一種在有機相中酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種在有機相中酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法，屬于食品、生物和化工技術領域。本發明方法以丙酸和香葉醇為原料，脂肪酶為催化劑合成丙酸香葉酯；所述方法，是先使原料在酶的催化下間歇反應，當間歇反應達到穩定后，使原料以一定的流量進入反應器進行連續反應。本發明方法連續反應時間達到初始啟動時間的3倍以上，其酯化率依然能達到60％以上，而且在反應的過程中不需要添加脫水劑。
【專利說明】
一種在有機相中酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種在有機相中酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法，屬于食品、生物 和化工技術領域。
【背景技術】
[0002] 香葉醇是一種非環單萜醇類化合物，短鏈脂肪酸的萜烯酯在食品、化妝品以及醫 藥產業中作為香料和風味化合物有著重要作用，在這些酯中，乙酸、丙酸、丁酸的無環萜烯 醇酯（香葉醇酯、香茅醇酯）最重要。萜烯醇短鏈脂肪酸酯類是重要的香料成分，已廣泛用于 飲食、化妝品領域。丙酸香葉酯具有新鮮而又甜潤的果香和玫瑰香氣，主要用作薰衣草、香 葉天蘭葵、玫瑰、梔子等香精的調和香料。
[0003] 風味酯的合成通常是通過化學合成、從天然物質中提取以及發酵合成的方式獲 得。化學合成方法通常需要高溫或者高壓，不利于一些不穩定底物進行酯化反應，且若這些 酯化產物作為食品添加劑，通常會有殘留的化學雜質，獲得理想產物的產率較低。生物發酵 合成法的弱點在于發酵產物中酯的濃度和產量都很低。脂肪酶作為一種多用性生物催化 劑，可用于一系列反應中，比如酯化反應，酰胺化作用以及水解反應等，它們在有機溶劑或 者高溫等不利條件也具有較好的穩定性。
[0004] 目前市售的產品基本上是化學合成的，反應是在高溫、高壓下進行，而且產物為復 雜的混合物，要得到高純度的產品需進行繁雜的分離工作，產品往往具有較深的色澤。利用 脂肪酶作為工業催化劑在有機溶劑中合成酯類物質其反應條件溫和，專一性強產率較高， 生產條件安全。另一方面，從生物技術方面看，相比于水相介質，在有機溶劑中水解酶(脂肪 酶、酯酶、蛋白酶)可以有效進行合成反應，使該反應的平衡位置向高產率的合成產物方向 移動，具有很多潛在優勢。
[0005] 近年來，國內外一些研究者對短鏈無環萜烯醇酯的酶法合成工藝研究逐漸增多。 Paroul等人于2010年報道了用脂肪酶催化合成丙酸香葉酯，Nicoletti等人于2014年報道 了將脂肪酶固定化并用于合成丙酸香葉酯的研究，Mohamad等人于2015年嘗試將脂肪酶固 定化于碳納米管上后合成丙酸香葉酯，這些研究均取得良好的效果，但均以間歇方式進行。 到目前為止，尚未有在有機相中利用酶法催化連續合成丙酸香葉酯的報道，
[0006] 連續合成與間歇合成相比具有明顯的優勢。首先，連續合成的生產效率大大高于 間歇合成;其次，間歇合成時需添加脫水劑以維持酶的微水環境;最后，用固定化酶連續合 成還省去了將酶與反應物分離的操作。因此，連續合成適用于大規模工業化生產。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述問題，本發明設計了一種適合脂肪酶催化連續合成的反應器，并提 供了一種連續合成風味化合物丙酸香葉酯的方法。本發明的方法反應條件溫和、反應效率 高，可以實現工業規模生產，優于化學法和間歇生產。
[0008] 本發明的第一個目的是提供一種酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法，所述方法是 以丙酸和香葉醇為原料，脂肪酶為催化劑合成丙酸香葉酯;所述方法，是先使原料在酶的催 化下間歇反應，當間歇反應達到穩定后，使原料以一定的流量進入反應器進行連續反應。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述原料中，香葉醇濃度為10-40mmol/L，香葉醇與 丙酸摩爾比為1:1-4:1。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，香葉醇濃度為20-40mmol/L，香葉醇與丙酸摩爾比為 1:卜2:1〇
