鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的est?ssr引物組、制備方法及其在物種鑒定中的應用
【專利摘要】一種鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的EST?SSR引物組，其特征在于：該引物組由5對引物組成，具體的引物的序列表為如下所示：DN13 F:ATTTGATTGGTTCTGCTCATCC R:TTCTTGTTCTCTTCCAGCTTCCDN58 F:CTAATGCAGGTTCTCCTCACCT R:GTTCAGCTCATCTCCTTGGATTDN65 F:GATAAGGGGAAGGAGGAGAAGA R:AATCTATGCCAATCACTCCACADN67 F:GCACACATCCACTCACCCT R:GGGTATAGAGAGAAATGCTGCGDN99 F:GGCACAGGTACTAGCAACAACA R:AGGTGATGGCAAAGTTCCAA。具有能降低條帶判讀的錯誤或偏差，同時也能夠反映出群體或個體的遺傳變異、并利于功能基因的研究優點。
【專利說明】
鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的EST-SSR引物組、制備方法及其在 物種鑒定中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及鐵皮石斛技術領域，具體涉及一種鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的EST-SSR引物組、制備方法及其在物種鑒定中的應用。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛（學名：Dendrobium off icinale Kimura et Migo)，又名：黑節草、仙斛 蘭韻、紫縈仙株。屬微子目，蘭科多年生附生草本植物。莖直立，圓柱形，長9-35厘米，粗2-4 毫米，萼片和花瓣黃綠色，近相似，長圓狀披針形，長約1.8cm，寬4~5mm，花期3~6月。主要 分布于中國安徽、浙江、福建等地，其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥。我國現有的76種石斛屬 植物中，具藥用的就有40多種.其藥理主要是強陰益精、補腎益力、明目和延年益壽。近年 來，國內對鐵皮石斛資源進行了大量研究，國外，Pyati AN等對5種石斛的離體培養也獲得 了一定程度的成功，但在石斛離體培養工作中，試驗設計粗糙，數據缺乏可比性，對石斛離 體條件下的遺傳穩定性和生理穩定性缺乏基礎性研究，未能獲得規范化石斛繁殖技術體系 和工藝流程，從而極大地阻礙了這一名貴中草藥走向場。
[0003] 分子標記鑒定是當今流行的比傳統形態鑒定方法更科學和靈敏的重要方法之一， 是構建高密度分子遺傳圖譜、分析物種分類與演化、染色體結構、遺傳多樣性、品種保護與 純度鑒定的有效工具;但是，普通基因組SSR(gSSR)引物擴增條帶穩定性較弱，不能反映出 個體或群體的遺傳變異，且引物通用性較弱。
[0004] EST-SSR標記不僅具有基因組SSR標記中技術簡單、重復性好、多態性高和共顯性 遺傳等特點，還具有引物開發廉價、通用性較好、條帶清楚、容易統計等優點。此外，由于 EST-SSR是編碼基因的一部分，能夠直接獲得基因表達的相關信息，這有可能直接鑒定決定 重要表型性狀的等位基因。隨著NCBI中EST數據庫不斷地豐富與完善，使用其序列開發SSR 標記也已成為一種十分簡便而有效的方法，時至今日，EST-SSR標記已在眾多植物中得到廣 泛的應用。目前，石斛屬植物的DNA分子鑒定方面主要采用RAPD、AFLP、ISSR、SRAP和SSR等分 子標記技術，如苑鶴等[1]利用RAPD對人工栽培鐵皮石斛居群的遺傳多樣性進行了相關研 究，發現其親緣關系的遠近與其地理種源具有顯著的相關性，而與栽培地點無關;王慧中等
[2]利用AFLP對13種石斛屬植物進行了遺傳多樣性的分析，其結果與傳統分類學的結果基 本一致;李明焱等[3]利用ISSR進行了鐵皮石斛新品種的選育工作;樊洪泓等[4]利用SRAP 對藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關系進行了相關研究;邱道壽等[5]對石斛屬植物進行了 SSR標記的開發及可轉移性分析。但至目前為止，有關鐵皮石斛的EST-SSR標記卻極少見于 報道。本文利用本課題組前期開發的鐵皮石斛EST-SSR引物用于鐵皮石斛種質資源的遺傳 多樣性分析和物質鑒定等方面。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術的上述不足，提供一種能降低條帶判讀的錯誤或偏差，同時 也能夠反映出群體或個體的遺傳變異、并利于功能基因的研究的鑒定鐵皮石斛與串珠石斛 的EST-SSR引物組。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：一種鑒定鐵皮石斛與串珠石 斛的EST-SSR引物組，該引物組由5對引物組成，5對引物組的序列表為如下所示(序列表SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 10的核苷酸序列）：
[0007] DNl3 F:ATTTGATTGGTTCTGCTCATCC R:TTCTTGTTCTCTTCCAGCTTCC
[0008] DN58 F:CTAATGCAGGTTCTCCTCACCT R:GTTCAGCTCATCTCCTTGGATT
[0009] DN65 F:GATAAGGGGAAGGAGGAGAAGA R:AATCTATGCCAATCACTCCACA
[0010] DN67 F:GCACACATCCACTCACCCT R:GGGTATAGAGAGAAATGCTGCG
