一種鎘超標大米的加工利用方法
【專利摘要】本發明公開了一種鎘超標大米的加工利用方法，通過半理性設計及驗證實驗選擇金屬親和性好的多肽(BMP)和麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)及麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)活性高的基因進行人工合成，構建序列為SEQ NO.1金屬親和多肽BMP、序列為SEQ NO2的MTSase及序列為SEQ NO3的MTHase分別展示在畢赤酵母表面的基因工程菌，分別經發酵培養、離心脫水和冷凍干燥獲得3種酵母基因工程菌菌體，然后分別將其加入到鎘米分離所得鎘蛋白的水解液及液化淀粉乳中進行脫鎘或催化反應后再進行相應處理，達到鎘米脫鎘同時生產出符合食品用多肽和海藻糖產品的目的。
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品加工和生物技術領域，具體涉及一種利用生物技術將鎘超標稻米 降鎘并加工成大米蛋白肽和海藻糖的方法。 一種鎘超標大米的加工利用方法
【背景技術】
[0002]鎘米，一般指鎘含量超標（中國國標為0.2mg/kg)的大米。過去幾十年，由于片面追 求GDP的增長和對環保的不重視，中國土壤污染越來越嚴重，大米鎘等重金屬超標也越來越 嚴重;2008年南京農大潘根興團隊在全國多個縣級以上市場隨機采購樣品，結果表明10% 左右的市售大米鎘超標;2013年廣東鎘米風波中報道湖南、江西等地流向廣東的鎘米最高 竟超過國標6倍；由于土地污染治理困難，今后相當長一段時間中國將面臨大量鎘米的加工 處理難題;楊居榮等人的研究表明，鎘在稻米中主要與蛋白質結合，與淀粉結合較少;而現 在的去鎘方法多集中在物理或化學方法，少見生物方法去鎘，更缺乏將鎘米脫鎘后同時加 工成尚附加值廣品如蛋白妝、海澡糖等廣品的研究。
[0003] 海藻糖(Trehalose)是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1一糖苷鍵相連而成的非還原性 二糖，由于其具有對生物體優良的抗逆保護作用等優良性能而被譽為"生命之糖"和"二十 一世紀的新型糖類"，其大規模制造方法受到廣泛關注;海藻糖現在主要以雙酶法或單酶法 生產，兩法各有利弊，雙酶法以淀粉為原料，原料成本低，但酶成本高，而且多數雙酶反應溫 度較低;單酶法以麥芽糖為原料，酶成本較低，但麥芽糖的純度對轉化率高低影響很大，而 高純度麥芽糖價格高，因此，原料成本高。
[0004] 展示蛋白或酶的酵母菌細胞具有固定化可重復使用的優點，又具有制備簡單，可 高密度培養獲得大量菌體，成本較低的特點，因而自上世紀末問世以來，發展迅猛，已有許 多種蛋白或酶被成功表達的報道;馮俠等(基于展示技術的Cd 2+結合肽篩選與酵母重金屬吸 附研究[J].河南農業科學，2013,42(9): 142-145)報道將十二肽展示在釀酒酵母EBY100 上，誘導24h后得到能吸附Cd2+的酵母菌，但其對Cd 2+的吸附率不高，只有30.4%;以往單、雙 酶法生產海藻糖基本上是利用大腸桿菌生產單、雙酶，其催化反應時間長，而且酶不能重復 利用，發明人曾在CN104046665A公布利用酵母展示海藻糖合成酶應用于單酶法生產海藻 糖，但未涉及雙酶法，CN201510431597. X報道了同時展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)及麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)于酵母菌表面轉化淀粉生產海藻糖，但兩者 比例并不方便隨原料等不同條件變化而改變，在實際生產中仍有困難。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種鎘超標大米的加工利用方法。
[0006] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0007] 所述鎘超標大米的加工利用方法包括如下步驟：
[0008] (1)將鎘超標大米浸泡、磨漿后加淀粉液化酶在100-110°c條件分解30-60分鐘 后，得到DE值為3-12的淀粉乳，用板框過濾機除去鎘蛋白后得到固形物質量百分比含量為 20-30%的淀粉乳，被除去的鎘蛋白留存備用；
