室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型及其建立方法
【專利摘要】本發明提供一種室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型，如下式(5)所示，并提供了該預測模型的建立方法。本發明通過模型驗證證實該模型能準確、客觀、定量的反應室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌的生長情況，為草莓風險評估模型研究提供數據基礎，有利于草莓的品質控制和風險預警、評估。Ygro＝log10Nt?log10N0＝0.359+0.081×t (5)。
【專利說明】
室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型及其建立方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型及其建立方法。
【背景技術】
[0002]鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)為革蘭氏陰性腸桿菌，屬于沙門氏菌 乙組，能導致多種宿主動物腸道疾病，可以通過被污染的飲用水及食物進入人體，引起腹 瀉、嘔吐、腸炎等疾病，嚴重時可致人死亡，其致病機理在于鼠傷寒沙門氏菌進入人體腸道 后，通過入侵小腸上皮細胞及在腸毒素、內毒素的作用下，能夠引起腸膜水腫、充血、組織炎 癥。沙門氏菌普遍存在動物糞便中，并通過農業設施中的灌溉水、施肥等途徑傳播。2015年9 月，美國因沙門氏菌污染緊急召回墨西哥進口黃瓜事件再次引起公眾對食源性微生物疾病 的關注，該次事件已造成超過285人患病，其中53人入院，1人死亡。2008年美國爆發鼠傷寒 沙門氏菌中毒事件，原因是西紅柿污染。2012年2月英國出現西瓜大規模中毒事件，也與沙 門氏菌感染有關[2]。
[0003] 我國草莓種植面積從1985年的0.33萬平方公頃增加至2009年的9.01萬平方公頃， 總產量達到220.6萬噸，占世界總產量的35.7%，是世界草莓生產第一大國[2]。居民草莓消 費量近年來逐漸增加，2007年鮮果消費總量約為177萬噸，2009年初步估計已超過200噸，按 13億人口計算，人均消費量接近1.5kg[3]。然而，成熟后草莓果實嬌嫩，含水量達到95%，采 摘、加工、運輸、銷售過程中極易受機械傷害而滲出汁液，為有害微生物生長提供豐富的營 養物質，常溫條件下草莓儲藏期僅1-2天[4]。
[0004] 近年來，我國各省市生食果蔬類的沙門氏菌陽性率調查結果顯示，果蔬中沙門氏 菌的陽性率平均值為3.38%，個別地區沙門氏菌污染較為嚴重達到10% [5-8]。雖然我國尚 缺少草莓表面鼠傷寒沙門氏菌污染率和污染水平的相關報道，但施肥、灌溉等過程可能造 成細菌污染，且春季草莓成熟季節較溫暖的溫度可造成果實表面的細菌增長，對居民健康 造成風險。目前國內鮮見有關草莓表面沙門氏菌的定量風險評估研究，也缺少根據科學研 究結果對消費者家庭環節提出的健康消費指導。
[0005] 預測微生物模型是風險評估的重要數據基礎，草莓表面鼠傷寒沙門氏菌的預測模 型是風險評估中的數據缺陷，因此，本發明對春季室溫條件下鼠傷寒沙門氏菌的數量變化 規律進行模型擬合，建立微生物預測方程，為風險評估模型研究提供數據基礎。
【發明內容】
[0006] 本發明提供一種室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型及其建立方法，可 以通過模型預測室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌的生長情況，模型預測值與實驗數據 偏差較小，可較好的擬合細菌生長與時間關系。
[0007] 本發明采用的技術方案是：
[0008] -種室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型的建立方法，所述方法包括以 下步驟：
[0009] (I)鼠傷寒沙門氏菌活化培養，得到細菌培養液
[0010] (2)新鮮草莓用體積分數75 %的酒精浸泡滅菌，滅菌后的草莓浸泡于細菌培養液 中接種；
[0011] (3)接種后的草莓于室溫下儲藏，測定不同儲藏時間下草莓上的菌株數;所述室溫 為 22。。；
[0012] (4)將細菌計數后進行對數轉換，用式(2)的線性模型進行生長曲線擬合
[0013] Ygr0 = logioNt-logioNo = a+b X t (2)
