一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法

一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法。一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，包括以下步驟：清洗、粉碎、加稀堿液、微波處理、粗過濾、酶解、滅酶活、微濾、超濾、濃縮和噴霧干燥。本發明的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法具有收率高、純度高、溶劑消耗少、成本低和易于工業化生產的優點。本發明整個工藝流程短、時間短，能耗低、污染少、不使用有毒試劑、無污染物排放，達到清潔生產目標。
【專利說明】
一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多 肽的方法。
【背景技術】
[0002] 動物腦蛋白的水解物，能治療一些腦功能疾病，已被臨床所證明。上世紀七十年代 末期，奧地利一家名叫伊比威(Ebewe)的藥廠研制出腦活素，臨床用于治療神經系統疾病， 特別是阿爾茨海默病的治療(AD、俗稱老年癡呆癥），能明顯延緩老年癡呆病變的進展，改善 癡呆癥狀，對腦中風、腦震蕩、腦損傷、腦動脈硬化、新生兒腦缺血缺氧性腦病等的治療也有 較好的療效。如果用到淡水魚的腦活素效果會更好。淡水魚的腦活素，是用淡水魚腦蛋白經 水解并進一步提純制得的一種生物制劑，含有75%的游離氨基酸和25%的小分子肽。研究 表明腦活素的藥理作用與其所含的小分子肽類的多種活性存在量的關系。據分析，鮮魚腦 中含水率在78-82%，蛋白質9-11 %，磷脂6-7%，膽固醇2-2.5%。
[0003] 目前，由動物腦制備腦多肽和腦小分子肽的方法，從公開的文獻資料中主要是以 下幾種：
[0004] (1)-種豬腦蛋白水解物中小分子肽的制備:將豬腦去膜、洗凈后切碎，投入索氏 提取器內、用丙酮回流12小時后，取出壓碎晾干，再用丙酮回流12個小時。所得固形物再用 乙醚按上述方法回流提取共24小時，晾干后即得豬腦脫脂蛋白粉。將脫脂蛋白粉加入5倍的 純凈水混合并加入魚腦蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶、混勻后用冰醋酸調PH值在2.0-4.0之 間，然后過濾、濾液50°C減壓蒸干后分別用石油醚和無水乙醇攪拌24小時、抽濾，濾餅真空 干燥即得豬腦蛋白水解物，水解物溶解，用Sephade XG15凝膠柱吸附，以0.9%Nacl為洗脫 液進行分離純化，分段收集各流份并脫鹽，冷凍干燥后既可得到不同分子量范圍的小分子 肽組份。
[0005] (2) -種豬腦水解蛋白和單唾液酸四己糖神經節苷脂聯產工藝（選擇魚水解蛋白 部分），包括以下步驟：
[0006] 步驟1)將豬腦粉碎后加入1-4倍體積的極性有機溶劑，勻漿2-4小時后過濾、分別 收集濾餅和濾液。
[0007] 步驟2)向步驟1所得的濾餅中加入1-3倍體積的丙酮，勻漿1-2小時脫去磷脂、過 濾、減壓濃縮、20_30°C干燥，獲得脫脂豬腦粉，向脫脂豬腦粉中加入鹽緩沖液調節PH值為5-7，按照l_3g/L的比例分別加入2種或3種水解酶，在25-42 °C條件下水解2-10小時，水解結束 后，70-100°C滅活5-10分鐘，室溫放置降溫之后將水解物液經一定分子量的超濾膜過濾，所 得濾液再經截留分子量為100-500的納濾膜濃縮和真空冷凍干燥獲得注射級豬腦水解蛋 白。
[0008] (3) -種豬腦蛋白水解液的提取方法，包括以下各步驟：
[0009] 步驟1)取新鮮豬腦或冷凍淡水豬腦，并去除大腦組織表面的筋膜。用純化水或注 射用水清洗干凈，加入1-2倍純化水或注射用水，用膠體磨勻漿2-3次。
[0010] 步驟2)取步驟(1)的勻漿液、加熱至35-45°C、調PH值至7.5-8.5，加衆重0.5-2.5% 的胰蛋白酶，攪拌反應2-8小時，調節:PH值至2.0-2.5，加熱至90°C以上保溫10-30分鐘，冷 卻至溫室度、離心。
[0011] 步驟3)取步驟⑵離心上清液，按體積比1-3:1-3加入40-50W/V%羥胺溶液，調節 PH值為1.5-2.5，在80-100 °C密閉條件下反應10_30h，冷卻至40 °C以下，調PH值至6.9-7.5， 離心過濾。
[0012] 步驟4)取步驟(3)的離心上清液、超濾，收集濾液即為蛋白水解物溶液。
[0013] (4)-種從動物腦中提取淡水腦活素的方法，包括以下步驟：
[0014] 步驟1)將魚腦加蒸餾水、用Ca(OH)2調PH值7-9。
[0015]步驟2)加牛胰酶、甲苯、蒸餾水在37-50條件下，攪拌10-20h，用磷酸調PH值為5.7-5.8.
