步確定PCR產物為目的基因。
[0120] PCR產物純化與濃縮，PCR產物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測符合實驗要求后，取經純 化濃縮后的？〇?產物測序，測序結果經131^51'(111^。://\^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)比對后，確定 PCR擴增產物是目的基因片段，方可進行后續的熒光定量實驗。
[0121] 本實驗采用的是TaKaRa公司的SYBR*Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)試劑 盒，本試劑盒是在PCR擴增合成雙鏈DNA的過程中，熒光分子SYBIf Green I與雙鏈DNA結合能 夠發出熒光信號，通過連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號的強弱變化，來及時分 析目的基因 CYPlA的拷貝數目，從而對目的基因的表達量進行實時準確定量。實時熒光定量 PCR的反應體系如表4:
[0122] 表4 RTQ-PCR反應體系組成
[0124] RTQ-PCR反應體系的配制必須在冰浴無菌條件下進行，試劑使用前需點動離心混 勻后才能使用，反應液配制、分裝均要使用無菌的新槍頭，以避免污染，而且配制的速度要 快，以免其中的反應酶失活。反應試劑添加完成后，使用配有八聯管轉頭的臺式離心機短暫 離心，確保試劑沉積在管底。
[0125] 熒光定量反應條件：95°C預變性3〇8;95°(：158;6〇1€3〇8 ;721€3〇8,40個循環；采集 熒光信號數值Ct;采用上述參數，多次循環測試，相對其他參數來說采集到的熒光信號數值 Ct誤差小;獲得CYPlA基因熒光信號數值CtCYPlA和內參基因熒光信號數值Ctl8s-rRNA后， 采取 2-法進行數據分析，ACt = CtCYPlA-Ctl8s-rRNA，
[0126] AACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)測試組-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白組，CYPlA 基 因的相對表達量= 2^^，計算2^^得出CYPlA基因的相對表達量，采取2^^法進行數據 分析能減少誤差，能夠準確表述CYPlA基因的相對表達量從而精準反映出水污染程度;檢測 結果:對照組的值為1.82，待測組的2_M Gt值為2.15，結果顯示對照組的2_MGt值小于 待測組的2-^&值，所述待測水域已經受到了菲污染，需及早進行水域治理，而化學的方法 測試菲，一般采用氣質聯用法測試，該方法成本高，誤差相對本發明來說也較大。本發明所 提到的空白組為所使用的試劑盒的空白對照，目的是為了減小誤差。
[0127] 盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可輕易改作他 用，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節 和這里示出與描述的實施例。 SEQUENCE LISTMO <110>廣西大學 <120> -種用CYPlA基因監測水中菲污染的方法 <160> 4 <170> PaicnlIn version 3.5 <2i0> I <2Π>20 <212> DNA <213>人工序到 <400> 1 TTTGTCCAAG TGACAGGCAG 20 <210>2 <211> 20
[0128] <212> DNA <213>人工序列 <400 2 A AG TGGC ATA GTGCTCGCTO 20 <2103 <211>21 <212> DNA <213>人工序呵 <400> 3 TTGACCCAAC ACGGGAAACC T 21 <210>4 <211〉2.3 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4
[0129] CA A ATCGCTC CACCAACmA GAA 23
【主權項】
1. 一種用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，用魚作為監測水污染的生物 樣本，魚的CYP1A基因作為監測水中菲污染的敏感生物標記物。2. 根據權利要求1所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，建立魚的 CYP1A基因的相對表達量與污染濃度關系的標準曲線，獲取與建立標準曲線同類同大 小的待測水域的魚，然后將計算得所述待測水域的魚的CYP1A基因的相對表達量2 4Aet與標 準曲線比對，獲得污染濃度。3. 根據權利要求2所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，計算CYP1A 基因的相對表達量具體包括以下步驟： 1) 用魚作為監測水污染的生物樣本； 2) 利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA; 3) 實時熒光定量PCR檢測，以首鏈cDNA為模板，分別根據所述CYP1A基因的特異性引物， 18s-rRNA基因引物，在羅氏PCR儀上進行實時熒光定量PCR擴增反應，熒光定量PCR反應體系 為:SYBR試劑12.5yL、上游引物F lyL、下游引物R lyL、cDNA 2yL、滅菌蒸餾水8.5yL，反應體 系總體積為25以1^反應程序采用三步法程序：95°(：預變性3〇8;95°(：158 ;6〇1€3〇8;721€ 30s，40個循環，采集熒光信號數值Ct，Ct值是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時 所經歷的循環數； 4) 獲得CYP1A基因熒光信號數值CtCYPlA和內參基因熒光信號數值Ctl8s-rRNA后，采取 2-ΛΔα法進行數據分析，Δ Ct = CtCYPlA-Ctl8s-rRNA， Δ ACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)測試組-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白組，CYP1A基因的 相對表達量= 2_AAet，計算2_AAet得出CYP1A基因的相對表達量。4. 根據權利要求3所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，通過CYP1A 基因的相對表達量來監測水污染的程度，2_λ Aet值越大，污染程度越大，反之，2_λ Aet值越小， 污染程度越小。5. 根據權利要求4所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，所述魚為 仔魚，將仔魚分成若干組，其中一組作為無污染對照組，其他組為待測水域組;分別將仔魚 放入無污染對照水體和待測水域水體中飼養;7天后隨機抽取仔魚，檢測并計算CYP1A相對 表達量，如果待測水域組的2 4Aet值大于無污染對照組的24Aet值，那么待測水域受到 菲污染，其污染源菲的濃度與待測水域組的2^ Aet值成正相關。6. 根據權利要求1-5任一項所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于， CYP1A基因的特異性引物為： 上游引物如SEQIDN0.1所示：CYPlA-F:5'-TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3'，下游引物如 SEQ ID N0.2m*:CYPlA-R:5'-AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3'； 魚的內參基因為18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物為： 上游引物如SEQIDNO·3所示：18s-rRNA-F:5'-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，下游引物 如SEQ ID NO · 4所示：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 '。7. 根據權利要求5所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，所述魚為 海水青鏘或淡水青鏘。8. 根據權利要求5所述的用CYP1A基因監測水中菲污染的方法，其特征在于，所述仔魚 均為10天齡仔魚。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086202SQ201610545363
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】許友卿, 丁兆坤, 劉永強, 劉富娟
【申請人】廣西大學