[0011] 在本發明的一種實施方式中，所述催化劑的添加量為4-12U/mL。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述反應的溫度30°C-50°C，或者30°C-40°C。
[0013]在本發明的一種實施方式中，所述間歇反應的反應時間為4. Oh以上，可以是4.5h 或者4.5h以上。
[0014]在本發明的一種實施方式中，所述間歇反應的時間為4_6h。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述連續反應的時間達到初始啟動時間（以間歇模 式從開始反應到達到穩定酯化率的時間）的3倍以上。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述流量應使物料在反應器內的平均停留時間為4-6h〇
[0017] 在本發明的一種實施方式中，所述反應是以有機溶劑為反應介質。
[0018] 在本發明的一種實施方式中，所述有機溶劑為異辛烷。
[0019] 在本發明的一種實施方式中，所述酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法，具體是:香 葉醇的濃度為10-40mmol/L，香葉醇與丙酸摩爾比為1:1-4:1，加酶量為4-12U/mL，反應溫度 30°C-50°C，間歇反應4-6h后原料以一定流量進入反應器進行連續反應，使物料在反應器內 的平均停留時間為4-6h。
[0020] 在本發明的一種實施方式中，所述酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法，具體是:反 應器體積為25mL，香葉醇的濃度為30mmol/L，丙酸濃度為20mmol/L，加酶量為9U/mL，反應溫 度35°C，間歇反應4.5h后原料以0.10mL/min流量進入反應器進行連續反應。
[0021] 在本發明的一種實施方式中，所述脂肪酶為固定化酶，固定化酶裝載在袋狀容器 中，反應底物和溶劑可以進出袋狀容器與酶充分反應，而固定化酶不會從袋狀容器中流出。 這樣的方法方便酶與反應液的分離，而且固定化酶可以重復使用。當然，酶也可以不裝載在 袋狀容器中或者采用游離酶，可以采用離心或者其他方式將酶與反應液進行分離。
[0022] 在本發明的一種實施方式中，所述反應是在連續攪拌式酶反應器中進行。
[0023] 本發明的第二個目的是提供一種連續攪拌式酶反應器，所述反應器包括原料液容 器、控溫反應室、快速混合裝置、產物容器;控溫反應室頂部留有孔，通過進料管道和出料管 道分別與原料液容器、產物容器連接;所述控溫反應室內部裝載催化劑。
[0024] 在本發明的一種實施方式中，所述控溫反應室內含有催化劑固載裝置，催化劑裝 載于催化劑固載裝置中。
[0025] 在本發明的一種實施方式中，所述催化劑固載裝置為濾布袋，反應液可以透過濾 布袋與催化劑充分接觸、反應，而催化劑被限制于濾布袋中，以實現反應物與催化劑的分 離。
[0026]在本發明的一種實施方式中，所述控溫反應室的容積為25mL。
[0027]在本發明的一種實施方式中，所述快速混合裝置為磁力攪拌器，控制控溫反應室 內的反應液混合。
[0028] 在本發明的一種實施方式中，所述進料管道上含有進料栗。
[0029] 在本發明的一種實施方式中，所述出料管道上還連接有在線檢測器，以監測反應 物的濃度。
[0030] 在本發明的一種實施方式中，所述出料管道與在線檢測器連接的管道上設置有止 水夾。
[0031] 本發明的有益效果：
[0032] (1)本發明采用連續攪拌式酶反應器裝置連續合成丙酸香葉酯的方法可以大大提 高產物的產量和反應的效率，而且在反應的過程中不需要添加脫水劑。采用本發明的方法， 連續反應時間達到初始啟動時間的3倍以上，其酯化率依然能達到60 %以上。
[0033] (2)本發明方法具有反應條件溫和、反應效率高等優點。在生產的工程中，由于反 應體系以有機溶劑為反應介質，生產過程中基本沒有微生物的影響，且采用的溶劑為異辛 燒，可在食品工業中運用。
【附圖說明】
