過氧化氫酶活性測定儀及其使用方法
【專利摘要】一種過氧化氫酶活性測定儀，呈有蓋（11）的反應筒（4），蓋中心有按轉軸（14）、軸上和軸旁有凸栓（15）和卡口座（12），軸上套有彈簧（13），蓋上還有氣液進口（17），反應筒側壁上有帶啟閉閥的測氧氣孔（6）、通液氣孔（5）和放液孔（1），且均有密封圈（18）。反應筒內有存液皿（10）、膠片（9）、小孔分流托片（8）和攪拌篩（2），圓面上均開有分流孔或篩孔（16、19、3），反應筒內側壁上部有擱臺（7）。使用步驟：一是使用前的預處理和檢查，二是加料和關閉閥門，三是測原始氧氣量，四是混合、反應和再測量，五是比較和計算，六是放廢水和換氣。本發明能測得反應全過程的數據，精度高，用產氧量反映酶活性，是一套全新的技術方案。
【專利說明】
過氧化氫酶活性測定儀及其使用方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種化學實驗儀器，具體是用于酶促反應氣體產生量的增減變化、間接顯示酶活性的測定儀及其使用方法。
【背景技術】
[0002]過氧化氫酶活性的測定，一直以來是按過氧化氫與過氧化氫酶在酶促反應中過氧化氫量的減少，用紫外分光光度計240nm波長的紫外光照射，吸光度逐漸降低，測出吸光度的變化速度，測出過氧化氫酶的活性。具體做法是將過氧化氫酶與過氧化氫置于比色皿中，立即將分光光度計也置于比色皿內，開啟光度計、蓋上比色皿的蓋，進行比色測定。這種比色儀進行測定時，投放過氧化氫酶與投放過氧化氫幾乎是同時進行，因酶促反應中的酶具有高效性，兩者一旦混合，反應就開始，過氧化氫的反應損耗也已經產生，即使立即投放分光光度計、開始實測，還是無法反映出這時間差中過氧化氫的損耗量，所測數據不甚準確，誤差較大。本發明是將過氧化氫酶與過氧化氫反應中氧氣產生量的增減來反映過氧化氫酶的活性，反應與實測同步進行，既沒有時間差，又能顯示出整個反應的全貌，為此，設計出一種專用的測定儀和提供一套配套的新的使用方法，經檢索和市場調查，未見有相關資料報道和實物面市。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種在酶促反應中將過氧化氫的減量改為氧氣的增量來反映過氧化氫酶的活性，能使反應與實測同步進行且誤差小的一種過氧化氫酶活性測定儀及其使用方法。
[0004]解決上述技術問題采用如下技術方案:本過氧化氫酶活性測定儀，包括反應和測定部件，呈圓筒體的反應筒上部有內襯密封圈的蓋，蓋上有帶啟閉閥的氣液進口，該蓋中心有軸孔并安裝有上部帶凸栓和套有復位彈簧的按轉軸，蓋上的軸孔兩側安裝有卡口座，座上有卡口，按轉軸的中上段和下端段有定位銷孔;反應筒的側壁上安裝有測氧氣孔、通液氣孔和放液孔，這三孔均帶有啟閉閥，反應筒的上部內壁上有圓環形擱臺，反應筒內由上至下有存液皿、膠片、小孔分流托片和攪拌篩，存液皿上和膠片上有軸孔和孔徑相同、位置對應的大分流孔，小孔分流托片上有軸孔和小分流孔，攪拌篩上有軸孔和篩孔，存液皿和膠片擱放在擱臺上，小孔分流托片和攪拌篩均有與按轉軸的定位銷孔位置對應的定位銷，反應筒蓋及側壁上與外界的通孔周圍均安裝有密封圈。
[0005]所述的存液皿軸孔的孔徑比按轉軸直徑大l_2mm，膠片軸孔的孔徑比按轉軸直徑大0.1-0.2mm，小孔分流托片軸孔的孔徑比按轉軸直徑大0.1-0.2mm。