[0016] 步驟3)煮沸、過濾、濾液用He 1調PH值為6.7、減壓濃縮，低溫冷卻再濃縮，用NaOH。 調PH為7-9減壓濃縮干燥。
[0017]步驟4)將濃縮至干的物料加水溶解，過濾、濾液用HCl調PH值為4-5,用活性炭脫 色、過濾、濾液濃縮后用截留分子量為10000的透析袋進行對水透析24h，過濾，透析液加 NaHS〇3，過濾，分裝滅菌而成。
[0018] 公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

【發明內容】

[0019] 為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多 肽的方法。
[0020] 為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：
[0021] -種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，包括如下步驟：
[0022] (1)取出鮮淡水魚頭或解凍的冰凍淡水魚頭，用純凈水洗凈表面的污物、血水及雜 質，摘除魚鰓，機械粉碎至20目，得魚頭漿液；
[0023] (2)按魚頭漿液與純凈水重量比為1:8混合后，用膠體磨研磨勻漿，用NaOH溶液調 pH值至9.0，得到調節好的魚頭勻漿液；
[0024] (3)將調節好的魚頭勻漿液置于帶攪拌裝置的微波罐中，先微波升溫至60°C，持續 保溫60min;
[0025] (4)冷卻至40°C，添加按分離蛋白質量5%的胰蛋白酶，在膠體磨中勻漿循環，當pH 值下降至7.5時，取酶解液檢驗肽含量達到多15mg/ml時；結束酶解；當酶解液含肽量< 15mg/ml時，將酶解液置于微波罐中進行微波輔助酶解，微波時間15-20min。溫度55-60 °C ;
[0026] (5)結束酶解，啟動微波罐最大微波功率，將酶解液升溫至85°C時，保持5-1 Omin， 滅酶活完成，得到已滅酶活的酶解液；
[0027] (6)將已滅酶活的酶解液排出，酶解液溫度降至低于50°C時，邊攪拌邊加入用15% 醋酸溶解1.5%殼聚糖溶液，調節pH值至4.8-5.0,沉析未酶解的腦蛋白、磷脂及其它大分子 雜質;沉析物用400目濾布離心，過濾，去除沉淀，得到離心液；
[0028] (7)將步驟(6)所得的離心液，用0.45um中空纖維膜進行微濾，濾液用能攔截分子 量I OOOODa的超濾膜過濾，透過液即為淡水魚腦多肽溶液，若只做多肽時，將此溶液減壓濃 縮，然后冷凍干燥，即得多肽粉；
[0029] (8)當要制備小分子腦肽時，將多肽液進一步用能攔截分子量1000 Da的納濾膜過 濾，濾液再用RO膜濃縮，將濃縮液冷凍，干燥，即得到小分子腦肽。
[0030] 作為優選，步驟(2)中的所述的調節好的魚頭勻漿液的細度60-120目。
[0031]作為優選，步驟(3)中的微波罐的頻率為2450mHZ，功率為20KW。
[0032]作為優選，步驟(4)中的胰蛋白酶的活力為5000u/g。
[0033]作為優選，步驟(6)中的離心時，離心液的溫度38-50°C。
[0034]作為優選，步驟(8)中的RO膜為能攔截> 150Da的膜。
[0035] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0036] 1.本發明的方法改進淡水魚頭蛋白酶解工藝與技術，解決淡水魚頭蛋白不易被動 物消化吸收問題，通過釆用微波輔助酶解技術制備具有生物活性的寡肽，不僅提高淡水魚 頭蛋白的消化吸收率，而且擴大淡水魚頭蛋白應用領域，使從單純養魚拓展到畜禽飼料、飼 料添加劑到人類食品、醫藥、保健品等多種行業和領域，無疑對延長養魚產業鏈，全面提高 養魚產業綜合效益，實現農業增效農民增收農村繁榮，對推動一帶一路建設有重大意義。