[0034] 圖1為連續攪拌式酶反應器裝置。圖中A:原料液容器，B產物容器，C:快速混合裝 置，D:控溫反應室，E:進料栗，F:催化劑，G:止水夾，H:在線檢測器。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0036]本發明所用的材料、試劑、儀器和方法，如為特殊說明，均為本領域常規材料、試 劑、儀器和方法，均可通過商業渠道和現有方法獲得。
[0037] (1)固定化脂肪酶活力的測定
[0038]以正庚烷為溶劑，分別取1.2mol/L的辛酸和乙醇溶液各0.5mL于5mL離心管中，混 合均勻后加入0.1 Og固定化酶，在35°C水浴搖床中反應30min，振蕩速率200r/min，反應結束 后從上清液中取IOOyU反應液中加入IOOyL己醇為內標，用氣相色譜檢測生成的辛酸乙酯。 [0039]脂肪酶活單位定義:在35°C下，Imin內生成Ιμπιο?辛酸乙酯的酶量定義為一個酶活 單位(U)。
[0040] (2)丙酸香葉酯的分析檢測
[00411 每隔一段時間收集一定量的流出液，8000r/min離心5min。取IOOyL收集液和相同 體積的正己醇作為內標。
[0042] 產物酯采用的氣相色譜條件為：島津GC-2014色譜儀，色譜柱為DB-Wax(30mX 0.25mm)，載氣為N2,程序升溫條件為100°C保留lmin，10°C/min升溫至220°C保留lOmin。柱 流量1.15mL/min，分流比30:1，檢測器溫度260°C。進樣體積lyL。
[0043] (3)酯化率的測定：
[0044] 酯化率（％ )=測得的丙酸香葉酯含量/完全酯化的丙酸香葉酯含量X 100%
[0045] 實施例1:連續攪拌式酶反應器
[0046] 本發明的連續攪拌式酶反應器，如圖1所示。其主體由原料液容器(A)、產物容器 (B)、快速混合裝置(C)、控溫反應室(D)，進料栗(E)，催化劑固載裝置(F)，止水夾(G)，在線 檢測器(H)組成，其中控溫反應室(D)頂部留有進、出管道鏈接原料液容器(A)和產物容器 (B)，內部可裝載催化劑，以實現反應物與催化劑的分離。
[0047] 可選地，所述催化劑固載裝置為濾布袋，反應液可以透過濾布袋與催化劑充分接 觸、反應，而催化劑被限制于濾布袋中，以實現反應物與催化劑的分離。
[0048] 控溫反應室，外部有恒溫水浴控制反應體系水溫。原料液通過進料栗進入控溫反 應室中。反應體系可充滿整個控溫反應室，這樣從進料管道進入的原料液體積與出料管道 流出的反應液體積相等。也可以在出料管道上設置出料栗，并控制出料速度與進料速度一 致。
[0049] 實施例2:連續生產工藝流程優化
[0050] 利用連續攪拌式酶反應器，以丙酸和香葉醇為原料，脂肪酶為催化劑合成丙酸香 葉酯。
[0051] 脂肪酶催化合成丙酸香葉酯的連續合成方法，本發明研究了底物摩爾比、脂肪酶 添加量、溫度、流量對酯化率的影響。
[0052]連續攪拌式酶反應器的設計（圖1):控溫反應器的容積為25mL，將脂肪酶置于其 中，通過磁力攪拌器不斷攪拌反應液，外部有恒溫水浴控制反應體系水溫，丙酸香葉醇反應 體系通過恒流栗進入反應器中，同時收集反應流出液。
[0053] (1)香葉醇濃度的確定:在該反應中，丙酸的反應濃度為20mmol/L，考察了香葉醇 濃度分別為20，30，40，50，60，70，80mmol/L時對酯化率的影響。結果發現當隨著香葉醇濃度 增大，酯化率也相應增大，但繼續增大香葉醇濃度時，反而使得酯化率下降，當反應體系中 香葉醇濃度為30mmol/L時有最大酯化率，達到70%。
[0054] (2)脂肪酶添加量的確定:該脂肪酶為固定化脂肪酶，當酶的添加量增加時，酯化 率提尚；而當添加量大于9U/mL時，酯化率不再明顯提尚，綜合考慮酶的價錢和催化效率考 慮，脂肪酶添加量可選用9U/mL。
[0055] (3)平均停留時間的確定:若平均停留時間太短，原料尚未充分反應，酯化率低，延 長平均停留時間會使原料反應更加充分，產物酯化率逐漸增大，當平均停留時間達到某一 值時，酯化率不再增高。實驗結果表明當平均停留時間低于4h時，反應液中的丙酸香葉酯酯 化率下降，因而平均停留時間確定為4h，此時酯化率可達到70 %酯化率。
