用于car?t制備的慢病毒載體及其構建方法和應用
【專利摘要】本發明公開了用于CAR?T制備的慢病毒載體及其構建方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明還建立了熒光定量PCR檢測病毒滴度的方法，為臨床應用提供了檢測標準。本發明提供的慢病毒載體具有長度小，能夠高效表達CAR基因，包裝出足夠滴度的慢病毒、而且不表達GFP等與治療無關的標志基因等優點，經實驗驗證，該慢病毒載體適用于CAR?T研究和臨床應用。
【專利說明】
用于CAR-T制備的慢病毒載體及其構建方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及慢病毒載體及其制備和應用。
【背景技術】
[0002] 免疫細胞治療技術是近幾年出現的最新的治療腫瘤的技術，和現有的手術、放療、 化療、靶向治療相比，具有自身不可替代的優勢和發展潛力，因此，被稱為腫瘤治療的第五 大技術。免疫細胞治療主要包括傳統的CIK(Cytokine Induced Killer cells，CIK)、DC-CIK(Dendritic Cells，DC)和最新的CAR-T技術。CAR-T技術，全稱為嵌合抗原受體T細胞技 術(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR_T)，CAR主要結構包括細胞外結合腫瘤相關 抗原(Tumor Associated Antigen，TAA)的單鏈抗體結構域和細胞胞衆內活化T細胞的0)28 協同刺激信號和CD3G信號，該組合的基因工程設計的序列，克隆入慢病毒載體，包裝為慢病 毒，感染腫瘤患者的T細胞，就制備成功CAR-T，CAR-T回輸腫瘤患者后，T細胞表面的單鏈抗 體識別腫瘤細胞TAA，進而活化T細胞，活化的T細胞殺死識別的腫瘤細胞。CAR-T技術從2011 年取得突破性進展以來，在白血病和淋巴瘤的大量臨床試驗中，對白血病取得了93%的緩 解率，對淋巴瘤取得了47%的緩解率，對于肺癌、肝癌、胃癌等實體腫瘤，正在進行不同設 計、不同臨床實施方法的臨床試驗，逐漸將會報道振奮人心的結果。
[0003] 在CAR-T技術的實施中，最為關鍵的是慢病毒載體的構建，盡管慢病毒載體的研究 有了很大進展，但距離臨床應用還有很長的路要走。例如，重組病毒的滴度還不夠高，除 Naldini等報道的結果外，其余均在IO1TUAiI~103TU/ml之間，難以達到體內應用的需要。造 成重組病毒滴度低的主要原因之一是慢病毒載體偏大，較大的載體會直接影響到病毒的滴 度和T細胞的感染效率。為此，設計、構建、使用合適大小的高效表達的慢病毒載體是CAR-T 應用中的關鍵環節，已成為制約CAR-T技術研究和應用的主要瓶頸之一。
【發明內容】
[0004] 本發明公開了一種用于CAR-T制備的慢病毒載體及其構建方法和在制備抗腫瘤藥 物中的應用。該發明還建立了熒光定量PCR檢測病毒滴度的方法，為臨床應用提供了檢測標 準。
[0005] 本發明提供了一種用于嵌合抗原受體T細胞（CAR-T)制備的慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS，其核苷酸序列如SEQ IDl所示。
[0006] 本發明還公開了慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS的制備方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟1:基因合成EFl-MCS序列，兩端設置ClaI和MluI限制性內切酶位點，所述EFl-MCS序列如SEQ ID 2所示；
[0008] 步驟2:用限制性內切酶Cla I和MluI雙酶切pLVX-IRES-Puro載體和所述EFl-MCS 序列，分別回收酶切后目的產物；
[0009] 其中，所述EFl-MCS序列可以是直接基因合成得到，也可以是先將基因合成得到 EFl-MCS序列連接到合適的質粒載體中，轉入大腸桿菌中體內擴增、雙酶切制備得到，還可 以是針對所述EFl-MCS序列設計PCR引物體外擴增，然后雙酶切擴增產物得到；
[0010]步驟3:連接步驟2回收獲得的酶切后目的產物獲得慢病毒表達載體。
[0011 ] 本發明還公開了慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS的使用方法，包括下述步驟：
[0012] 步驟1:將目的基因克隆入Pre-Lenti-EF卜MCS載體獲得重組慢病毒載體；
[0013] 步驟2:將步驟1獲得的重組慢病毒載體和psPAX2和pMD2. OG共同轉染宿主細胞； [0014]步驟3:培養宿主細胞，所述宿主細胞優選293或293T細胞；
[0015]步驟4:分離獲得重組慢病毒。