[0006]所述的存液皿、膠片、小孔分流托片和攪拌篩上的大分流孔或小分流孔由外及內均呈同心圓排列，順著放射線方向分布。
[0007]所述的反應筒的內徑比存放皿的外徑和膠片的直徑大所述的小孔分流托片的直徑大于存液皿或膠片最外周作同心圓排列的各大分流孔外側弧線的切線連接圓的直徑，且小于圓環形擱臺的內徑。
[0008]本過氧化氫酶活性測定儀的使用方法按如下步驟進行:
(1)使用前的預處理和檢查:
①:選購好合適濃度的過氧化氫溶液和配制好待測的過氧化氫酶溶液；
②:清洗與安裝好反應筒及其內外各部件，蓋上蓋體并至密封，將上下重合的存液皿與膠片一起架擱在圓環形擱臺上，將測氧氣孔與測氧儀連接好；
③檢查各閥門的開與閉，關閉放液孔上的閥門，開啟氣液進口、測氧氣孔和通液氣孔上的閥門；
④將按轉軸向上提并作小角度的反時針轉動，使攪拌篩和小孔分流托片上行，后者緊貼膠片，在大分流孔與小分流孔不貫通時，凸栓擱在卡口座上定位；
(2)加料和關閉閥門:從通液氣孔向反應筒內加入經稱量的過氧化氫溶液，從氣液進口向存液皿加入經稱量的過氧化氫酶溶液，再關閉上述兩孔或口上的閥門；
(3)測量、讀取并記錄反應筒內原始的氧氣含量；
(4)放料、使兩溶液混合、反應和測量:順時針擰動按轉軸，使凸栓脫離卡口座，進一步按下按轉軸，使小孔分流托片與膠片脫離，存液皿內的過氧化氫酶液快速從大分流孔直接下流，與過氧化氫溶液混合并快速反應，上下多次按動按轉軸，使混合液在該篩的上下攪動中更快速、充分反應;按每隔30秒測一次含氧量，并讀取和記錄相關數據；
(5)根據實測的單位時間的增氧量、按公式計算和比較過氧化氫酶的活性；
(6)放水、換氣，準備再測:一次測定結束，從放液孔放掉反應生成的廢液，打開通液氣孔和氣液進口的閥門，將反應筒內反應生成的氣體換成大氣，再重復上述步驟，進行下一次測定。
[0009]本發明的有益效果是:本測定儀及其使用方法，能使反應與實測同步進行，所測數據，能反映出整個反應的全貌，精度高、誤差小，且提供了一種酶活性測定的新儀器、新思路和新的使用方法。
【附圖說明】
[0010]圖1為本測定儀結構示意圖。
[0011]圖2為本測定儀存液皿和托片上的大分流孔布局狀態示意(俯視)圖。
[0012]圖3為本測定儀小孔分流托片上的小分流孔布局狀態示意(俯視)圖。
【具體實施方式】
[0013]本發明下面結合實施例并參照附圖予以詳述:參見圖1-3，本過氧化氫酶活性測定儀，包括反應和測定部件，呈圓筒體的反應筒4上部有內襯密封圈的蓋11，蓋上有帶啟閉閥的氣液進口 17，該蓋中心有軸孔a并安裝有上部帶凸栓15和套有復位彈簧13的按轉軸14，蓋上的軸孔兩側安裝有卡口座12，座上有卡口，按轉軸的中上段和下端段有定位銷孔;反應筒的側壁上安裝有測氧氣孔6、通液氣孔5和放液孔I，這三孔均帶有啟閉閥，反應筒的上部內壁上有圓環形擱臺7，反應筒內由上至下有存液皿10、膠片9、小孔分流托片8和攪拌篩2，存液皿上和膠片上有軸孔和孔徑相同、位置對應的大分流孔16，小孔分流托片上有軸孔和小分流孔19，攪拌篩上有軸孔和篩孔，存液皿和膠片擱放在擱臺上，小孔分流托片和攪拌篩均有與按轉軸的定位銷孔位置對應的定位銷20，反應筒蓋及側壁上與外界的通孔周圍均安裝有密封圈18。
