一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法。該方法通過制備米糠液，配置米糠培養基，發酵制備阿魏酰低聚糖。本發明采用發酵的方法制備阿魏酰低聚糖，使得微生物產酶與酶解過程合一，省去了酶制劑生產過程中的分離純化工序，降低了成本，提高了產率。同時，微生物生長過程中對淀粉、蛋白質等成分的利用解決了酶解過程中水解物質的處理問題，資源得到合理利用，并減少了環境污染。本發明的方法簡單易行，制備的阿魏酰低聚糖產率高，易于純化。
【專利說明】
一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種低聚糖發酵制備方法，特別涉及一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖 的方法。
【背景技術】
[0002] 我國是稻谷的主要生產國，稻谷產量約占全球稻谷生產的37%，米糠是稻谷加工 的主要副產物。在國外，米糠被譽為"天賜營養源"，聯合國工業發展組織把米糠稱為"一種 未充分利用的資源"，具有非常高的保健開發價值。米糠含有多種營養元素和生理性活性物 質，其中含有一定量的阿魏酸，經過酶解可并進一步制備獲得阿魏酰低聚糖，阿魏酰低聚糖 (FOs)具有卓越的生物活性。
[0003] 阿魏酰低聚糖是一類廣泛存在于禾本科植物中的不同糖鏈位置上的羥基與阿魏 酸(FA)羧基酯化形成的功能性低聚糖。FOs對低密度脂蛋白的氧化具有強烈的抑制作用，因 此，有望成為生產降血脂、防止動脈硬化藥物的新原料;FOS能夠清除自由基、抑制脂質氧 化、減輕氧化損傷等，因此可以作為功能性食品的配料，從而起到保健作用;FOs能夠促進體 內益生菌的增殖，因此可將其添加到食品中，以食物的方式進入腸道，改善腸道內微生物的 生態環境，對人體便秘及癌癥的發生有一定的治療和預防作用;FOs具有抗氧化和抑菌作 用，故可作為食品保鮮劑，延長食品的貨架期。所以，其應用前景十分廣闊，有巨大的發展空 間和市場需求。
[0004] 由于FOs較強的生物活性，其高效制備方法也成為多數學者關注的熱點。功能性低 聚糖的制備途徑通常有以下4種:在天然原料中提取;糖基轉移，包括化學轉移和酶轉移;糖 基聚合，包括化學聚合與酶聚合;多糖降解，包括化學降解和酶法降解。阿魏酰低聚糖的制 備方法與功能性低聚糖類似，且制備的原料以禾本科植物為主，目前主要采用物理法、化學 法和生物法。
[0005] 物理法是利用機械降解的方式處理原料，使原料中糖苷鍵斷裂以形成所需產物， 其中微波降解是低聚糖制備的主要方法。該方法利用物料在高溫下生成的水合氫離子及其 形成的有機酸作用，水解半纖維素聚合物，釋放水溶性物質，這些水解產物多為低聚糖。微 波降解為制備低聚糖最主要的物理方法。Rose等利用微波處理法，在玉米麩中提取得到阿 魏酰-阿拉伯糖基低聚木糖，研究表明微波處理溫度和處理時間對FOs的產量影響顯著，溫 度過高或時間過長均會降解FOs，使其產量下降。物理法制備FOs因需嚴格控制處理條件，否 則會造成FOs分解，故較少使用。
[0006] 化學法是利用化學試劑水解原料中的半纖維素，生成不同水解程度的低聚糖，該 方法是早期制備FOs的常用方法。黃汝清等采用草酸蒸煮處理玉米皮制備阿魏酰低聚糖； Al Ierdings等亦采用0.05mol/L的三氟乙酸水解玉米麩IDF獲得FOs ; Schooneveld-Bergmans等利用氫氧化|丐和氫氧化鋇等而家氫氧化物處理麥麩獲得FOs，在處理過程中，溶 劑濃度及處理時間對FOs產量影響顯著，高溫或高濃度的氫氧化物均使FOs降解。但化學法 存在化學物質殘留問題，且高溫或高濃度的氫氧化物均可使FOs降解，產率下降，制得的產 品難以在食品和醫藥行業使用，且其副產物易造成環境污染。
[0007] 生物酶法是利用生物酶試劑的水解作用，打開原料細胞壁多糖，獲得FOs的方法。 植物細胞壁多糖因植物種類不同其單糖組成不同，如米糠等禾本科植物多以木糖聚合而 成，而甜菜半纖維素由半乳糖聚合而成。Yuan Xiaoping等在優化的木聚糖酶水解麥不溶性 膳食纖維制備FOs的工藝條件下，獲得1.5mmol/L的FOs ; Katapodis等利用Thermoascus aurantiacus產生的木聚糖酶水解玉米獲得FOs。姚惠源等利用B.subtilis木聚糖酶對小麥 麩皮中阿魏酰低聚糖的制備進行研究，產物中FOs的濃度達到1.546mmoI/L，盛情情等以纖 維素酶水解米糠提取阿魏酰低聚糖，提取量達到28.48ymol/g;潘曉海等以纖維素酶輔助木 聚糖酶制備阿魏酰低聚糖，濃度達2.127mmol/L。除了上述生物酶降解法制備FOs，也有學者 采用生物酶催化合成制備FOs，Jessica等在正己烷、2-丁酮和氫氧化鈉緩沖系統中，使用 8 %阿拉伯糖、9 %木糖和11 %棉子糖為基質，催化合成FOs。生物酶降解法制備FOs具有反應 溫和的優點，但由于禾本科植物中的阿魏酸，絕大部分存在于不溶性膳食纖維中，通過酯鍵 與木聚糖共價交聯。因此，生物酶降解法制備FOs需要先從原料中制取不溶性膳食纖維，這 樣做既增加生產環節，也產生大量廢水，增加生產成本。
