一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，屬于活性肽技術領域。針對目前寬體金線蛭活性肽的制備方法，蛋白水解率較低，活性肽損失較大、操作復雜、不適合工業化大規模生成應用的問題，本發明提供了一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，本發明通過培育枯草桿菌，提取堿性蛋白酶粗提液，通過鹽析、等電點沉淀及共溶劑沉淀，靜置后分成三相，取中間相酶蛋白沉淀，分離純化得高活性堿性蛋白酶，再用其酶解寬體金線蛭分離蛋白液，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作簡單。
【專利說明】
一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，屬于活性肽技術領域。
【背景技術】
[0002]傳統中醫學當中，因寬體金線蛭有抗凝血、抗血栓、降血脂等功效，而被廣泛用于治療高血壓、瘀血腫痛等病癥，多年來其具體有效成分仍不清楚。近年來，對其有效活性成分的研究成為一大熱點。呂丹等發現，活體寬體金線蛭的水分含量為85.61%，粗蛋白含量為11.24%，糖類含量為1.43%，總脂肪含量為0.95%，灰分含量為0.77%。除了水分，蛋白質占了該軟體動物的大部分組成。江佩芬等對數種蛋白質水蛭進行電泳分析，發現寬體金線蛭和日本醫蛭的蛋白條帶較接近。汪波等對七種水蛭可溶性蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，發現七種水蛭的蛋白帶既有相同，又有不同之處。寬體金線蛭的蛋白條帶數達到條。可以看出，不同品種的水蛭蛋白質相近，但又存在顯著性差異。在氨基酸分析上，研究者們得出的結論是，天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸和甘氨酸在寬體金線蛭中占有較高的比例，蛋氨酸、色氨酸比例均較低。寬體金線蛭抗凝抗血栓的功效對內源性及外源性凝血均有抑制效果，該作用可能在抵抗血栓形成、溶解已成血栓中有積極意義。不僅能抑制血栓素B2的形成，而且還能提高血漿中6-酮-前列腺素Fla的量，從而促使血管內皮抗凝促纖溶活性物質的釋放，增加內皮細胞的抗栓能力。但是，目前寬體金線蛭活性肽的制備方法，蛋白水解率較低，活性肽損失較大、操作復雜、不適合工業化大規模生成應用，因此，對于體金線蛭活性肽的優化研究顯得尤為重要。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題:針對目前寬體金線蛭活性肽的制備方法，蛋白水解率較低，活性肽損失較大、操作復雜、不適合工業化大規模生成應用的問題，本發明提供了一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，本發明通過培育枯草桿菌，提取堿性蛋白酶粗提液，通過鹽析、等電點沉淀及共溶劑沉淀，靜置后分成三相，取中間相酶蛋白沉淀，分離純化得高活性堿性蛋白酶，再用其酶解寬體金線蛭分離蛋白液，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作簡單。
[0004]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:
(1)分別稱取4?5g氯化鈉，0.1?0.2g磷酸二氫鉀，0.01?0.02g七水合硫酸鎂，I?2g蛋白胨，5?6g葡萄糖，加入95?10mL去離子水中，以200?300r/min攪拌20?30min，加熱至沸騰后，保溫20~30min得培養液，按接種量8?10%，將枯草桿菌接種至培養液中，在30~32°C下培養22?24h，量取2?3mL培養液，與1.5?1.6L去離子水混合，分別加入40?42g氯化鈉，1.5?1.6g磷酸二氫鉀，0.15?0.16g七水合硫酸鎂，11?12g牛肉膏，11?12g酵母浸粉，22?24g蔗糖，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至10.2~10.5，在30~32°(:下，以120~13(^/1^11振蕩發酵110~120h，將發酵液置于離心機中，以12000r/min離心30?40min，取上清液，得粗酶液；
(2)稱取18?25g硫酸銨置于50?55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入100?150mL上述粗酶液，加入150?200mL叔丁醇，在22?25°C下，以300?400r/min攬摔20?30min，靜置I?2h，置入離心機，在4000?5000r/min離心10~15min，收集中間沉淀相，加入100?120mL pH為7.5-7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液，備用；
(3)稱取50?SOg新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200?320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.0?8.5，在35?37 °C恒溫水浴中加熱I?2h，以8000?9000r/min離心15?20min，取上清液，用質量濃度為1%鹽酸溶液調節pH至4.5~5.0，轉入離心機，以8000?9000r/min離心15?20min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8-7.0,旋轉蒸發至原溶液體積的40?50%，得寬體金線蛭分離蛋白液；
(4)向上述寬體金線輕分離蛋白液中，加入50?60mL上述步驟(2)制備的高活性堿性蛋白酶液，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節PH至8.0-8.5,在50?55°C下，酶解3?4h，置于沸水浴中滅酶10?15min，冷卻后置于5000?6000r/min冷凍離心機中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2?3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0005]本發明的應用方法是:將本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫藥輸液中，添加量為50?100mg/mL，抗凝血率提高10?12%，血栓性疾病痊愈率提尚5?8%。
[0006]本發明的有益技術效果是:
(I)本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作簡單；
(2 )本發明制備過程綠色、安全、環保。
【具體實施方式】