[0011] DN99 F:GGCACAGGTACTAGCAACAACA R:AGGTGATGGCAAAGTTCCAA 〇
[0012]本發明還提供一種上述鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的EST-SSR引物組的開發方法， 包括：（1)基因組DNA提取
[0013] DNA的提取采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公 司）提取鐵皮石斛基因組DNA，Eppendorf公司生產的Bio-Photometr核酸檢測儀檢測DNA濃 度和純度，根據計算所得的DNA濃度，將DNA樣品溶液用TE稀釋成50ng · uL-1-201:保存備 用；
[0014] (2)序列來源獲得
[0015] 登錄到NCBI 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在搜索欄中輸入Dendrobium nobile(金釵石斛），得到15383條EST序列（截至2015年9月18日），利用NCBI中金釵石斛的 EST序列進行后續的SSR位點查找及其引物設計；
[0016] (3)SSR位點查找
[0017] 在線搜索軟件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)對所有 EST序列進行SSR位點搜索(http: //www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索標準 為：二、三、四、五和六核苷酸的最小重復次數分別為10、6、5、4、3次，EST序列長度大于 IOObp，SSR起始點位置距離5 '和3 '應不小于20bp。
[0018] (4)SSR引物設計
[0019]用Primer 5和Oligo 7軟件進行引物設計和評價，設計引物時設置的主要參數為： GC含量40%~70%，退火溫度50~62°C，引物長18~24bp，上下游引物Tm值之差應在1°C范 圍之內，預期擴增產物長度100~500bp，盡量避免引物二聚體、發夾結構和錯配等情況的發 生，得分超過90分方為合格，才能被用于合成、使用;共設計出合格的SSR引物有106對，引物 命名為Dn加序號，即Dn-I~Dn-106;
[0020] (5)EST-SSR 引物篩選
[0021] 將106對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最適 復性溫度的篩選于Eppendorf公司生產的MastercycIer普通梯度PCR儀上進行。2 X Taq PCR MasterMix購自天根生物公司（北京），PCR反應體系為20yL，其中包括：10yL的2XTaq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和優化的反應緩沖液），0.4yL的模板DNA(50ng · yL-1)，0.8yL的 引物對(5μπιο1 · yL-4 X2,8yL的ddH20。反應程序為94°C預變性5min，然后進行35個循環，每 個循環包括94°C變性30s，復性（48-64°C)30s，72°C延伸30s，最后72°C延伸10min，4°C保 存。隨機選擇6份鐵皮石斛種質資源用于引物以及最適退火溫度的篩選，各引物對的最適退 火溫度通過梯度PCR試驗確定。篩選出有目標條帶和最適退火溫度的引物。
[0022]本發明還涉及一種上述的EST-SSR引物在鐵皮石斛和串珠石斛物種鑒定中的應 用。
[0023]本發明的優點和有意效果：
[0024] 1.本發明的EST-SSR引物組擴增出的條帶為功能基因的一部分，序列相對保守，其 擴增條帶結果較gSSR更穩定，這能降低條帶判讀的錯誤或偏差，同時也能夠反映出群體或 個體的遺傳變異，同時也利于功能基因的研究。
[0025] 2.本發明的的EST-SSR引物組能夠穩定、快速的鑒定出鐵皮石斛和串珠石斛物種。
【附圖說明】
[0026] 圖1引物0價3、0陽8、0呢5、0_9和0呢7在16份供試材料中的擴增。
【具體實施方式】：
[0027] 下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限于以下實施例。 [0028] 實施例
[0029]本發明的引物組序列為：
[0030] DNl3 F:ATTTGATTGGTTCTGCTCATCC R:TTCTTGTTCTCTTCCAGCTTCC
[0031] DN58 F:CTAATGCAGGTTCTCCTCACCT R:GTTCAGCTCATCTCCTTGGATT
[0032] DN65 F:GATAAGGGGAAGGAGGAGAAGA R:AATCTATGCCAATCACTCCACA
[0033] DN67 F:GCACACATCCACTCACCCT R:GGGTATAGAGAGAAATGCTGCG
[0034] DN99 F:GGCACAGGTACTAGCAACAACA R:AGGTGATGGCAAAGTTCCAA〇
[0035] 試驗材料
[0036] 本試驗米集了 15份鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)種質資 源和一份串珠石斛(D0-5為串珠石斛，作為外來群，其余為鐵皮石斛），D0-1采自廣東饒平， D0-2采自云南思茅，D0-3采自安徽合肥，D0-4采自福建龍巖，D0-5采自浙江溫州，D0-6采自 福建武夷山，D0-7采自湖南新寧崑山，D0-8采自浙江瑞安，D0-9采自浙江蕭山，D0-10采自浙 江溫嶺雁蕩山，DO-11采自云南紅河，D0-12采自浙江麗水，D0-13采自云南文山，D0-14采自 浙江富陽，DO-15采自浙江臨安，DO-16采自浙江富陽.