[0014]所述的存液皿軸孔a的孔徑比按轉軸直徑大l_2mm，膠片軸孔的孔徑比按轉軸直徑大0.1-0.2mm，小孔分流托片軸孔的孔徑比按轉軸直徑大0.1-0.2mm。
[0015]所述的存液皿、膠片、小孔分流托片和攪拌篩上的大分流孔16或小分流孔19由外及內均呈同心圓排列，順著放射線方向分布。
[0016]所述的反應筒4的內徑比存放皿10的外徑和膠片9的直徑大所述的小孔分流托片8的直徑大于存液皿或膠片最外周作同心圓排列的各大分流孔16外側弧線的切線連接圓b的直徑，且小于圓環形擱臺7的內徑。
[0017]使用權利要求1的過氧化氫酶活性測定儀的方法按如下步驟進行:
(1)使用前的預處理和檢查:
①:選購好合適濃度的過氧化氫溶液和配制好待測的過氧化氫酶溶液；
②:清洗與安裝好反應筒及其內外各部件，蓋上蓋體并至密封，將上下重合的存液皿與膠片一起架擱在圓環形擱臺上，將測氧氣孔與測氧儀連接好；
③檢查各閥門的開與閉，關閉放液孔上的閥門，開啟氣液進口、測氧氣孔和通液氣孔上的閥門；
④將按轉軸向上提并作小角度的反時針轉動，使攪拌篩和小孔分流托片上行，后者緊貼膠片，在大分流孔與小分流孔不貫通時，凸栓擱在卡口座上定位；
(2)加料和關閉閥門:從通液氣孔向反應筒內加入經稱量的過氧化氫溶液，從氣液進口向存液皿加入經稱量的過氧化氫酶溶液，再關閉上述兩孔或口上的閥門；
(3)測量、讀取并記錄反應筒內原始的氧氣含量；
(4)放料、使兩溶液混合、反應和測量:順時針擰動按轉軸，使凸栓脫離卡口座，進一步按下按轉軸，使小孔分流托片與膠片脫離，存液皿內的過氧化氫酶液快速從大分流孔直接下流，與過氧化氫溶液混合并快速反應，上下多次按動按轉軸，使混合液在該篩的上下攪動中更快速、充分反應;按每隔30秒測一次含氧量，并讀取和記錄相關數據；
(5)根據實測的單位時間的增氧量、按公式計算和比較過氧化氫酶的活性；
(6)放水、換氣，準備再測:一次測定結束，從放液孔放掉反應生成的廢液，打開通液氣孔和氣液進口的閥門，將反應筒內反應生成的氣體換成大氣，再重復上述步驟，進行下一次測定。
[0018]使用本測定儀前，先檢查測定儀，將存液皿10的底面與膠片9重合，一起架擱在圓環形擱臺7上，向上提拉按轉軸14，逆時針方向稍擰動該軸，順勢將按轉軸上的凸栓15擱在卡口座12上定位，此時，小孔分流托片與上方的膠片緊貼，攪拌篩2上行，小孔分流托片8上各小孔與其上方的兩層重合的大分流孔16不貫通，則存液皿即使存有液體也不會從小分流孔中向下流出；再擰動按轉軸，使大分流孔與小分流孔貫通，則存液皿的液體就會由大分流孔至小分流孔向下流出，單位時間的流量較小。需流量大時，順時針抒動按轉軸，使凸栓從所擱的卡口座上脫離，再向下按動按轉軸，使小孔分流托片和攪拌篩下行，則小孔分流托片與膠片分離，存液皿中的液體就會通過大分流孔向下流，不受小分流孔的阻擋，流量就大。對按轉軸連續按動多次，復位彈簧13以相應的次數反彈，則攪拌篩上下多次活動，使反應筒4底部的反應液在充分攪動中更快速、均勻、徹底地完成反應。過氧化氫可從通液氣孔5加入至反應筒底部，過氧化氫酶從氣液進口 10加入至存液皿內，測氧氣孔6與測氧儀連接，放液孔I用于放掉實驗用后的廢液，為下一批實驗作準備。蓋11用于安裝本測定儀的內外部零件，撤換內部零件、清洗反應筒內室。