[0037] 2.本發明的方法采用微波與殼聚糖沉析磷脂的方法，替代用有機溶劑提取淡水魚 腦分離蛋白，工藝簡單，時間短，效率高，生產和勞動安全可靠。
[0038] 3.本發明整個工藝流程短、時間短，能耗低、污染少、不使用有毒試劑、無污染物排 放，達到清潔生產目標。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發明的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不 局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此 外，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價變化同 樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所 使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0042] 實施例1:
[0043] -種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，包括如下步驟：
[0044] (1)取出鮮淡水魚頭或解凍的冰凍淡水魚頭，用純凈水洗凈表面的污物、血水及雜 質，摘除魚鰓，機械粉碎至20目，得魚頭漿液；
[0045] (2)按魚頭漿液與純凈水重量比為1:8混合后，用膠體磨研磨勻漿，用NaOH溶液調 pH值至9.0，得到調節好的魚頭勻漿液;所述的調節好的魚頭勻漿液的細度60目；
[0046] (3)將調節好的魚頭勻漿液置于帶攪拌裝置的微波罐中，先微波升溫至60°C，持 續保溫60min;微波罐的頻率為2450mHZ，功率為20KW;
[0047] (4)冷卻至40°C，添加按分離蛋白質量5%的胰蛋白酶，在膠體磨中勻漿循環，當pH 值下降至7.5時，取酶解液檢驗肽含量達到多15mg/ml時；結束酶解；當酶解液含肽量< 15mg/ml時，將酶解液置于微波罐中進行微波輔助酶解，微波時間15min。溫度55°C;胰蛋白 酶的活力為5000u/g;
[0048] (5)結束酶解，啟動微波罐最大微波功率，將酶解液升溫至85 °C時，保持5min，滅酶 活完成，得到已滅酶活的酶解液；
[0049] (6)將已滅酶活的酶解液排出，酶解液溫度降至低于50°C時，邊攪拌邊加入用15% 醋酸溶解1.5%殼聚糖溶液，調節pH值至4.8,沉析未酶解的腦蛋白、磷脂及其它大分子雜 質;沉析物用400目濾布離心，過濾，去除沉淀，得到離心液;離心液的溫度38-50°C ;
[0050] (7)將步驟(6)所得的離心液，用0.45um中空纖維膜進行微濾，濾液用能攔截分子 量I OOOODa的超濾膜過濾，透過液即為淡水魚腦多肽溶液，若只做多肽時，將此溶液減壓濃 縮，然后冷凍干燥，即得多肽粉；
[0051 ] (8)當要制備小分子腦肽時，將多肽液進一步用能攔截分子量1000 Da的納濾膜過 濾，濾液再用RO膜濃縮，將濃縮液冷凍，干燥，即得到小分子腦肽;RO膜為能攔截> 150Da的 膜。
[0052] 實施例2:
[0053] 一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，包括如下步驟：
[0054] (1)取出鮮淡水魚頭或解凍的冰凍淡水魚頭，用純凈水洗凈表面的污物、血水及雜 質，摘除魚鰓，機械粉碎至20目，得魚頭漿液；
[0055] (2)按魚頭漿液與純凈水重量比為1:8混合后，用膠體磨研磨勻漿，用NaOH溶液調 pH值至9.0,得到調節好的魚頭勻漿液;所述的調節好的魚頭勻漿液的細度120目；
[0056] (3)將調節好的魚頭勻漿液置于帶攪拌裝置的微波罐中，先微波升溫至60°C，持 續保溫60min;微波罐的頻率為2450mHZ，功率為20KW;