[0009] (2)將所得的鎘蛋白用蛋白酶分解后，用展示金屬親和肽(BMP)的畢赤酵母基因工 程菌吸附蛋白酶分解游離出來的鎘等重金屬，然后經離心分離除去吸鎘后的酵母，收集得 到降鎘大米蛋白肽，將降鎘大米蛋白肽用作食品或飼料原料；
[0010]將所得的淀粉乳以重量份計按每200-300份淀粉乳中加入2-8份展示麥芽寡糖 基海藻糖合成酶(MTSase)的畢赤酵母基因工程菌及1 一3份展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶 (MTHase)的畢赤酵母基因工程菌，于40-60°C、pH4.5-7條件下進行催化反應15-20h后過 濾分離，將過濾分離后所得的反應液再經離心過濾、離交、濃縮得到海藻糖糖漿；
[0011]其中，所述金屬親和肽的DNA編碼序列如SEQ NO. 1所示;所述麥芽寡糖基海藻糖合 成酶的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 2所示;所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA編碼序列如 SEQ ID NO.3所示。所述展示金屬親和肽的畢赤酵母基因工程菌制備方法如下:合成金屬親 和肽DNA序列，將合成得到的DNA克隆在pUC57載體上，然后進一步亞克隆到pPIC9K載體中， 再轉化到畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115(該畢赤酵母為市售商品）中，得到展示金屬親 和肽的畢赤酵母基因工程菌。將所述展示金屬親和肽的畢赤酵母基因工程菌依次在YPD和 BMGY培養基中分別擴增培養16-32h及96-120h，使金屬親和肽產量隨酵母菌的增殖大幅 增加。
[0012] 所述展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌的制備方法如下:合成 麥芽寡糖基海藻糖合成酶DNA序列，將合成得到的DNA克隆在pUC57載體上，然后進一步亞克 隆到pPIC9K載體中，再轉化畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115中，得到展示麥芽寡糖基海 藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌。將所述展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤酵母基因 工程菌依次在YH)和BMGY培養基中分別擴增培養16-32h及96-120h，使麥芽寡糖基海藻糖 合成酶產量隨酵母菌的增殖大幅增加。
[0013] 所述展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基因工程菌的制備方法如下:合成 麥芽寡糖基海藻糖合成酶DNA序列，將合成得到的DNA克隆在pUC57載體上，然后進一步亞克 隆到pPIC9K載體中，再轉化畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115中，得到展示麥芽寡糖基海 藻糖水解酶的畢赤酵母基因工程菌。將所述展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基因 工程菌依次在YH)和BMGY培養基中分別擴增培養16-32h及96-120h，使麥芽寡糖基海藻糖 水解酶產量隨酵母菌的增殖大幅增加。
[0014] 優選地，將經過濾分離后的展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌 和展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基因工程菌再經沖洗、回收后，重復用于催化 淀粉乳生產海藻糖。
[0015] 優選地，將海藻糖糖漿制成海藻糖質量百分比濃度為20-70%的海藻糖糖漿，或 者將海藻糖漿進一步經濃縮、結晶、離心、干燥后得到純度在98%以上的結晶海藻糖。
[0016] 下面對本發明作進一步說明：
[0017] 本發明所要解決的技術問題一是構建吸附效果更好的酵母基因工程菌來更有效 地脫去鎘米蛋白酶解游離出來的鎘，二是分別構建將淀粉轉化成海藻糖的麥芽寡糖基海藻 糖合成酶MTSase及麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase展示于酵母菌表面的基因工程菌，從技 術上進一步方便生產使用，降低大米生產海藻糖的加工利用成本，提升鎘米的加工附加值， 降低鎘米因不能食用只能賤賣所造成的經濟損失。