[0014] 其中，t為室溫下儲藏時間，單位為小時;Nt(CFU/g)為t時的細菌數，N0(CFU/g)為 樣品初始帶菌量;Ygro為t時細菌對數值變化量，a，b分別為線性方程待擬合的參數；
[0015] 線性擬合求出a、b。
[0016] 線性擬合求出a、b后，可以得到細菌對數值變化量與時間的關系如下式(5)，即為 室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型
[0017] Ygro = IogioNt-IogioNo = O. 359+0.081 X t (5)
[0018] 進一步，本發明使用鼠傷寒沙門氏菌（Salmone 11 a Typhimur ium)，編號 ATCC14028，由浙江省農業科學院農產品質量標準研究所提供。
[0019] 所述步驟（1)中，鼠傷寒沙門氏菌活化培養的步驟是：鼠傷寒沙門氏菌株保存于 Iml冷凍管中，儲存于-80°C冰箱，使用前取出，融化后吸取Iml菌液培養于300mlNB肉湯培養 基中，37 °C條件下震蕩培養12h，得到細菌濃度為108CFU/ml的細菌培養液備用。
[0020] 所述步驟(2)中，新鮮草莓用體積分數75%的酒精浸泡滅菌，一般將新鮮無傷口的 草莓浸泡于體積分數75%的酒精溶液中2分鐘，以殺滅表面微生物，取出后用無菌水反復沖 洗，直至無酒精味后置于無菌燒杯中備用。
[0021] 所述步驟(2)中，滅菌后的草莓浸泡于細菌培養液中接種，具體步驟一般為:滅菌 后的草莓用細菌培養液浸沒浸泡30分鐘后將草莓取出置于無菌塑料盤上，于生物安全柜中 靜置30分鐘，確保菌液接種至草莓表面，得到接種后的草莓。
[0022] 所述步驟(3)中，室溫下儲藏，本發明選取春季平均室溫22°C模擬草莓表面鼠傷寒 沙門氏菌生長過程。
[0023]儲藏時間考慮消費者日常儲存草莓的平均最長時間，選取72小時為最長時間周 期。
[0024]所述步驟(3)中，測定不同儲藏時間下草莓上的菌株數，一般每隔一段時間取出草 莓樣品，采用平板計數法計數。
[0025]更具體的，按以下方法進行計數:取出草莓樣品后，迅速轉移至含有20ml生理鹽水 的均質袋中，用拍擊式均質器拍打均質袋中的草莓l_2min，制成樣品勻液，使用無菌槍頭吸 取Iml樣品勻液加入9mL生理鹽水試管稀釋，漩渦混勻后制成1:10的樣品勻液，再用生理鹽 水稀釋2次，分別制成1:100、1:1000的樣品勻液，用無菌槍頭吸取0.1 mL不同稀釋度樣品勻 液，分別對應均勻涂布在10-1、10-2、10-3稀釋度編號的XLD瓊脂平板上，將涂布后的平板平 放于桌上20-30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，36 ± 1°C培養24± 2h后計數。 這是本領域技術人員公知的平板計數法。
[0026] -般每個時間點做3個重復實驗，取3次實驗平均值。
[0027] 本發明所述方法還可以包括以下步驟(5)
[0028] (5)線性擬合求出a、b后，對模型進行驗證，進一步，模型驗證包括內驗和外驗，所 述內驗采用相關系數(R2)及標準誤平方根(RMSE)作為內驗結果來驗證模型擬合度;所述外 驗是利用預測模型預測室溫下不同儲藏時間下草莓上的菌株數對數值變化量，然后進行驗 證實驗，將實際測量值與預測值進行比較，利用方程(3)及(4)計算Ross提出的偏差因子Bf 及精確因子Af，用于模型外驗結果，以評價模型的準確性。
[0029] (3)
[0030] (4)
[0031] 其中，η為實驗組數，pred為線性方程預測得出細菌對數值變化量;ObS為驗證試驗 中細菌對數值變化量的觀測值。Bf用于檢驗預測的準確度，若Bf>l，表示預測結果大于實際 結果，反之亦然。Af用于檢驗預測的精確度，即預測值與觀測值偏差的絕對值。
[0032] 本研究中細菌的變化量以平均數及標準偏差的形式表示，以Microsoft Excel 20 10(微軟公司，雷德蒙，華盛頓州）進行數據處理。本研究以OriginPro 8. 1軟件 (OriginLab，北安普敦，馬薩諸塞州）中的線性擬合功能對數據進行擬合。
[0033] 本發明還提供室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型，如下式(2)所示：
[0034] Ygro = IogNt-IogNo = 0.359+0.081 X t (2)
[0035] 其中，t為室溫下儲藏時間，單位為小時，且t小于72小時;Nt(CFlVg)為t時的細菌 數，NO (CFU/g)為樣品初始帶菌量;Ygro為t時細菌對數值變化量。