[0016]本發明還公開了一種的重組慢病毒載體，該重組慢病毒載體如下方法制備得到： 將針對腫瘤相關抗原(TAA)的CAR基因克隆入如Pre-Lenti-EFl-MCS的多克隆位點處。其中 所述CAR基因識別的腫瘤相關抗原（TAA)選自CD19、CD20、CD22、CD33、CD138、BCMA、CD38、 NKG2D、RORl、間皮蛋白、c-Me t、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、 EGFRvII I、GD-2或其任意組合。
[0017]本發明公開的慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS和前述克隆有CAR基因的重組慢病 毒載體適用于制備抗腫瘤藥物。
[0018] 本發明還公開了一種測定重組病毒滴度的方法，包括如下步驟：
[0019] 步驟1:慢病毒包裝，用前述克隆有針對腫瘤相關抗原(TAA)的CAR基因的重組慢病 毒載體和提供病毒膜蛋白和結構蛋白的包裝質粒psPAX2和pMD2. OG共轉染宿主細胞，收獲 重組病毒；
[0020] 步驟2:制備梯度濃度的DNA樣品：按照5-15倍比例梯度濃度稀釋步驟1制備得到的 重組病毒，制成3-10組等梯度濃度的重組病毒稀釋液，用稀釋后的等梯度濃度的重組病毒 稀釋液分別感染相同濃度的293或293T細胞并培養，收集等體積經感染和培養的293或293T 細胞分別提取DNA，制3-10組梯度濃度的DNA樣品；
[0021] 步驟3:設計熒光定量PCR引物:設計靶向CAR基因胞內段⑶3ζ基因的引物；
[0022] 步驟4:熒光定量PCR方法測定重組病毒滴度:分別取等量步驟2提取的梯度濃度的 DNA樣品和步驟3獲得的熒光定量PCR引物構建熒光定量PCR擴增體系，相同條件下進行擴 增，分析實驗結果，用絕對定量的方法測定重組病毒滴度。
[0023] 本發明提供的慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS中設計有能在T細胞高效表達的EFl 啟動子，且該載體長度小，經實驗驗證，由Pre-Lenti-EFl-MCS構建的表達嵌合抗原受體 (CAR)的重組慢病毒載體可大大提高重組病毒滴度(檢測可達2xl0 6TU/ml)，且不表達GFP等 與治療無關的標志基因，適用于CAR-T研究和臨床應用。
【附圖說明】
[0024] 圖I :Clontech公司pLVX-IRES-Puro載體圖譜
[0025] 圖2:本發明構建的Pr e -Len t i -EFI-MCS慢病毒載體圖譜
[0026] 圖3.CD19CAR基因 PCR產物電泳圖，其中，CD19CAR基因：1743bp，
[0027] Marker:1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，1000 Obp
[0028] 圖4.菌液PCR鑒定電泳圖，其中，CD19CAR基因：1743bp，
[0029] Marker:1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，1000 Obp
[0030] 圖5.熒光定量PCR恪解曲線
[0031] 圖6.熒光定量PCR擴增曲線
[0032] 圖7.CD19CAR-T 的殺傷率 具體實施例
[0033] 實施例1 · CAR-T用慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS設計和合成
[0034] 1.1使用Clontech公司的pLVX-IRES-Puro慢病毒載體作為起始載體，pLVX-IRES- Puro大小是8140bp，載體序列見SEQ ID 3,載體圖譜見附圖1。
[0035] 1 · 2合成EFl-MCS序列（中美泰和生物技術有限公司）
[0036] 使用pDRAW32軟件分析pLVX-IRES-Puro載體的序列，發現單酶切位點ClaI (序列 ATCGAT，位置2180)和單酶切位點MluI (序列ACGCGT，位置4049)能夠切下起始載體上的CMV+ MCS+IRES+Puro元件(共切下1870bp長度的序列），酶切后載體大小為6270bp。使用EFl啟動 子的序列，加上pLVX-IRES-Puro載體的多克隆位點序列，得到序列EF1-MCS，見SEQ ID 2。合 成的EFl-MCS序列，EFl啟動子553bp，MCS 38bp，兩端分別加上ClaI或MluI的序列。合成基因 全長603bp(中美泰和生物技術有限公司）。
[0037] 1.3酶切pLVX-IRES-Puro載體和含EFl-MCS基因序列的合成載體，酶切體系如下： pLVX-丨RES-Puro 載體或 EFl-MCS 載體 2,ug Cla I (NEB) 2μ1
[0038] MiuI-HF (NEEi) 2μ] Culsmart bulTcr ( NEB ) 5μ1 補水H2O至總體積 5:0μ1
[0039] 反應條件為37 °C水浴，酶切2小時。
[0040] 1.4回收酶切后產物
[00411 使用Biomiga膠回收試劑盒（貨號:DC-3511-01)