[0057] (4)冷卻至40°C，添加按分離蛋白質量5%的胰蛋白酶，在膠體磨中勻漿循環，當pH 值下降至7.5時，取酶解液檢驗肽含量達到多15mg/ml時；結束酶解；當酶解液含肽量< 15mg/ml時，將酶解液置于微波罐中進行微波輔助酶解，微波時間20min。溫度60°C;胰蛋白 酶的活力為5000u/g;
[0058] (5)結束酶解，啟動微波罐最大微波功率，將酶解液升溫至85°C時，保持5-1 Omin， 滅酶活完成，得到已滅酶活的酶解液；
[0059] (6)將已滅酶活的酶解液排出，酶解液溫度降至低于50°C時，邊攪拌邊加入用15% 醋酸溶解1.5%殼聚糖溶液，調節pH值至5.0,沉析未酶解的腦蛋白、磷脂及其它大分子雜 質;沉析物用400目濾布離心，過濾，去除沉淀，得到離心液;離心液的溫度50°C;
[0060] (7)將步驟(6)所得的離心液，用0.45um中空纖維膜進行微濾，濾液用能攔截分子 量I OOOODa的超濾膜過濾，透過液即為淡水魚腦多肽溶液，若只做多肽時，將此溶液減壓濃 縮，然后冷凍干燥，即得多肽粉；
[0061] (8)當要制備小分子腦肽時，將多肽液進一步用能攔截分子量1000 Da的納濾膜過 濾，濾液再用RO膜濃縮，將濃縮液冷凍，干燥，即得到小分子腦肽;RO膜為能攔截> 150Da的 膜。
[0062] 實施例3:
[0063] -種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，包括如下步驟：
[0064] (1)取出鮮淡水魚頭或解凍的冰凍淡水魚頭，用純凈水洗凈表面的污物、血水及雜 質，摘除魚鰓，機械粉碎至20目，得魚頭漿液；
[0065] (2)按魚頭漿液與純凈水重量比為1:8混合后，用膠體磨研磨勻漿，用NaOH溶液調 pH值至9.0,得到調節好的魚頭勻漿液;所述的調節好的魚頭勻漿液的細度100目；
[0066] (3)將調節好的魚頭勻漿液置于帶攪拌裝置的微波罐中，先微波升溫至60°C，持 續保溫60min;微波罐的頻率為2450mHZ，功率為20KW;
[0067] (4)冷卻至40°C，添加按分離蛋白質量5%的胰蛋白酶，在膠體磨中勻漿循環，當pH 值下降至7.5時，取酶解液檢驗肽含量達到多15mg/ml時；結束酶解；當酶解液含肽量< 15mg/ml時，將酶解液置于微波罐中進行微波輔助酶解，微波時間18min。溫度58°C;胰蛋白 酶的活力為5000u/g;
[0068] (5)結束酶解，啟動微波罐最大微波功率，將酶解液升溫至85 °C時，保持8min，滅酶 活完成，得到已滅酶活的酶解液；
[0069] (6)將已滅酶活的酶解液排出，酶解液溫度降至低于50°C時，邊攪拌邊加入用15% 醋酸溶解1.5%殼聚糖溶液，調節pH值至4.9,沉析未酶解的腦蛋白、磷脂及其它大分子雜 質;沉析物用400目濾布離心，過濾，去除沉淀，得到離心液;離心液的溫度42°C;
[0070] (7)將步驟(6)所得的離心液，用0.45um中空纖維膜進行微濾，濾液用能攔截分子 量I OOOODa的超濾膜過濾，透過液即為淡水魚腦多肽溶液，若只做多肽時，將此溶液減壓濃 縮，然后冷凍干燥，即得多肽粉；
[0071] (8)當要制備小分子腦肽時，將多肽液進一步用能攔截分子量1000 Da的納濾膜過 濾，濾液再用RO膜濃縮，將濃縮液冷凍，干燥，即得到小分子腦肽;RO膜為能攔截> 150Da的 膜。
[0072] 表1本發明利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法的有益效果
[0074] 從表1可知，本發明利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法得到魚頭多肽的 純度均在61%以上，魚腦蛋白酶解得到多肽的酶解率均在60%以上。可見，本發明的方法釆 用微波輔助與膜過濾技術，不需溶劑，酸堿用量少，酶解時間短，轉化率高，具有良好的市場 前景。