[0037] 具體的步驟和鑒定鐵皮石斛的過程為：
[0038] (1)基因組DNA提取:本發明上述（1)基因組DNA提取，具體的操作條件如下:采用試 劑盒法提取鐵皮石斛基因組DNA，具體步驟如下：
[0039] (1 · 1)稱取=IOOmg新鮮植物作為樣品；
[0040] (1.2)將樣品轉入研缽中，加液氮浸沒樣品，然后迅速研磨，反復2-3次，研磨至細 粉末狀，立即加入0.8ml Buffer PFGl和5ul RNase Al,快速研磨使Buffer PFHGl完全覆蓋 在樣品上，溫室放置，待樣品完全融化后倒入1.5ml離心管中，劇烈搖晃混合均勻；
[0041 ] (1.3) 65 °C溫育1小時左右，溫育期間劇烈搖晃混合1-2次；
[0042] (1.4)冰浴2min，加入 125ul Buffer PFG2混合均勻；
[0043] (1.5)離心2min，仔細吸取蘭700ul上清，轉入干凈的1.5ml離心管中；
[0044] (1.6)加入 125ul Buffer PFG3混合均勻，離心2min;
[0045] (1.7)實驗準備:將DNA吸附柱-C30置于收集管中并做好標記:在干凈的1.5ml離心 管中加入150ul異丙醇；
[0046] (1.8)吸取步驟6中蘭650ul上相，轉入步驟7準備的已加入異丙醇的1.5ml離心管 中，緩慢吹打5次混合均勻，轉入DNA吸附柱-C30;
[0047] (1.9)離心lmin，棄收集管，將DNA吸附柱-C30放入另外一個干凈的收集管中；
[0048] (1.10)在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WAG，離心lmin，棄收集管，將DNA吸 附柱-C30放入另外一個干凈的收集管中；
[0049] (1.11)在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WB1，離心lmin，棄廢液，將DNA吸附 柱-C30放回收集管中。
[0050] (1.12)重復步驟11。
[0051] (1 · 13)離心 2min;
[0052] (1.14)將DNA吸附柱-C30轉入試劑盒攜帶的1.5ml離心管中，向硅膠的中央加大約 IOOul TE，將1.5ml離心管的蓋子扣在DNA吸附柱上，做好標記，去除DNA吸附柱的蓋子，室溫 放置l-2min或者更長時間，12，000 X g離心Imin;之后采用核酸檢測儀檢測DNA濃度和純度， 然后將DNA樣品溶液用TE稀釋成50ng · uL-1-201:保存備用；
[0053] (2)序列來源：登錄到NCBI中（http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)，在搜索欄中輸入 Dendrobium officinale，僅得到800條EST序列（截至2015年9月18日），遠不能滿足試驗要 求，故在搜索欄中輸入其近緣種Dendrobium nobiIe(金釵石斛），得到15383條EST序列（截 至2015年9月18日），利用NCBI中金釵石斛的EST序列進行后續的SSR位點查找及其引物設 計。
[0054] (3)SSR位點查找：在線搜索軟件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)對所有 15383條EST序列進行 SSR 位點搜索（http: // www. gramene. org/db/searches/ssrtool)，搜索標準為:二、三、四、五和六核苷酸的最小重 復次數分別為10、6、5、4、3次431'序列長度大于10(^?，338起始點位置距離5'和3'應不小于 20bp〇
[0055] (4)SSR引物設計：用Primer 5和Oligo 7軟件進行引物設計和評價。設計引物時設 置的主要參數為:GC含量40%~70%，退火溫度50~62°C，引物長18~24bp，上下游引物Tm 值之差應在1°C范圍之內，預期擴增產物長度100~500bp，盡量避免引物二聚體、發夾結構 和錯配等情況的發生，得分超過90分方為合格，才能被用于合成、使用。共設計出合格的SSR 弓丨物有106對，引物命名為Dn加序號，即Dn-I~Dn-106。