[0036] 本發明在建立模型時發現，隨時間延長，草莓表面鼠傷寒沙門氏菌總體呈線性規 律增長。對比22°C左右沙門氏菌在果蔬表面的生長規律可以發現，在水分活度和糖分較高 的水果表面，細菌生長速度較快。本發明中利用線性方程擬合細菌對數值變化量(log Nt-IogNO)與時間（t)關系，兩者呈現良好的線性關系，模型的校正相關系數R2為0.95,殘差平 方和較低，表明模型預測值與實驗數據偏差較小，可較好的擬合細菌對數值變化量與時間 關系。
[0037] 利用本發明提供的預測模型預測室溫下不同儲藏時間下草莓上的菌株數，然后進 行驗證實驗，將細菌對數值變化量的實際測量值與預測值進行比較，計算得出偏差因子為 0.96,位于Ross提出的可接受范圍0.9-1.05內[12]。模型精度因子為1.05,表示預測值與觀 測值間僅誤差5%。驗證實驗結果表明本發明的線性方程可用于室溫條件下草莓表面鼠傷 寒沙門氏菌對數值變化量的的預測。
[0038] 本發明的有益效果在于:本發明提供了一種室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌 預測模型，并通過模型驗證證實該模型能準確、客觀、定量的反應室溫條件下草莓表面鼠傷 寒沙門氏菌的生長情況，為草莓風險評估模型研究提供數據基礎，有利于草莓的品質控制 和風險預警、評估。
【附圖說明】
[0039]圖1草莓表面鼠傷寒沙門氏菌在室溫條件下的生長趨勢圖。
[0040]圖2室溫儲藏時草莓表面鼠傷寒沙門氏菌對數值變化量隨時間變化的線性方程擬 合圖。
【具體實施方式】
[0041 ]下面將結合附圖對本發明做詳細的介紹：
[0042] 1材料與方法
[0043] (1)菌株和細菌培養
[0044] 本實驗使用鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium)，編號ATCC14028,由浙江 省農業科學院農產品質量標準研究所提供。
[0045] 菌株保存于Iml冷凍管中，儲存于-80°C冰箱，使用前取出，融化后吸取Iml菌液培 養于300mlNB肉湯培養基(購于陸橋技術股份有限公司）中，37°C條件下震蕩培養12h，得到 細菌濃度為l〇8CFU/ml的細菌培養液備用。
[0046] (2)樣品準備和接種
[0047]新鮮草莓購于附近超市，去除蒂頭后逐一稱重，選取大小均一的草莓（7 ±0.3g/ 個)進行實驗。將草莓浸泡于體積分數75%的酒精溶液中2分鐘以殺滅表面微生物，取出后 用無菌水反復沖洗，直至無酒精味后置于無菌燒杯中備用。
[0048]量取200ml細菌培養液倒至放置草莓的燒杯中，浸泡30分鐘后將草莓取出置于無 菌塑料盤上，于生物安全柜中靜置30分鐘以確保菌液接種至草莓表面。
[0049] (3)室溫條件儲藏
[0050]本實驗選取春季平均室溫22°C模擬草莓表面鼠傷寒沙門氏菌生長過程，儲存時間 考慮消費者日常儲存草莓的平均最長時間，選取72小時為周期，每隔8小時取出草莓樣品2 個草莓樣品為平行試驗，分別迅速轉移至含有20ml生理鹽水的均質袋中。整個實驗重復3 次，取3次實驗平均值。
[0051 ] (4)微生物分析
[0052]用拍擊式均質器拍打均質袋中的草莓l_2min，制成樣品勻液，使用無菌槍頭吸取 Iml樣品勻液加入9mL生理鹽水試管稀釋，漩渦混勻后制成1:10的樣品勻液，再次稀釋2次， 制成1:100、1:1000的樣品勻液，用無菌槍頭吸取0.1 mL不同稀釋度樣品勻液對號接種在10_ 1、10-2、10-3稀釋度編號的XLD瓊脂平板上(每個編號設三個重復）。將玻璃涂布棒用酒精灼 燒，冷卻后再用玻璃涂布棒將菌液在平板上均勻涂布，從低濃度向高濃度涂布，將涂抹好的 平板平放于桌上20_30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，36 ± TC培養24 ± 2h 后計數。
[0053] (5)模型建立
[0054] 本研究中的細菌模擬生長條件較簡單，僅考慮固定溫度下的細菌數量變化，因此 可考慮運用常用初級預測模型中的指數方程進行擬合，指數方程對數轉換后即為線性方 程。因此，可將細菌計數后進行對數轉換，按照線性方程(1)計算細菌對數值變化量(Ygro)
[0055] Ygro = IogNt-IogNo (1)
[0056] 其中，Nt(CFlVg)為t時的細菌數，NO(CFlVg)為樣品初始帶菌量。
[0057]以線性模型進行生長曲線擬合，如方程(2)所示。
[0058] Ygr0 = logNt-logNo = a+b X t (2)
[0059] 其中，t為細菌培養時間，a，b分別為線性方程參數。
[0060] (6)模型驗證
