一種針對膨脹污泥中Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物和方法
【專利摘要】一種針對膨脹污泥中Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物和方法，涉及污水生物處理領域。(1)正向引物(5’?AGTTCAGGCGCTCCGGGA?3’)；反向引物(5’?GGYTACCTTGTTACGACTT?3’)。(2)聚合酶鏈式反應方法的反應體系：2倍濃度的Taq PreMix試劑10μl；DNA模板0.5?1μl；正向引物和反向引物(濃度為10μm/L)各0.5?1μl；加滅菌水到總體積20μl。按上述引物、反應體系進行(PCR)反應，并將擴增產物在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳中跑膠，得到分離良好的DNA亮條帶(圖1)。本發明對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性高，能夠更高效地進行PCR試驗，方便后續對其菌群進行準確定性和定量分析。
【專利說明】
一種針對膨脹污泥中E ike I boom Type 0092型絲狀菌群特異 性引物和方法
技術領域
[00011 本發明涉及污水生物處理領域，提供一種針對膨脹污泥中Eikelboom Type 0092 型絲狀菌群特異性引物和方法，與其他引物相比，該引物對Eikelboom Type 0092型絲狀菌 群特異性高，能夠高效準確地進行Eikelboom Type 0092型絲狀菌群的PCR試驗，對后續 Eikelboom Type 0092型絲狀菌群進行準確定性和定量分析。
【背景技術】
[0002] 目前，活性污泥法污水處理廠及活性污泥法工藝時常發生以Eikelboom Type 0092型絲狀菌群引起的污泥膨脹問題。目前對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群的鑒定通 常采用較早的Eikelboom絲狀菌鑒定方法及熒光原位雜交(FISH)技術。隨著聚合酶鏈式反 應(PCR)和實時定量PCR試驗技術的發展，給Eikelboom Type 0092型絲狀菌群的鑒定及定 量提供了新的技術方法。
[0003] 然而，目前針對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群進行PCR試驗的引物稀少，且現 有引物的特異性不是很高，在進行PCR過程中同時可能擴增大量非目的菌種，對后續的序列 分析及對該菌群準確定量帶來不便。
[0004] 因此，目前缺乏針對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群的特異性引物和方法，對 Eikelboom Type 0092型絲狀菌群進行更高效準確的PCR試驗分析，以便后續對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群進行準確定性和定量分析。
【發明內容】
[0005] 針對上述研究的不足之處，本發明提供針對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特 異性引物和方法，對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性高，能夠高效地進行 Eikelboom Type 0092型絲狀菌群的PCR試驗，方便后續對其菌群進行準確定性和定量分 析。
[0006] 1.一種針對膨脹污泥中Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物，其特征在 于：
[0007] 正向引物序列為5'-厶61'1^^6606(^〇1^^^-3'；
[0008] 反向引物序列為5'-60￥丁厶〇：11^11^6厶(：1'1'-3'。。
[0009] 2.包含所述引物的試劑盒。
[0010] 3.使用所述引物進行PCR擴增的方法，其特征在于:包括變性、復性和延伸。
[0011] 聚合酶鏈式反應方法的反應體系：
[0012] 2倍濃度的Taq PreMix試劑10μ1 ;DNA模板0·5-1μ1;濃度為ΙΟμπι/L的正向引物和濃 度為ΙΟμπι/L的反向引物各0.5-1μ1;加滅菌水到總體積20μ1。
[0013] 聚合酶鏈式反應的反應程序：
[0014] ①1個循環:溫度為94°C時間為2-5min。
[0015] ②30個循環：依次為變性溫度94°C，時間20-45S;復性溫度50-58°C，時間30s-lmin;延伸溫度72°C，時間2min。
[0016] ③1個循環:溫度72°C，時間5-10min。
[0017] 與現有引物相比，本發明具有以下優點：
[0018] (1)本發明提供的Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物和方法能更高效 地進行Eikelboom Type 0092型絲狀菌群PCR試驗。