[0018] 本發明通過半理性設計等方法，在前人基因序列基礎上進行改進，設計合成一系 列新的基因序列，進行序列合成和多個相關基因工程菌構建，然后通過驗證實驗選擇鎘親 和性好的DNA序列為SEQ NO. 1的BMP展示在畢赤酵母表面，以及活性較高的DNA序列為SEQ NO.2的MTSase及DNA序列為SEQ N03的MTHase分別展示在畢赤酵母表面，通過這些基因工程 菌的發酵培養獲得大量酵母基因工程菌，將其分別加入到鎘米蛋白水解液及大米淀粉液化 乳中分別進行脫鎘及催化反應，從而達到鎘米脫鎘同時生產出符合食品工業用多肽和更低 成本海藻糖產品的目的。
[0019] 其中，展示金屬親和肽BMP的畢赤酵母是這樣制作的：將金屬親和肽DNA序列SEQ N0:1人工合成，然后將合成得到的基因克隆在pUC57載體上，進一步亞克隆到pPIC9K載體 中，再轉化到畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115,得到展示BMP的畢赤酵母，然后分別依次 在YH)和BMGY培養基中再分別擴增培養16-32h及96-120h，離心脫水或冷凍干燥即得到大 量展示BMP-GSl 15的畢赤酵母基因工程菌。
[0020] 其中，分別展示了麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)及麥芽寡糖基海藻糖水解酶 (MTHase)的畢赤酵母是這樣制作的：將DNA序列SEQ NO. 2的MTSase和DNA序列SEQ NO. 3的 MTHase人工合成，然后將合成得到的基因分別克隆在pUC57載體上，進一步亞克隆到pPIC9K 載體中，再轉化到畢赤酵母(Pichia Pastoris)GSl 15，得到分別展示MTSase和MTHase的畢 赤酵母，然后分別依次在YB)和BMGY培養基中再分別擴增培養16-32h及96-120h，離心脫 水或冷凍干燥即得到大量展示MTSase或MTHase的畢赤酵母基因工程菌。
[0021] 以重量計將展示SEQ NO. 1金屬親和多肽的酵母菌1 一6份加入加入到鎘米蛋白水 解液進行攪拌脫鎘16-24h、然后離心將脫鎘酵母與多肽分離，其脫鎘率可達81%以上，能 夠達到將鎘大米蛋白脫去大部分鎘的目的。
[0022] 將所得固形物含量20-30%的淀粉乳以重量計按每200-300份各加入2-8份展 示序列SEQ NO: 2麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌及1 一3份展示序列 SEQN0:3麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基因工程菌于40-60°C、pH4.5-7條件下進 行催化反應15-20h后，將其過濾分離，所得反應液經離心過濾、離交、濃縮得到海藻糖糖 漿。
[0023]與現有技術相比，本發明的優越性在于：由淀粉生產海藻糖的轉化率達到81 %以 上，反應溫度為40-60°C，反應時間縮短，只要15-20h，而且反應后分離所得基因工程菌通 過沖洗過濾后可重復用來催化淀粉乳生產海藻糖，重復使用5次后，其相對酶活力仍保持原 來的63.8%，因而海藻糖生產成本大大降低。
【具體實施方式】
[0024]以下通過具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。
[0025] 實施例1畢赤酵母展示金屬親和蛋白MBP
[0026] 將金屬親和肽DNA序列SEQ NO. 1人工合成，然后將合成得到的基因克隆在pUC57載 體上，進一步亞克隆到pPIC9K載體中，再轉化到畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115,得到展 示BMP的畢赤酵母，然后分別依次在YPD和BMGY培養基中再分別擴增培養16-32h及96- 120h，離心脫水或冷凍干燥即得到大量展示BMP-GS115的畢赤酵母基因工程菌。
[0027] 實施例2畢赤酵母展示金屬親和蛋白脫鎘處理