[0056] (5)EST-SSR引物篩選:將106對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有 限公司合成。引物最適復性溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Mastercyc Ier普通梯度PCR 儀上進行。2XTaq PCR MasterMix購自天根生物公司（北京），PCR反應體系為20yL，其中包 括：l〇yL的2XTaq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和優化的反應緩沖液），0.4yL的模板 DNA(50ng · yL-1LOAyL的引物對（5ymol · yL-的ddH20。反應程序為94°C預變性 5min，然后進行35個循環，每個循環包括94°C變性30s，復性(48-64°C )30s，72°C延伸30s， 最后72°C延伸10min，4°C保存。隨機選擇6份鐵皮石斛種質資源用于引物以及最適退火溫度 的篩選，各引物對的最適退火溫度通過梯度PCR試驗確定。篩選出有目標條帶和最適退火溫 度的引物。
[0057] (6)聚丙烯酰氨凝膠電泳
[0058] 在最適退火溫度下，對有目標條帶的引物用于16份鐵皮石斛種質資源的PCR擴增， 產物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染，等膠干燥后利用數碼相機進行拍照\保存。 具體步驟如下；
[0059] (6.1)6%聚丙烯酰胺變性凝膠制備，具體條件如下表1所示：
[0060] 表 1
[0062] 注:*40%丙烯酰胺:將190g丙烯酰胺和IOg甲叉丙烯酰胺用水稀釋至500mL，4°C貯 存備用。#TEMED和25 % APS在灌膠前加入。
[0063]灌膠:輕輕灌凝膠液，防止出現氣泡。聚合時間Ih以上。
[0064] (6 · 2)預電泳:恒功率預電泳30min，溫度達到43 °C左右。
[0065] (6.3)樣品變性：10uL PCR樣品加入5uL 3XLoading Buffer[98% 甲酰胺，0.5M EDTA(pH8.0)，0.25%溴酚藍，0.25 %二甲苯青]，混勻后，在95°C變性5min，立即放至冰上 IOmin以上。
[0066] (6.4)加樣和電泳:吸打加樣槽，清除殘膠、尿素和氣泡，每一個加樣孔點入5uL樣 品；40W
[0067]丨旦功率電泳約1.0 h~2.0;電泳結束后，小心分開兩塊玻璃板。
[0068] (6.5)銀染程序：
[0069]固定:將凝膠板置于IL乙酸溶液（10% )中，輕輕搖蕩5-6min。
[0070] 漂洗：用1.5L雙蒸水漂洗2-3min。
[0071] 染色:在1.5L新配的染色液中（I. 5g硝酸銀，1.5mL37%甲醛），輕輕搖蕩15min。
[0072] 漂洗:用1.5L雙蒸水漂洗，時間不超過10秒。
[0073] 顯影:在1.5L顯影液中（顯影液含無水碳酸鈉45g，1 %硫代硫酸鈉300uL，37%甲醛 2.25mL。提前配制，置于4°C冰箱中預冷)輕輕搖蕩，直至出現帶紋。
[0074] 定影:在1.5L 10%乙酸溶液中定影2-3min。
[0075] 漂洗：用1.5L雙蒸水漂洗2-3min。
[0076] 干膠:室溫下自然晾干。
[0077] (7)鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的引物篩選
[0078] 鐵皮石斛以富含多糖類物質而著名，其葉片多糖的含量也十分豐富，本試驗所使 用的試劑盒提取基因組DNA質量較高，無其它雜質干擾，之后經核酸檢測儀檢測顯示，OD 260/ OD28q值在1.68-1.95范圍內，獲得的DNA純度較高，達到了后續分析的要求。最后再依據檢測 出的DNA樣品溶液濃度，使用預熱的TE緩沖溶液稀釋成30-50ng · yL-1備用。
[0079] 通過優化好的PCR反應體系對該106對EST-SSR引物進行篩選以及最佳退火溫度的 篩選。在最優體系和最適退火溫度下進行PCR反應，以利于高質量的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 的獲得，這保證了后續條帶的統計和數據分析的準確性。
[0080]選用15份差異較大的鐵皮石斛資源與串珠石斛的核DNA為模板對篩選過后的引物 進行擴增檢測。