[0008] 生物發酵法是一種新興的制備方法，酶法制備FOs中所用酶制劑多通過微生物發 酵，經分離純化等工序獲得。微生物生長過程是對培養基中營養成分的消耗過程，篩選發酵 菌株并對發酵條件進行控制，可獲得代謝產物。生物發酵法是利用菌株發酵產生淀粉酶、蛋 白酶的同時亦可生成半纖維素酶，因而在其水解淀粉、蛋白質的同時可將原料中的半纖維 素水解，釋放FOs;同時，微生物可水解產物作為其生長所需的營養成分消耗。生物發酵法在 FOs制備中的應用，使得微生物產酶與酶解過程合一，省去了酶制劑生產過程中的分離純化 工序，降低了成本，提高了產率。同時，微生物生長過程中對淀粉、蛋白質等成分的利用解決 了酶解過程中水解物質的處理問題，資源得到合理利用，并減少了環境污染。
[0009] 目前采用發酵法制備FOs的研究報道較少，以米糠為原料、食用真菌為發酵菌株制 備FOs的研究國內外并未見。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于提供一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法。
[0011] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步驟進行：
[0012] (1)制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過70-100目篩子篩分，加入 水中攪拌，制成固含量25-75g/L的米糠液；
[0013] (2)配置培養基：向IL米糠液中添加10-20g葡萄糖，10-20g乳糖和10-20g蛋白胨；
[0014] (3)發酵制備:利用步驟(2)制備的培養基接種食用菌進行液態發酵，控制起始發 酵pH3.8-4.3，發酵溫度23-28 °C，搖床轉速80-120r/min，發酵6-10天，制得阿魏酰低聚糖。
[0015] 所述食用菌為榆黃蘑。
[0016] 所述食用菌的接種量為40-100億cfu/L培養基。
[0017] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，
[0018] (1)米糠經烘干或自然風干后，粉碎過70-90目篩子篩分后，制成固體培養基；
[0019] (2)接種食用菌發酵進行固體發酵90-120天，制得阿魏酰低聚糖。
[0020]所述食用菌為榆黃蘑。
[0021] 所述食用菌的接種量為80-180億cfu/Kg培養基。
[0022] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:本發明采用發酵的方法制備阿魏酰 低聚糖，使得微生物產酶與酶解過程合一，省去了酶制劑生產過程中的分離純化工序，降低 了成本，提高了產率。同時，微生物生長過程中對淀粉、蛋白質等成分的利用解決了酶解過 程中水解物質的處理問題，資源得到合理利用，并減少了環境污染。本發明的方法簡單易 行，制備的阿魏酰低聚糖產率高，易于純化。
【附圖說明】
[0023] 圖1是榆黃蘑發酵米糠過程中阿魏酰低聚糖含量變化。
[0024]圖2是FOs和阿魏酸對· OH的清除能力。
[0025]圖3是FOs和阿魏酸對DPPH ·的清除能力。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合附圖，對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述，但應當理解本發明的保 護范圍并不受【具體實施方式】的限制。
[0027] 實施例1榆黃蘑發酵米糠制備阿魏酰低聚糖
[0028]母種培養基(PDA): 200g的馬鈴薯，洗凈去皮，加水1000 ml煮沸30min，紗布過濾，再 加15g葡萄糖，充分溶解后分裝三角瓶，121°C滅菌20min，取出冷卻備用。
[0029]米糠將進行烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分。
[0030] 發酵培養基:50g米糠加水1L、15g葡萄糖、15g乳糖、15g蛋白胨、lgKH2P0、IgMgSO4 · 7Η20、0·IgVBi。
[0031] 母種培養：向裝液量為50mL/250mL三角瓶中，分別接種榆黃蘑的Ig母種菌塊，在25 °C，搖床轉速100r/min條件下培養6d。
[0032] 向裝液量為60mL/250mL三角瓶中，種接種量11%(或40-100億〇如/1培養基），在25 °C，搖床轉速100r/min下培養6d。
[0033] 酶液制備:在米糠發酵的第2、4、6、8、10天時取出發酵液，在高速冷凍離心機中，0-4°C下，10000r/min條件下離心15min，上清液即為粗酶液。
[0034]榆黃蘑發酵產生酶的酶活測定：
[0035] (1)淀粉酶活性測定：參照GB/T 5521 - 2008測定方法。酶活定義：以ImL酶液在 lmin、50°C水解可溶性淀粉產生Imol葡萄糖定義為一個酶活單位，U/mL。^蛋白酶活性測 定:參照GB/T 23527-2009測定方法。酶活定義：Iml酶液在40°C、中性條件下，Imin水解酪 素產生Iyg酪氨酸為1各酶活力單位，