[0019]使用時，將反應筒底部的放液孔I的啟閉閥關閉、測氧氣孔6與測氧儀連接，開啟通液氣孔5和氣液進口 17上的閥門，將按轉軸14向上提和作逆時針的小角度擰動，使小孔分流托片緊貼其上的膠片，大分流孔16與小分流孔19不貫通，凸栓15擱在卡口座12上，將蓋11關好、擰緊至密封。從通液氣孔5中向反應筒4內加入經計量的過氧化氫液，從氣液進口 17向反應筒內的存液皿10加入經計量的過氧化氫酶液，分別關閉通液氣孔5和氣液進口 17的閥門，此時，存液皿10中的過氧化氫酶液未曾向下與過氧化氫混合，酶促反應尚未開始，從測氧儀中讀取并記錄反應筒內原始的氧氣含量。若要慢速反應，則上提按轉軸并小角度順時針擰動該軸，使大分流孔與小分流孔貫通，則存液皿中的過氧化氫酶液順大分流孔、再至小分流孔向下流出，與反應筒底部的過氧化氫反應，不斷地、逐步地消耗過氧化氫的同時，產生著氧氣，分時間段分別讀取并記錄氧氣的增量，直至反應結束，畫出不同時間段的氧氣含量變化曲線，根據公式計算出過氧化氫酶的活性。若需快速反應，則再繼續順時針擰動按轉軸，使該軸上的凸栓脫離卡口座后，再將按轉軸向下按，使小孔分流托片脫離了膠板，存液皿內的過氧化氫酶經大分流孔快速下流，下流過程中不受小分流孔的阻擋，直接流至反應筒底，與筒底內的過氧化氫混合，酶促反應開始，與前述過程一樣記錄各時間段的氧氣含量變化并制定曲線。若使反應更快，則擰動按轉軸，使小孔分流托板脫離膠片，過氧化氫酶液從大分流孔直接向下流至反應筒底與過氧化氫混合而反應，同時再連續上下多次按動按轉軸，使攪拌篩急速上下攪動，將混合液攪拌均勻，則反應會更快、更徹底。作為過氧化氫酶的活性測定是要求反應一旦開始應快速，則宜采用上述第三種由大分流孔快速放液和攪拌同時進行的方法。在反應開始之初，氧氣產生量較大，曲線斜率也大，反映酶的活性最好。
[0020]過氧化氫酶活性的計算公式為:
過氧化氫酶活性(U.μπιο?.min—1.g_1)=(2 X Δ Ο2 X Vt)/(ff X VsX t)；
以每分鐘內氧氣增加的物質的量的2倍的酶量為I個酶活單位(U);
式中:Δ O2為待測過氧化氫酶溶液的放氧曲線的直線部分的氧氣增加量(ymol)，VT為提取酶液總體積(mL)，Vs為測定時取用酶液體積(mL)，W為生物材料鮮重(g)，t為待測過氧化氫酶溶液的放氧曲線的直線部分所消耗的時間(min)。
[0021]至于用一對卡口座，開有小分流孔是為增設擋位和調控放液速度留余地，以擴大本測定儀的通用性。不同零件的大小軸孔a、貫通與不貫通、是否需臨時定位，是否兼顧密閉性等均應統籌考慮。大分流孔和小分流孔的孔徑大小、密度、分布方式，可以多樣化，不局限附圖所示的幾種方式，總之，是基于反應筒橫截圓面的大小、反應液量的大小、大孔與小孔貫通與不貫通的轉換方便與否等因素而定的。存液皿、膠片、小孔分流片，均可按需要制成排列方式、孔徑大小、分布密度不同的系列產品，按不同反應的要求進行調換。配套應用的氧氣測定儀如要求精度高的，則可選購英國Hansatech生產的Chlorolab2型的氧電極。
【主權項】