[0075] 前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變 和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應 用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。
【主權項】
1. 一種利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 取出鮮淡水魚頭或解凍的冰凍淡水魚頭，用純凈水洗凈表面的污物、血水及雜質， 摘除魚鰓，機械粉碎至20目，得魚頭漿液； (2) 按魚頭漿液與純凈水重量比為1:8混合后，用膠體磨研磨勻漿，用NaOH溶液調pH值 至9.0，得到調節好的魚頭勻漿液； (3) 將調節好的魚頭勻漿液置于帶攪拌裝置的微波罐中，先微波升溫至60°C，持續保溫 60min； (4) 冷卻至40°C，添加按分離蛋白質量5%的胰蛋白酶，在膠體磨中勻漿循環，當pH值下 降至7.5時，取酶解液檢驗肽含量達到多15mg/ml時；結束酶解；當酶解液含肽量< 15mg/ml 時，將酶解液置于微波罐中進行微波輔助酶解，微波時間15_20min。溫度55-60°C; (5) 結束酶解，啟動微波罐最大微波功率，將酶解液升溫至85 °C時，保持5-1 Omin，滅酶 活完成，得到已滅酶活的酶解液； (6) 將已滅酶活的酶解液排出，酶解液溫度降至低于50°C時，邊攪拌邊加入用15%醋酸 溶解1.5%殼聚糖溶液，調節pH值至4.8-5.0,沉析未酶解的腦蛋白、磷脂及其它大分子雜 質;沉析物用400目濾布離心，過濾，去除沉淀，得到離心液； (7) 將步驟（6)所得的離心液，用0.45um中空纖維膜進行微濾，濾液用能攔截分子量 lOOOODa的超濾膜過濾，透過液即為淡水魚腦多肽溶液，若只做多肽時，將此溶液減壓濃縮， 然后冷凍干燥，即得多肽粉； (8) 當要制備小分子腦肽時，將多肽液進一步用能攔截分子量lOOODa的納濾膜過濾，濾 液再用R0膜濃縮，將濃縮液冷凍，干燥，即得到小分子腦肽。2. 根據權利要求1所述的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，其特征在于，步 驟(2)中的所述的調節好的魚頭勻漿液的細度60-120目。3. 根據權利要求1所述的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，其特征在于，步 驟(3)中的微波罐的頻率為2450mHZ，功率為20KW。4. 根據權利要求1所述的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，其特征在于，步 驟(4)中的胰蛋白酶的活力為5000u/g。5. 根據權利要求1所述的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，其特征在于，步 驟(6)中的離心時，離心液的溫度38-50°C。6. 根據權利要求1所述的利用淡水魚頭蛋白酶解制備魚頭多肽的方法，其特征在于，步 驟(8)中的R0膜為能攔截> 150Da的膜。
【文檔編號】C07K1/30GK106086139SQ201610652811
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月10日 公開號201610652811.9, CN 106086139 A, CN 106086139A, CN 201610652811, CN-A-106086139, CN106086139 A, CN106086139A, CN201610652811, CN201610652811.9
【發明人】郭鳳蘭, 劉計汕, 梁尚文
【申請人】柳江縣渡莊生物科技有限公司