[0007]分別稱取4?5g氯化鈉，0.1?0.2g磷酸二氫鉀，0.01?0.02g七水合硫酸鎂，I?2g蛋白胨，5?6g葡萄糖，加入95?10mL去離子水中，以200?300r/min攪拌20?30min，加熱至沸騰后，保溫20~30min得培養液，按接種量8?10%，將枯草桿菌接種至培養液中，在30~32°C下培養22?24h，量取2?3mL培養液，與1.5~1.6L去離子水混合，分別加入40?42g氯化鈉，1.5~1.6g磷酸二氫鉀，0.15?0.16g七水合硫酸鎂，11?12g牛肉膏，11?12g酵母浸粉，22?24g蔗糖，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至10.2~10.5，在30~32°(:下，以120~13(^/1^11振蕩發酵110~120h，將發酵液置于離心機中，以12000r/min離心30?40min，取上清液，得粗酶液;稱取18?25g硫酸銨置于50?55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入100?150mL上述粗酶液，加入150?200mL叔丁醇，在22?25°C下，以300?400r/min攪拌20?30min，靜置I?2h，置入離心機，在4000?5000r/ min離心10?15min，收集中間沉淀相，加入100?120mL pH為7.5-7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取50?80g新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200?320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.0-8.5,在35?37°C恒溫水浴中加熱卜2h，以8000?9000r/min離心15?20min，取上清液，用質量濃度為1%鹽酸溶液調節pH至4.5~5.0，轉入離心機，以8000?9000r/min離心15?20min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8?7.0，旋轉蒸發至原溶液體積的40?50%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入50?60mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.0~8.5，在50?55 °C下，酶解3?4h，置于沸水浴中滅酶10?15min，冷卻后置于5000?6000r/min冷凍離心機中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2?3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0008]實例I
分別稱取4g氯化鈉，0.1g磷酸二氫鉀，0.0lg七水合硫酸鎂，Ig蛋白胨，5g葡萄糖，加入95mL去離子水中，以200r/min攪拌20min，加熱至沸騰后，保溫20min得培養液，按接種量8%，將枯草桿菌接種至培養液中，在300C下培養22h，量取2mL培養液，與1.5L去尚子水混合，分別加入40g氯化鈉，1.5g磷酸二氫鉀，0.15g七水合硫酸鎂，I Ig牛肉膏，I Ig酵母浸粉，22g蔗糖，用質量濃度為I %氫氧化鈉溶液調節PH至10.2，在30 °C下，以120r/min振蕩發酵I 1h，將發酵液置于離心機中，以12000r/min離心30min，取上清液，得粗酶液;稱取18g硫酸銨置于50°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入10mL上述粗酶液，加入150mL叔丁醇，在22°C下，以300r/min攪拌20min，靜置lh，置入離心機，在4000r/min離心1min，收集中間沉淀相，加入10mL pH為7.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取50g新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.0，在350C恒溫水浴中加熱Ih，以8000r/min離心15min，取上清液，用質量濃度為1%鹽酸溶液調節pH至5.0，轉入離心機，以8000r/min離心15min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8，旋轉蒸發至原溶液體積的40%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入50mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.0，在50 0C下，酶解3h，置于沸水浴中滅酶1min，冷卻后置于5000r/min冷凍離心機中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0009]本發明的應用方法是:將本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫藥輸液中，添加量為50mg/mL，抗凝血率提高10%，血栓性疾病痊愈率提高5%。
[0010]實例2
分別稱取4.5g氯化鈉，0.15g磷酸二氫鉀，0.015g七水合硫酸鎂，1.5g蛋白胨，5.5g葡萄糖，加入98mL去離子水中，以250r/min攪拌25min，加熱至沸騰后，保溫25min得培養液，按接種量9%，將枯草桿菌接種至培養液中，在310C下培養23h，量取2.5mL培養液，與1.55L去尚子水混合，分別加入41g氯化鈉，1.55g磷酸二氫鉀，0.15g七水合硫酸鎂，11.5g牛肉膏，11.5g酵母浸粉，23g蔗糖，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至10.3，在31°C下，以125r/min振蕩發酵115h，將發酵液置于離心機中，以12000r/min離心35min，取上清液，得粗酶液;稱取20g硫酸銨置于52 °C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入120mL上述粗酶液，加入180mL叔丁醇，在23 °C下，以350r/min攪拌25min，靜置1.5h，置入離心機，在45001'/111；[11離心121]1；[11，收集中間沉淀相，加入11011^ pH為7.8磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取70g新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入280mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.2，在35?37 °C恒溫水浴中加熱1.5h，以8500r/min離心18min，取上清液，用質量濃度為1%鹽酸溶液調節pH至4.8，轉入離心機，以8500r/min離心18min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.9，旋轉蒸發至原溶液體積的45%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入55mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.2，在52 0C下，酶解3.5h，置于沸水浴中滅酶12min，冷卻后置于5500r/min冷凍離心機中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2.5h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0011]本發明的應用方法是:將本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫藥輸液中，添加量為80mg/mL，抗凝血率提高11%，血栓性疾病痊愈率提高7%。
[0012]實例3
分別稱取5g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.02g七水合硫酸鎂，2g蛋白胨，6g葡萄糖，加入10mL去離子水中，以300r/min攪拌30min，加熱至沸騰后，保溫30min得培養液，按接種量10%，將枯草桿菌接種至培養液中，在32°C下培養24h，量取3mL培養液，與1.6L去尚子水混合，分別加入42g氯化鈉，1.6g磷酸二氫鉀，0.16g七水合硫酸鎂，12g牛肉膏，12g酵母浸粉，24g蔗糖，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至10.5，在32°C下，以130r/min振蕩發酵120h，將發酵液置于離心機中，以12000r/min離心40min，取上清液，得粗酶液;稱取25g硫酸銨置于55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入150mL上述粗酶液，加入200mL叔丁醇，在25°C下，以400r/min攪拌30min，靜置2h，置入離心機，在5000r/min離心15min，收集中間沉淀相，加入120mL pH為7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取SOg新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.5，在37°C恒溫水浴中加熱2h，以9000r/min離心20min，取上清液，用質量濃度為1%鹽酸溶液調節pH至4.5，轉入離心機，以9000r/min離心20min，取沉淀，加入去離子水至pH為7.0，旋轉蒸發至原溶液體積的50%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入60mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.5，在55 °C下，酶解4h，置于沸水浴中滅酶15min，冷卻后置于6000r/min冷凍離心機中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0013]本發明的應用方法是:將本發明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫藥輸液中，添加量為100mg/mL，抗凝血率提高12%，血栓性疾病痊愈率提高8%。
【主權項】
1.一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)分別稱取4?5g氯化鈉，0.1?0.2g磷酸二氫鉀，0.0l?0.02g七水合硫酸鎂，I?2g蛋白胨，5?6g葡萄糖，加入95?10mL去離子水中，以200?300r/min攪拌20?30min，加熱至沸騰后，保溫20~30min得培養液，按接種量8?10%，將枯草桿菌接種至培養液中，在30~32°C下培養22?24h，量取2?3mL培養液，與1.5~1.6L去離子水混合，分別加入40?42g氯化鈉，1.5~1.6g磷酸二氫鉀，0.15?0.16g七水合硫酸鎂，11?12g牛肉膏，11?12g酵母浸粉，22?24g蔗糖，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至10.2~10.5，在30~32°(:下，以120~13(^/1^11振蕩發酵110~120h，將發酵液置于離心機中，以12000r/min離心30?40min，取上清液，得粗酶液； (2)稱取18?25g硫酸銨置于50?55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入100?150mL上述粗酶液，加入150?200mL叔丁醇，在22?25°C下，以300?400r/min攬摔20?30min，靜置I?2h，置入離心機，在4000?5000r/min離心10~15min，收集中間沉淀相，加入100?120mL pH為7.5-7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液，備用； (3)稱取50?SOg新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200?320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節pH至8.0?8.5，在35?37 °C恒溫水浴中加熱I?2h，以8000?9000r/min離心15?20min，取上清液，用質量濃度為1%鹽酸溶液調節pH至4.5~5.0，轉入離心機，以8000?9000r/min離心15?20min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8-7.0,旋轉蒸發至原溶液體積的40?50%，得寬體金線蛭分離蛋白液； (4)向上述寬體金線輕分離蛋白液中，加入50?60mL上述步驟(2)制備的高活性堿性蛋白酶液，用質量濃度為1%氫氧化鈉溶液調節PH至8.0-8.5,在50?55°C下，酶解3?4h，置于沸水浴中滅酶10?15min，冷卻后置于5000?6000r/min冷凍離心機中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2?3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
【文檔編號】C12N9/56GK106086135SQ201610462169
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】袁春華, 王龍
【申請人】袁春華