1.一種過氧化氫酶活性測定儀，包括反應和測定部件，其特征是呈圓筒體的反應筒(4)上部有內襯密封圈的蓋(11)，蓋上有帶啟閉閥的氣液進口(17)，該蓋中心有軸孔(a)并安裝有上部帶凸栓(15)和套有復位彈簧(13)的按轉軸(14)，蓋上的軸孔兩側安裝有卡口座(12)，座上有卡口，按轉軸的中上段和下端段有定位銷孔;反應筒的側壁上安裝有測氧氣孔(6)、通液氣孔(5)和放液孔(I)，這三孔均帶有啟閉閥，反應筒的上部內壁上有圓環形擱臺(7 )，反應筒內由上至下有存液皿(10)、膠片(9)、小孔分流托片(8)和攪拌篩(2)，存液皿上和膠片上有軸孔和孔徑相同、位置對應的大分流孔(16)，小孔分流托片上有軸孔和小分流孔(19)，攪拌篩上有軸孔和篩孔，存液皿和膠片擱放在擱臺上，小孔分流托片和攪拌篩均有與按轉軸的定位銷孔位置對應的定位銷(20)，反應筒蓋及側壁上與外界的通孔周圍均安裝有密封圈(18)。2.如權利要求1所述的過氧化氫酶活性測定儀，其特征是所述的存液皿軸孔(a)的孔徑比按轉軸直徑大l_2mm，膠片軸孔的孔徑比按轉軸直徑大0.1-0.2mm，小孔分流托片軸孔的孔徑比按轉軸直徑大0.1-0.2_。3.如權利要求1所述的過氧化氫酶活性測定儀，其特征是所述的存液皿、膠片、小孔分流托片和攪拌篩上的大分流孔(16)或小分流孔(19)由外及內均呈同心圓排列，順著放射線方向分布。4.如權利要求1所述的過氧化氫酶活性測定儀，其特征是所述的反應筒(4)的內徑比存放皿(10)的外徑和膠片(9)的直徑大1-2_;所述的小孔分流托片(8)的直徑大于存液皿或膠片最外周作同心圓排列的各大分流孔(16)外側弧線的切線連接圓(b)的直徑，且小于圓環形擱臺(7)的內徑。5.—種使用權利要求1的過氧化氫酶活性測定儀的方法，其特征是按如下步驟進行: (1)使用前的預處理和檢查: ①:選購好合適濃度的過氧化氫溶液和配制好待測的過氧化氫酶溶液； ②:清洗與安裝好反應筒及其內外各部件，蓋上蓋體并至密封，將上下重合的存液皿與膠片一起架擱在圓環形擱臺上，將測氧氣孔與測氧儀連接好； ③檢查各閥門的開與閉，關閉放液孔上的閥門，開啟氣液進口、測氧氣孔和通液氣孔上的閥門； ④將按轉軸向上提并作小角度的反時針轉動，使攪拌篩和小孔分流托片上行，后者緊貼膠片，在大分流孔與小分流孔不貫通時，凸栓擱在卡口座上定位； (2)加料和關閉閥門:從通液氣孔向反應筒內加入經稱量的過氧化氫溶液，從氣液進口向存液皿加入經稱量的過氧化氫酶溶液，再關閉上述兩孔或口上的閥門； (3 )測量、讀取并記錄反應筒內原始的氧氣含量； (4)放料、使兩溶液混合、反應和測量:順時針擰動按轉軸，使凸栓脫離卡口座，進一步按下按轉軸，使小孔分流托片與膠片脫離，存液皿內的過氧化氫酶液快速從大分流孔直接下流，與過氧化氫溶液混合并快速反應，上下多次按動按轉軸，使混合液在該篩的上下攪動中更快速、充分反應;按每隔30秒測一次含氧量，并讀取和記錄相關數據； (5)根據實測的單位時間的增氧量、按公式計算和比較過氧化氫酶的活性； (6)放水、換氣，準備再測:一次測定結束，從放液孔放掉反應生成的廢液，打開通液氣孔和氣液進口的閥門，將反應筒內反應生成的氣體換成大氣，再重復上述步驟，進行下一次 測定。
【文檔編號】C12Q1/30GK106086157SQ201610447070
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】俞率成
【申請人】俞率成