一種利用苯乙烯?異戊二烯?苯乙烯嵌段共聚物（sis）固定化微生物細胞的方法及應用
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種利用苯乙烯?異戊二烯?苯乙烯嵌段共聚物（SIS）固定化微生物細胞的方法及應用。本發明以SIS為原料，通過環氧化反應制備改性SIS材料，以改性SIS為載體采用包埋法制備固定化細胞，并利用固定化細胞轉化精氨酸為L?鳥氨酸。本發明工藝簡單，固定化細胞壽命長，采用本發明生產L?鳥氨酸，轉化液中L?鳥氨酸的含量為20?60g/l，精氨酸摩爾轉化率可達到98.5%。
【專利說明】
一種利用苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物細胞的方法及應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物細胞的方法及應用。
【背景技術】
[0002]在苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段聚合物(SIS)是一種熱塑性彈性體，可以作為親膚性經皮給藥機制，具有高彈性、高強度、無毒害的特點。又因其不易被微生物分解，用于固定化細胞，可以延長固定化細胞壽命。
[0003]L-鳥氨酸主要用于制備保肝、護肝、治療肝病、抗疲勞、抗虛弱等各種復方氨基酸輸液，并因其多功能的保健作用而引起世人的特別關注。目前各國市場上L-鳥氨酸的絕大部分市場份額被日本占據，其主要的生產廠家為味之素、田道制藥和協和發酵等3家。國內有少數幾家生產，且均采用化學法制備，生產規模均有待擴大，L-鳥氨酸的發酵法和酶法生產目前在國內尚處于實驗室研究階段，離工業化還有很長的路要走。鑒于L-鳥氨酸在國內外市場的供需狀況及發展民族氨基酸產業的需要，微生物酶轉化法生產鳥氨酸研究具有重大的經濟意義和理論。
[0004]現有制備L-鳥氨酸的方法，主要有提取法，化學法，微生物發酵法和酶法。酶法是利用動植物或微生物體內的精氨酸酶作催化劑，水解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素。酶法生產L-鳥氨酸專一性強，反應條件溫和，避免采用氰化氫等有毒化學品，同時底物轉化率高，產品較純，有利于后續分離，焦慶才等通過固定化L-精氨酸酶生產L-鳥氨酸，轉化率可以達到95%。張鵬等利用糞腸球菌體內的精氨酸酶轉化生產L-鳥氨酸，最高產量達112 g/Ι，轉化率達99.5%。專利CN 101691555 B中利用海藻酸鈉固定化蘇云金芽孢桿菌生產L-鳥氨酸，轉化率達99.5%。以上方法雖然精氨酸轉化率較高，但是得到的固定化細胞機械強度還有待提尚O
[0005]本發明以SIS為原料，通過環氧化反應制備改性SIS材料，以改性SIS為載體采用包埋法制備固定化細胞，并利用固定化細胞轉化精氨酸為L-鳥氨酸。本發明工藝簡單，固定化細胞壽命長，采用本發明生產L-鳥氨酸，轉化液中L-鳥氨酸的含量為20-60g/l，精氨酸摩爾轉化率可達到98.51%。
[0006]與公知技術相比，本發明具有以下優點:
(I)與其他培養方法相比，本發明所使用的方法采用的材料為高分子材料，具有高彈性、高強度、無毒害的特點。又因其不易被微生物分解，用于固定化細胞，可以延長固定化細胞壽命。
[0007](2)本發明所使用的固定化細胞連續生產L-鳥氨酸的方法減少了生產步驟，降低了成本，有利于工業化生產。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種新型的固定化材料苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物固定化微生物細胞，利用具有高精氨酸酶活性的蘇云金芽孢桿菌，制備固定化細胞，并加入含有精氨酸的轉化液中，以此獲得L-鳥氨酸，實現L-鳥氨酸的連續生產，大大縮短了時間，降低了成本。
[0009]本發明方法包括以下幾個步驟:
1、SIS的改性:配置15wt°/c^SIS甲苯溶液，室溫攪拌20min，制備均勻反應溶液。在40 °C下加入1ml甲酸，攪拌0.5h。再緩慢加入1ml雙氧水，反應結束后洗滌至中性，旋蒸除去甲苯。
[0010]2、發酵獲得菌體:取原始菌株制備菌懸液，加入種子培養基中培養。種子液按2%接種量接種至發酵罐中，發酵罐中培養基裝液量為有效容積的60%，培養溫度32°C，罐壓0.04MPa，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，發酵20h，離心，得菌體。
[0011 ] 3、固定化細胞制備:在500C下迅速加入一定量菌體，充分攪拌均勻，降至室溫，將細胞切成2_5mm的立方體，備用。
[0012]4、轉化:將制備的固定化細胞投入含有精氨酸濃度為40-60g/L，pH保持在10.0-10.5，28-32°(:，160-180印111的條件下轉化2411，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法即得轉化液中L-鳥氨酸含量。
[0013]
具體實施例
[0014]下面結合具體實例進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。下述實施例中的方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0015]實施例1
利用本發明中所述方法，生產L-鳥氨酸的操作工藝如下:
1、種子液培養
取原始菌種制備成菌懸液，液體培養基組成為:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm條件下培養24h備用。
[0016]2、發酵培養