[0036] (3)纖維素酶活性測定:采用DNS比色法測定纖維素酶活性。酶活定義：ImL酶液在 1111；[11、50<€水解濾紙產生11]1〇1葡萄糖定義為一個酶活單位，1]/1]1匕
[0037] (4)木聚糖酶活性測定：參考GB/T 23874-2009測定方法。酶活定義：37°C下， pH5.5, lmin、從濃度為5mg/mL木聚糖溶液中生成Ιμπιο?的還原糖所需的酶量為一個酶活單 位，U/mL〇
[0038] 9.淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的活性都是發酵到第6天時酶活力達到最大，木聚糖 酶隨著發酵時間的延長活性逐漸增強，發酵到第8天時活性最高。
[0039]表1榆黃蘑發酵米糠過程中的酶活性變化
[0042] 在米糠處理液中發酵時，榆黃蘑發酵可產生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和木聚糖 酶，FOs產量發酵時間延長提高，當發酵到第8天產量最高，之后開始減少，如圖1所示。
[0043] 阿魏酰低聚糖高效清除羥自由基和DPPH自由試驗
[0044] 輕自由基清除方法測定:采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系(8.8mmol/ L H2O2 CL5mL，9mmol/L Fe2+0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5mL)中加入一系列不同濃 度的阿魏酰低聚糖溶液2mL，并以蒸餾水作為對照，與試劑空白液比較，在510nm處測定吸光 - J： 度，按下面計算清除率，阿魏酸用作參考物質。.(% ；) =^rxiw式中：a〇是空 白對照液的吸光度;A是加入樣品液的吸光度。
[0045] DPPH自由基清除方法測定：將阿魏酸低聚糖樣品配成不同濃度的溶液備用，同時 用95%的乙醇配制2X 10-4mol/L的DPPH ·溶液，避光保存備用。分別取2mL不同濃度的試樣 于試管中，加入2mL所配制的DPPH ·溶液，混合均勾，30min后倒入比色皿中在517nm處測定 其吸光度值A2,同時測2mL樣品液+2mL乙醇的吸光度值&，以及2mL DPPH ·溶液2mL水的吸光 度值A。，阿魏酸作參考物質DPPH·清除率（％ ) Α)χ?00〇 Ao
[0046] 在較高濃度（彡4mg/mL)時，FOs對· OH和DPPH ·的具有高效的清除能力，當濃度達 到10mg/mL時，FOs對· OH和DPPH ·的清除率達到98.47%和98.30(如圖2和3所示KFOs具有 明顯的自由基清除能力，是一種很有潛力的天然抗氧化劑，用作保健食品將會有著良好的 應用前景。
[0047] 實施例2榆黃蘑發酵固體米糠制備阿魏酰低聚糖
[0048] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，
[0049] (1)米糠經烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分后，制成固體培養基；
[0050] (2)接種榆黃蘑發酵進行固體發酵90-120天，制得阿魏酰低聚糖;所述食用菌的接 種量為80-180億cfu/Kg培養基。
[0051 ]實施例3榆黃蘑發酵米糠制備阿魏酰低聚糖
[0052] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步驟進行：
[0053] (1)制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分，加入水中 攪拌，制成固含量65g/L的米糠液；
[0054] (2)配置培養基：向IL米糠液中添加15g葡萄糖，Sg納米青金石粉末，15g乳糖和15g 蛋白腺；
[0055] (3)發酵制備:利用步驟(2)制備的培養基接種榆黃蘑進行液態發酵，控制起始發 酵pH4，發酵溫度25°C，搖床轉速lOOr/min，發酵8天，制得阿魏酰低聚糖;所述榆黃蘑的接種 量為60億cfu/L培養基。
[0056] 本實施例由于加入了納米青金石粉末，與實施例1相比，效果更好，產率提高5%。
[0057] 實施例4榆黃蘑發酵米糠制備阿魏酰低聚糖
[0058] 一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步驟進行：
[0059] (1)制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分，加入水中 攪拌，制成固含量65g/L的米糠液；
[0060] (2)配置培養基：向IL米糠液中添加15g葡萄糖，8g馬唐干粉末，15g乳糖和15g蛋白 胨;所述馬唐干粉末為新鮮馬唐葉片烘干，磨成粉末，過80目篩制成；
[0061] (3)發酵制備:利用步驟(2)制備的培養基接種榆黃蘑進行液態發酵，控制起始發 酵pH4，發酵溫度25°C，搖床轉速lOOr/min，發酵8天，制得阿魏酰低聚糖;所述榆黃蘑的接種 量為60億cfu/L培養基。