[0028] 鎘超標大米經浸泡、磨漿、液化、壓濾所得濾渣即為鎘蛋白，將該鎘蛋白加等重量 的水后，以重量計加入1-2%的蛋白酶水解16-24h，然后用NaOH調pH到8-10，以重量計將 1 一3%展示SEQ NO: 1的金屬親和肽的酵母菌MBP加入到鎘米蛋白水解液進行攪拌12-24h， 用離心機分離，所得沉淀即為富鎘酵母，收集上清液加酸調pH到6-8,所得沉淀干燥后即為 大米蛋白肽，可用作食品或飼料原料。
[0029]實施例3酵母工程菌脫鎘程度的測定
[0030] 按國標法用原子吸收分光光度計測定Cd2+離子質量濃度，然后計算吸收率，進而計 算對鎘的吸附率，測定結果如表1所示：
[0031] 表1 MBP酵母工程菌脫鎘效果
[0033]實施例4畢赤酵母展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)
[0034] 麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)DNA序列如SEQ N02所示，基因克隆在pUC57載 體上，依次將MTSase亞克隆到pPIC9K載體中，采用膠回收試劑盒回收目的基因片段和 PPIC9K載體片段，分別用水洗脫，之后用T4DNA Ligase進行連接反應，再轉化到DH5a感受態 細胞中，涂布在含有311^和1^11&抗性的1^(]\1;[1161'131'(^11(1%似(]1):15 /^6口1:〇116,0.5% yeast extract，and l%NaCl)固體培養基上進行37°C過夜培養;挑取克隆進行搖菌，質粒 抽提，并進行Eco RI和Not I雙酶切鑒定；構建pPIC9K-MTSase載體后，將其轉化到畢氏酵 母GS115中。
[0035]實施例5畢赤酵母展示芽寡糖基海藻糖合成酶(MTHase)
[0036] 麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)DNA序列如SEQ N03所示，基因克隆在pUC57載 體上，依次將MTHase亞克隆到pPIC9K載體中，采用膠回收試劑盒回收目的基因片段和 PPIC9K載體片段，分別用水洗脫，之后用T4DNALigase進行連接反應，再轉化到DH5a感受態 細胞中，涂布在含有311^和1^11&抗性的1^(]\1;[1161'131'(^11(1%似(]1):15 /^6口1:〇116,0.5% yeast extract，and l%NaCl)固體培養基上進行37°C過夜培養;挑取克隆進行搖菌，質粒 抽提，并進行Eco RI和Not I雙酶切鑒定；構建pPIC9K-MTSase載體后，將其轉化到畢氏酵 母GS115中。
[0037] 基因工程菌擴增培養
[0038] 1)、從平板中挑取單菌落，接種于Yro培養基中，30°C，250rpm培養16-32h;
[0039] 2)、按1%的接種量轉移到新鮮的81?^培養基中，30°(：，250印111培養5(1，每隔2411加 甲醇誘導，收集發酵菌體，用PH8.0緩沖液洗滌3次，用少量緩沖液重懸，即得重組海藻糖合 成酶基因工程菌菌液，將其離心脫水或冷凍干燥備用。
[0040] 實施例6利用大米淀粉乳生產海藻糖
[0041 ] 將所得固含20-30 %的淀粉乳以重量計按每200-300份各加入2-6份展示序列 SEQN0: 2麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)的畢赤酵母基因工程菌及1 一3份展示序列 SEQN0:3麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的畢赤酵母基因工程菌于40-60°C、pH4.5-7 條件下進行催化反應15-20h后，將其過濾分離，所得反應液經離心過濾、離交、濃縮得到海 藻糖糖漿。
[0042]然后用HPLC對反應產物進行各種糖含量的分析，結果如表2所示： 「ofvm 豐9甫有/f擊田e賠·桂〇滋7^和姑纖?任 LUMbj 買施例7結晶海澡糖的生嚴
[0046]上述生產所得海藻糖糖漿可根據市場需要制成海藻糖濃度在20-70 %的海藻糖 糖漿，也可經濃縮、結晶、離心、干燥后得到純度在98 %以上的結晶海藻糖。
【主權項】