[0019] (2)本發明提供的Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物可以更準確地進 行后續Eikelboom Type 0092型絲狀菌群定性及定量分析。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明文獻中Eikelboom Type 0092型絲狀菌群基因序列
[0021] 圖2為本發明NCBI數據庫中搜索的Eikelboom Type 0092型絲狀菌基因序列
[0022] 圖3為本發明Eikelboom Type 0092型絲狀菌群PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖和具體實施方法對本發明作進一步詳細說明，本發明提供的 Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物和方法包括以下內容：
[0024] (1)在文獻和NCBI庫里查找Eikelboom Type 0092型絲狀菌群序列（圖1和圖2); [0025] (2)對Eikelboom Type 0092型絲狀菌群各序列與其他菌序列進行比對分析，選擇 設計其特異性引物的模板序列：X85210.1、AB445103.1、AB445104.1、AB445105.1和 AB445106.1(NCBI 檢索號）；
[0026] (3)根據引物設計的一般原則（引物長度、引物GC含量、引物Tm、引物3'端和5'端注 意事項、引物序列與模板序列組成的相似性、AG值等)進行引物的設計，主要進行設計引物 類型、搜索模式、前后引物搜索范圍、產物大小、引物長度等參數設置；
[0027] (4)得到前后引物后分析其有無① Hairpin:引物自身是否會形成發夾結構；② Dimer:同一種引物是否會形成二聚體;③False primiring:引物在待擴增序列中其他位置 是否有配對;④Cross Dimer:正向與反向引物間是否會形成二聚體，同時查看引物各指標 是否符合引物設計原則；
[0028] (5)按需要對設計的引物進行結合位點、酶切位點等相應編輯；
[0029] (6)準備200μ1離心管，依次加入2倍濃度的Taq PreMix試劑10yl;DNA模板ΙμL;正 向引物和反向引物（ΙΟμπι/L)各0.5μ1;加滅菌水到總體積20μ1;同時用滅菌水代替DNA模板 進行陰性對照試驗。
[0030] (7)對PCR儀設定反應程序:①1個循環:溫度為94 °C時間為4min。②30個循環:依次 為變性溫度94°C，時間40s;復性溫度50°C，時間50s;延伸溫度72°C，時間2min。③1個循環： 溫度72°C，時間lOmin。
[0031] (8)將PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳試驗，觀察目的DNA條帶的分離效果 良好(圖3)，進行下一步。
[0032] (9)將目的條帶進行凝膠回收和連接轉化后送測序公司測序，將測序序列與目的 菌種的DNA序列對比分析，發現與目的菌群序列一致。
[0033]以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種針對膨脹污泥中Eikelboom Type 0092型絲狀菌群特異性引物，其特征在于： 正向引物序列為5'-六61'1^^6606(^〇1^^^-3'； 反向引物序列為5'-66丫了厶〇：11^7^06厶(：1'1'-3'。2. 包含如權利要求1所述引物的試劑盒。3. 使用如權利要求1所述引物進行PCR擴增的方法，其特征在于：包括變性、復性和延 伸。4. 如權利要求3所述方法，其特征在于： 聚合酶鏈式反應方法的反應體系： 2倍濃度的Taq PreMix試劑10yl;DNA模板0.5-1μ1;濃度為ΙΟμπι/L的正向引物和濃度為 ΙΟμπι/L的反向引物各0.5-1μ1;加滅菌水到總體積20μ1。5. 如權利要求3所述方法，其特征在于： 聚合酶鏈式反應的反應程序： ① 1個循環:溫度為94 °C時間為2-5min。 ② 30個循環：依次為變性溫度94°C，時間20-45s;復性溫度50-58°C，時間30s-lmin;延 伸溫度72°C，時間2min。 ③ 1個循環:溫度72°C，時間5-10min。
【文檔編號】C12N15/11GK106086170SQ201610417829
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610417829.0, CN 106086170 A, CN 106086170A, CN 201610417829, CN-A-106086170, CN106086170 A, CN106086170A, CN201610417829, CN201610417829.0
【發明人】焦二龍, 高春娣, 李任飛, 田燁, 樊士信, 彭永臻
【申請人】北京工業大學