[0061]相關系數(R2)及標準誤平方根(RMSE)作為內驗結果驗證模型擬合度。另外，如方 程(3)及(4)所示，再做4組驗證實驗結果用于計算Ross提出的偏差因子Bf及精確因子Af，用 于模型外驗結果[12]。
[0062] (3)
[0063] (4)
[0064] 其中，η為實驗組數，pred為線性方程預測得出細菌對數值變化量;obs為驗證試驗 中細菌對數值變化量的觀測值。Bf用于檢驗預測的準確度，若Bf>l，表示預測結果大于實際 結果，反之亦然。Af用于檢驗預測的精確度，即預測值與觀測值偏差的絕對值。
[0065] (7)數據分析
[0066] 本研究中細菌的生長量以平均數及標準偏差的形式表示，以Microsoft Excel 20 10(微軟公司，雷德蒙，華盛頓州）進行數據處理。本研究以OriginPro 8. 1軟件 (OriginLab，北安普敦，馬薩諸塞州）中的線性擬合功能對數據進行擬合。
[0067] 2結果與討論
[0068] (1)室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌的生長規律
[0069]對照試驗顯示草莓樣品初始帶菌量約為21og CFU/g。圖1為草莓表面鼠傷寒沙門 氏菌在室溫儲藏條件下的生長曲線圖，如圖1所示，在72小時儲藏時間內細菌增長量約為 61og CFU/g，隨時間延長，草莓表面鼠傷寒沙門氏菌總體呈線性規律增長。對比22°C左右沙 門氏菌在果蔬表面的生長規律可以發現，在水分活度和糖分較高的水果表面，細菌生長速 度較快。Vandamm等人[9]研究表面22°C下西芹表面沙門氏菌3天內僅增長21og CFU/g，生長 曲線呈線性趨勢。然而，Strawn等人[10]發現芒果切面上沙門氏菌在23°C時，低接種量的樣 本呈現線性生長趨勢，3天內細菌可增長超過51og CFU/gC3Rezende等人[11 ]同樣發現柿子 切面上的沙門氏菌在20°C左右48小內可生長超過51og CFU/g，生長曲線呈緩和的線性趨 勢。
[0070] 利用線性方程擬合細菌對數值變化量（log Nt-IogNO)與時間（t)關系，如圖2所 示，兩者呈現良好的線性關系。方程(5)為線性擬合結果，描述細菌對數值變化量與時間關 系。方差分析結果如表1所示。模型的校正相關系數為0.95,殘差平方和較低，表明模型預測 值與實驗數據偏差較小，可較好的擬合細菌生長與時間關系。
[0071] Ygro = IogNt-IogNo = 0.359+0.081 X t (5)
[0072]表1生長模型方差分析結果
[0074] (2)模型驗證
[0075]同樣條件下再做4組驗證，將細菌對數值變化量的預測值與實際觀測值比較，實驗 結果如表2所示。計算得出偏差因子為0.96,位于Ross提出的可接受范圍0.9-1.05內[12]。 模型精度因子為1.05,表示預測值與觀測值間僅誤差5%。驗證實驗結果表明該線性方程可 用于室溫22°C下72小時內草莓表面鼠傷寒沙門氏菌對數值變化量的預測。
[0076] 表2 4組駘證實駘的觀測倌和樽型預測倌
【主權項】
1. 一種室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模型的建立方法，其特征在于所述方 法包括以下步驟： (1) 鼠傷寒沙門氏菌活化培養，得到細菌培養液 (2) 新鮮草莓用體積分數75 %的酒精浸泡滅菌，滅菌后的草莓浸泡于細菌培養液中接 種； (3) 接種后的草莓于室溫下儲藏，測定不同儲藏時間下草莓上的菌株數； (4) 將細菌計數后進行對數轉換，用式(2)的線性模型進行生長曲線擬合 Ygr〇= logioNt-logioN〇 = a+b X t (2) 其中，t為室溫下儲藏時間，單位為小時;Nt為t時的細菌數，單位為CFU/g; NO為樣品初 始帶菌量，單位為CFU/g; Ygro為t時細菌對數值變化量，a，b分別為線性方程待擬合的參數； 線性擬合求出a、b。2. 按權利要求1所述的方法建立得到的室溫條件下草莓表面鼠傷寒沙門氏菌預測模 型，其特征在于如下式(5) Ygr〇= logioNt-logioN〇 = 0.359+0.081 X t (5) 其中，t為室溫下儲藏時間，Nt為t時的細菌數，單位為CFU/g; NO為樣品初始帶菌量，單 位為CFU/g; Ygro為t時細菌對數值變化量。
【文檔編號】G06Q10/04GK106086155SQ201610488762
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月27日
【發明人】楊桂玲, 汪雯, 王強, 周育, 蔡錚, 宋雯
【申請人】浙江省農業科學院