[0081 ] 由圖1可知，引物DN13、DN58、DN65和DN67對串珠石斛無擴增片段，而對15份不同種 質的鐵皮石斛均有不同大小的擴增片段。引物DN99對串珠石斛有單一擴增片段，引物DN99 擴增片段大小約150bp，明顯小于在15份鐵皮石斛中的擴增片段的大小。因此，引物DN13、 DN58、DN65、DN67、和DN99能作為鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的引物。目前市場上鐵皮石斛干 品-鐵皮楓斗混偽品較多，從外形上難以區分，可利用本發明的這些引物組鑒定其中是否混 有串珠石斛。
【主權項】
1. 一種鑒定鐵皮石解與串珠石解的EST-SSR引物組，其特征在于：該引物組由5對引物 組成，具體的引物的序列表為如下所示： DN13 F: ATTTGATTGGTTCTGCTCATCC R; TTCTTGTTCTCTTCCAGCTTCC, DN58 F: CTAATGCAGGTTCTCCTCACCT R: GTTCAGCTCATCTCCTTGGATT， DN65 t ΟΛΤΛ八GGGG八八GG八GG八G八八G八 R:八ATCTATGCC八ATC八CTCC八CY、， DN67 1^'： GCACACATCCACTCAC'CCT R: GfiGTATAGAG AG A A A TGCTOCG · DN99 f^iGGCACAGOTACTAGCAACAACA 民：AGGTGATGGCAAAGTTCCAA。2. 根據權利要求1所述的鑒定鐵皮石解與串珠石解的EST-SSR引物組的開發方法，其特 征在于:包括： (1) 基因組DNA提取 DNA的提取采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒提取鐵皮石解基因組DNA，檢測 DNA濃度和純度，根據計算所得的DNA濃度，將DNA樣品溶液用TE稀釋成50ng . uL-i，-20°C保 存備用； (2) 序列來源獲得 登錄到NCBI中，在捜索欄中輸入Demlrobium nobile，得到15383條EST序列，利用NCBI 中金較石解的EST序列進行后續的SSR位點查找及其引物設計； (3) SSR位點查找 在線捜索軟件SSRIT對所有EST序列進行SSR位點捜索，捜索標準為:二、Ξ、四、五和六 核巧酸的最小重復次數分別為10、6、5、4、3次，651'序列長度大于10化9,551?起始點位置距離 5'和3'應不小于20bp; (4) SSR引物設計 用Primer 5和Oligo 7軟件進行引物設計和評價，設計引物時設置的主要參數為:GC含 量40 %~70 %，退火溫度50~62°C，引物長18~24bp，上下游引物Tm值之差應在rC范圍之 內，預期擴增產物長度100~500bp，共設計出合格的SSR引物有106對，引物命名為Dn加序 號，即Dn-1 ~Dn-106; 巧化ST-SSR引物篩選 將106對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成；引物最適復性 溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Master (cycler普通梯度PCR儀上進行；2XTaq PCR MasterMix購自天根生物公司，PCR反應體系為20化，其中包括：1化L的2X化X PCR Master Mix，0.4化的模板DNA，0.祉L的引物對(5皿〇1 ·化-1) X 2，祉L的d地2〇;反應程序為94°C預變 性5min，然后進行35個循環，每個循環包括94°C變性30s，復性30s，72 °C延伸30s，最后72 °C 延伸10min，4°C保存；隨機選擇6份鐵皮石解種質資源用于引物W及最適退火溫度的篩選， 各引物對的最適退火溫度通過梯度PC時式驗確定;篩選出有目標條帶和最適退火溫度的引 物。3. -種鑒定鐵皮石解與串珠石解的EST-SSR引物組在鐵皮石解和串珠石解物種鑒定中 的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106086168SQ201610409857
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發明人】付濤, 何月秋, 胡仲義, 王志龍
【申請人】寧波城市職業技術學院