[0062] 本實施例由于加入了馬唐干粉末，與實施例1相比，效果更好，產率提高6%。
[0063] 對比例1松乳菇發酵米糠制備阿魏酰低聚糖
[0064] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步驟進行：
[0065] (1)制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分，加入水中 攪拌，制成固含量65g/L的米糠液；
[0066] (2)配置培養基：向IL米糠液中添加15g葡萄糖，15g乳糖和15g蛋白胨；
[0067] (3)發酵制備:利用步驟(2)制備的培養基接種松乳菇進行液態發酵，控制起始發 酵PH4，發酵溫度25°C，搖床轉速lOOr/min，發酵8天，制得阿魏酰低聚糖;所述松乳菇的接種 量為60億cfu/L培養基。
[0068]本實施例與實施例1相比，效果差，產率降低85%。
[0069] 對比例2松乳菇發酵米糠制備阿魏酰低聚糖
[0070] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步驟進行：
[0071 ] (1)制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分，加入水中 攪拌，制成固含量65g/L的米糠液；
[0072] (2)配置培養基：向IL米糠液中添加15g葡萄糖，15g乳糖和15g蛋白胨；
[0073] (3)發酵制備:利用步驟(2)制備的培養基接種堇紫珊瑚菌進行液態發酵，控制起 始發酵PH4，發酵溫度25 °C，搖床轉速lOOr/min，發酵8天，制得阿魏酰低聚糖;所述堇紫珊瑚 菌的接種量為60億cfu/L培養基。
[0074]本實施例與實施例1相比，效果差，產率降低85%。
[0075] 對比例3松乳菇發酵米糠制備阿魏酰低聚糖
[0076] -種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步驟進行：
[0077] (1)制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過80目篩子篩分，加入水中 攪拌，制成固含量65g/L的米糠液；
[0078] (2)配置培養基：向IL米糠液中添加15g葡萄糖，15g乳糖和15g蛋白胨；
[0079] (3)發酵制備:利用步驟(2)制備的培養基接種馬勃進行液態發酵，控制起始發酵 PH4,發酵溫度25°C，搖床轉速lOOr/min，發酵8天，制得阿魏酰低聚糖;所述馬勃的接種量為 60億cfu/L培養基。
[0080] 本實施例與實施例1相比，效果差，產率降低87 %。
[0081 ]發明人做了大量實驗，發現只有榆黃蘑發酵效果好，其他真菌發酵效果很差，不能 形成生產能力。
[0082]以上公開的僅為本發明的具體實施例，但是，本發明并非局限于此，任何本領域的 技術人員能思之的變化都應落入本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，按照如下步驟進行： (1) 制備米糠液:將米糠進行烘干或自然風干后，粉碎過70-100目篩子篩分，加入水中 攪拌，制成固含量25-75g/L的米糠液； (2) 配置培養基：向1L米糠液中添加10-20g葡萄糖，10-20g乳糖和10-20g蛋白胨； (3) 發酵制備：利用步驟（2)制備的培養基接種食用菌進行液態發酵，控制起始發酵 pH3.8-4.3，發酵溫度23-28 °C，搖床轉速80-120r/min，發酵6-10天，制得阿魏酰低聚糖。2. 根據權利要求1所述的米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌 為榆黃蘑。3. 根據權利要求1所述的米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌 的接種量為40-100億cfu/L培養基。4. 一種米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，按照如下步驟進行： (1) 米糠經烘干或自然風干后，粉碎過70-90目篩子篩分后，制成固體培養基； (2) 接種食用菌發酵進行固體發酵90-120天，制得阿魏酰低聚糖。5. 根據權利要求4所述的米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌 為榆黃蘑。6. 根據權利要求4所述的米糠發酵制備阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌 的接種量為80-180億cfu/Kg培養基。
【文檔編號】C12P19/14GK106086113SQ201610532698
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】遲燕平, 李敏, 胡楠楠, 王景會, 姜媛媛, 代永剛, 劉香英
【申請人】吉林省農業科學院