將種子液按2%的接種量接種至發酵罐中，罐中培養基裝液量為有效容積I的60%，在320C，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，罐壓0.04MPa條件下發酵20h。發酵液于4000rpm下離心，得菌體。
[0017]3、固定化載體制備
配置15wt°/c^ SIS甲苯溶液，室溫下攪拌20min，在40 °C下加入I Oml甲酸，攪拌0.5h，再緩慢加入1ml雙氧水，使反應充分。反應結束后洗滌至中性，加熱旋蒸除去甲苯，將至室溫，加入無水乙醇得白色膠裝物質。
[0018]4、固定化細胞制備
將上一步獲得的固定化載體加熱至50°C，加入5g菌體，充分攪拌、冷卻后得固定化細胞，裁剪成邊長為2.5mm大小的塊狀，備用。
[0019]5、固定化細胞制備
將固定化細胞投入含有精氨酸濃度為50g/L，pH保持在10.2的轉化液中，在30 °C，170r/min的條件下轉化24h，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法測得轉化液中精氨酸摩爾轉化率為98.5%。
[0020]
實施例2
利用本發明中所述方法，生產L-鳥氨酸的操作工藝如下:
1、種子液培養
取原始菌種制備成菌懸液，液體培養基組成為:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm條件下培養24h備用。
[0021]2、發酵培養
將種子液按2%的接種量接種至發酵罐中，罐中培養基裝液量為有效容積I的60%，在320C，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，罐壓0.04MPa條件下發酵20h。發酵液于4000rpm下離心，得菌體。
[0022]3、固定化載體制備
配置20wt°/c^ SIS甲苯溶液，室溫下攪拌20min，在40 °C下加入I Oml甲酸，攪拌0.5h，再緩慢加入1ml雙氧水，使反應充分。反應結束后洗滌至中性，加熱旋蒸除去甲苯，將至室溫，加入無水乙醇得白色膠裝物質。
[0023]4、固定化細胞制備
將上一步獲得的固定化載體加熱至500C，加入1g菌體，充分攪拌、冷卻后得固定化細胞，裁剪成邊長為3mm大小的塊狀，備用。
[0024]5、固定化細胞制備
將固定化細胞投入含有精氨酸濃度為50g/L，pH保持在10.2的轉化液中，在30 °C，170r/min的條件下轉化24h，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法測得轉化液中精氨酸摩爾轉化率為96.32%。
[0025]
實施例3
利用本發明中所述方法，生產L-鳥氨酸的操作工藝如下:
1、種子液培養
取原始菌種制備成菌懸液，液體培養基組成為:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO41.5g/L,MgS04-7H20 0.5g/L,KH2PO4 0.5g/L，35°C，170rpm條件下培養24h備用。
[0026]2、發酵培養
將種子液按2%的接種量接種至發酵罐中，罐中培養基裝液量為有效容積I的60%，在320C，攪拌速率300r/min，通氣比1.5vvm，罐壓0.04MPa條件下發酵20h。發酵液于4000rpm下離心，得菌體。
[0027]3、固定化載體制備
配置15wt°/c^ SIS甲苯溶液，室溫下攪拌20min，在40 °C下加入15ml甲酸，攪拌0.5h，再緩慢加入15ml雙氧水，使反應充分。反應結束后洗滌至中性，加熱旋蒸除去甲苯，將至室溫，加入無水乙醇得白色膠裝物質。
[0028]4、固定化細胞制備
將上一步獲得的固定化載體加熱至500C，加入1g菌體，充分攪拌、冷卻后得固定化細胞，裁剪成邊長為4mm大小的塊狀，備用。
[0029]5、轉化
將固定化細胞投入含有精氨酸濃度為50g/L，pH保持在10.2的轉化液中，在30 °C，170r/min的條件下轉化24h，離心后取上清液，使用茚三酮顯色法測得轉化液中精氨酸摩爾轉化率為95.63%。
【主權項】
1.本發明提供了一種利用苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)固定化微生物細胞的方法及應用，其特征在于，包括: (1)將SIS環氧化得到改性的SI S材料； (2)將菌種制備成菌懸液，接入至液體培養基中培養，得種子液;接入發酵罐中，進行發酵培養，發酵結束離心得到菌體； (3 )菌體與改性的SI S共混、冷卻、成型，得到固定化細胞； (4)利用固定化細胞轉化精氨酸為L-鳥氨酸。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，固定化載體為苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物(SIS)環氧化改性材料。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，改性SIS與菌體共混比例為1-10:1，冷卻后切割成邊長為2-5mm的立方體。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，固定化細胞為蘇云金芽孢桿菌，轉化條件為精氨酸含量40-60g/L，pH10.0-10.5，28-32 °C，160_180rpm，24h ；最終得轉化率達98.5%。
【文檔編號】C12N11/08GK106086100SQ201610558826
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月17日
【發明人】張鵬, 劉玉龍, 陳毅明, 侯玉慶, 劉彥宏
【申請人】北京化工大學