[0056] 優化后的丙酸香葉酯的連續合成方法：反應器體積為25mL，香葉醇的濃度為 30mmol/L，丙酸濃度為20mmol/L，加酶量為9U/mL，反應溫度35°C，間歇反應4.5h后，原料以 0.10mL/min流量進入反應器，丙酸香葉酯的酯化率能連續12h維持在70%以上。
[0057] 實施例3
[0058] 反應體系的體積為25mL，原料液中丙酸濃度20mmol/L，香葉醇濃度20mmol/L，溶劑 為異辛烷，脂肪酶9U/mL，反應溫度35°C，間歇反應4.5h后，原料以0. lOmL/min的流量進入反 應器中，連續反應12h。丙酸香葉酯的酯化率見表1。
[0059]表1不同連續反應時間下丙酸香葉酯的酯化率
[0061 ] 實施例4
[0062] 反應體系的體積為25mL，原料液中丙酸濃度20mmol/L，香葉醇濃度30mmol/L，溶劑 為異辛烷，脂肪酶9U/mL，反應溫度35°C，間歇反應4.5h后，原料以0. lOmL/min的流量進入反 應器中，連續反應12h。丙酸香葉酯的酯化率見表2。
[0063] 表2不同連續反應時間下丙酸香葉酯的酯化率
[0065] 實施例5
[0066] 反應體系的體積為25mL，原料液中丙酸濃度20mmol/L，香葉醇濃度30mmol/L，溶劑 為異辛烷，脂肪酶6U/mL，反應溫度35°C，間歇反應4.5h后，原料以O. lOmL/min的流量進入反 應器中，連續反應12h。丙酸香葉酯的酯化率見表3。
[0067]表3不同連續反應時間下丙酸香葉酯的酯化率
[0069] 實施例6
[0070] 反應體系的體積為25mL，原料液中丙酸濃度20mmol/L，香葉醇濃度40mmol/L，溶劑 為異辛烷，脂肪酶9U/mL，間歇反應4.5h后，反應溫度40°C，原料以O. lOmL/min的流量進入反 應器中，連續反應12h。丙酸香葉酯的酯化率見表4。
[0071 ]表4不同連續反應時間下丙酸香葉酯的酯化率
[0073]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種酶催化連續合成丙酸香葉酯的方法，其特征在于，所述方法是以丙酸和香葉醇 為原料，脂肪酶為催化劑合成丙酸香葉酯;所述方法，是先使原料在酶的催化下間歇反應， 當間歇反應達到穩定后，使原料以一定的流量進入反應器進行連續反應。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料中香葉醇濃度為10_40mmol/L，香 葉醇與丙酸摩爾比為1:1-4:1。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化劑的添加量為4-12U/mL。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應的溫度30°C-50°C。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述流量應保證物料在反應器內的平均停 留時間為4_6h。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述間歇反應的時間為4h以上。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：香葉醇的濃度為10-40mmol/L，香葉醇與丙酸摩爾比為1:1-4:1，加酶量為4-12U/mL，反應溫度30°C_50°C，間歇 反應4-6h后原料以一定流量進入反應器進行連續反應，使物料在反應器內的平均停留時間 達到4-6h;所述方法的酯化率達到60%以上，且酶能夠連續20小時以上維持活力。8. 根據權利要求1-7任一所述方法得到的丙酸香葉酯。9. 一種連續攪拌式酶反應器，其特征在于，所述反應器包括原料液容器、控溫反應室、 快速混合裝置、產物容器;控溫反應室頂部留有孔，通過進料管道和出料管道分別與原料液 容器、產物容器連接;所述控溫反應室內部裝載催化劑。10. 根據權利要求9所述的反應器，其特征在于，所述控溫反應室內含有催化劑固載裝 置，催化劑裝載于催化劑固載裝置中。
【文檔編號】C12M1/40GK106086094SQ201610428116
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發明人】馮骉, 唐靜, 繆銘, 王璐
【申請人】江南大學