1. 一種鎘超標大米的加工利用方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 將鎘超標大米浸泡、磨漿后加淀粉液化酶在100-110°c條件分解30-60分鐘后，得 到DE值為3-12的淀粉乳，過濾除去鎘蛋白后得到固形物質量百分比含量為20-30%的淀 粉乳，被除去的鎘蛋白留存備用； (2) 將所得的鎘蛋白用蛋白酶分解后，用展示金屬親和肽的畢赤酵母基因工程菌吸附 蛋白酶分解游離出來的重金屬，然后經離心分離除去吸鎘后的酵母，收集得到降鎘大米蛋 白肽，將降鎘大米蛋白肽用作食品或飼料原料； 將所得的淀粉乳以重量份計按每200-300份淀粉乳中加入2-8份展示麥芽寡糖基海 藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌及1 一3份展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基 因工程菌，于40-60°C、pH4.5-7條件下進行催化反應15-20h后過濾分離，將過濾分離后 所得的反應液再經離心過濾、離交、濃縮得到海藻糖糖漿。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述金屬親和肽的DNA編碼序列如SEQ NO. 1 所示;所述麥芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA編碼序列如SEQ ID NO.2所示;所述麥芽寡糖基 海藻糖水解酶的DNA編碼序列如SEQ ID NO.3所示。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述展示金屬親和肽的畢赤酵母基因工程菌 制備方法如下：合成金屬親和肽DNA序列，將合成得到的DNA克隆在pUC57載體上，然后進一 步亞克隆到PPIC9K載體中，再轉化到畢赤酵母GS115中，得到展示金屬親和肽的畢赤酵母基 因工程菌。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，將所述展示金屬親和肽的畢赤酵母基因工程 菌依次在YH)和BMGY培養基中分別擴增培養16-32h及96- 120h，使金屬親和肽產量隨酵母 菌的增殖大幅增加。5. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤酵 母基因工程菌的制備方法如下:合成麥芽寡糖基海藻糖合成酶DNA序列，將合成得到的DNA 克隆在PUC57載體上，然后進一步亞克隆到pPIC9K載體中，再轉化畢赤酵母GS115中，得到展 示麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，將所述展示麥芽寡糖基海藻糖合成酶的畢赤 酵母基因工程菌依次在YH)和BMGY培養基中分別擴增培養16-32h及96-120h，使麥芽寡糖 基海藻糖合成酶產量隨酵母菌的增殖大幅增加。7. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵 母基因工程菌的制備方法如下:合成麥芽寡糖基海藻糖合成酶DNA序列，將合成得到的DNA 克隆在PUC57載體上，然后進一步亞克隆到pPIC9K載體中，再轉化畢赤酵母GS115中，得到展 示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基因工程菌。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，將所述展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤 酵母基因工程菌依次在YH)和BMGY培養基中分別擴增培養16-32h及96-120h，使麥芽寡糖 基海藻糖水解酶產量隨酵母菌的增殖大幅增加。9. 如權利要求1至8任一項所述的方法，其特征在于，將經過濾分離后的展示麥芽寡糖 基海藻糖合成酶的畢赤酵母基因工程菌和展示麥芽寡糖基海藻糖水解酶的畢赤酵母基因 工程菌再經沖洗、回收后，重復用于催化淀粉乳生產海藻糖。10. 如權利要求1至8任一項所述的方法，其特征在于，將海藻糖糖漿制成海藻糖質量百 分比濃度為20-70%的海藻糖糖漿，或者將海藻糖漿進一步經濃縮、結晶、離心、干燥后得 到純度在98%以上的結晶海藻糖。
【文檔編號】C12N15/81GK106086131SQ201610401919
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】謝艷萍
【申請人】湖南匯升生物科技有限公司