[0042]膠回收步驟(參照說明書）：
[0043] (1).瓊脂糖凝膠產物純化:從凝膠上割下帶有目的片段的凝膠塊到一個1.5mL或 者2. OmL離心管中，加入1倍體積的Buffer GC，置于55°C水浴中10分鐘左右，期間顛倒混勻 幾次，直至凝膠塊完全溶化。冷卻離心管至室溫。
[0044] (2).轉移以上混合液（每次不超過700μ1)至一個帶有收集管的吸附柱中，室溫， 13,000Xg離心1分種，棄廢液，將離心柱放回收集管中。重復步驟"2"，直至剩余的混合液全 部通過吸附柱。
[0045] (3).加入650μ1 DNA Wash Buffer至吸附柱中，室溫下13，000 X g離心30秒，倒掉 收集管中的廢液，將吸附柱放回到收集管中。重復步驟3。
[0046] (4).室溫下，13，000 X g，將吸附柱開蓋離心2分鐘，去除殘留的乙醇。
[0047] (5).轉移吸附柱至1.5mL收集管中，加入30μ160Γ預熱的Elution Buffer(10mM Tri s-HCl，pH8.5)到吸附柱膜中央，室溫放置1分鐘。13，000 X g離心1分種以洗脫DNA。如果 想提高收獲量，將洗脫液加回到吸附柱中重新洗脫一次。
[0048] 1.5連接反應
[0049]使用Takara的快速連接試劑盒(貨號:6022)
[0050]根據載體(酶切過)nmole數:片段(酶切過的目的基因片段)nmole數= 1:3，即：[載 體質量(50ng/100ng)/載體分子質量]X3 =片段質量/片段分子量;其中，載體pLVX-IRES-Puro 8140bp，基因序列EFl-MCS 603bp。
[0051 ]連接體系如下：
)
[0052]
[0053] 按上述內容定量加入各組分至1.5mL離心管中（SolutionI冰上加），充分混勾。16 °C 水浴 30min。
[0054] 1.6轉化，涂氨芐平板
[0055] 冰上加感受態50μ1，冰上孵20~30min;42°C水浴90s;冰上2~5min;加500μ1 LB復 蘇lh;4000rpm離心5min，留適量上清液50-100μ1重懸，涂板(氨節抗性）。
[0056] 1.7挑克隆，搖菌
[0057]第二天，待克隆長出后，隨機挑取幾個克隆，于3ml LB液體培養基內搖菌過夜。 [0058] 1.8質粒提取
[0059]使用Biomiga的無內毒素質粒提取試劑盒(貨號:PD1220-02)
[0060] (1).取1.7制備得到的菌液。
[0061] (2).室溫下10,000Xg離心1分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
[0062] (3).加入250μ1 Buffer Al，用移液器或渦流震蕩確保細菌沉淀重新懸浮。
[0063] (4).加入250μ1 Buffer BI,輕輕地反轉5-10次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至 溶液由粘稠變澄清。
[0064] (5).加入60μ1 Buffer N3,立即反轉5次，用手用力搖晃5次充分混勻，此時出現白 色絮狀沉淀。
[0065] (6).將離心管轉至高速離心機，在室溫下13,000rpm離心10分鐘(若上清中仍有白 色沉淀，可再次離心）。
[0066] (7).定量吸取離心后的上清液至新的1.5mL管中，加入1倍體積的Buffer RET，（如 500μ1裂解液加入到500μ1的上清液)及250μ1的100%ethonal，用手用力甩3次以混勻。 [0067] (8).將溶液700μ1轉移至帶有收集管的DNA柱中，室溫下13,000rpm離心20秒，倒掉 收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。再重復此步驟至全部溶液轉移至DNA柱 中。
[0068] (9).向DNA柱中加入500μ1 Buffer KB，室溫下13,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管 中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
[0069] (10).向離心柱中加入650μ1 DNA Wash Buffer(確保已加入無水乙醇），室溫下， 13，OOOrpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟"10"。
[0070] (11).將離心柱放回高速離心機中，13，OOOrpm室溫下開蓋離心2分鐘，以徹底去除 殘留的乙醇。
[0071] (12).將離心柱轉至一個新的1.5mL離心管中，向DNA柱的正中間加入100μlEndo-Free Elution Buffer，室溫放置1分鐘，13 ,OOOrpm離心1分鐘，洗脫質粒DNA。將離心管中的 洗脫液再次加到DNA柱的正中間，室溫放置1分鐘，13 ,OOOrpm離心1分鐘，收集洗脫液到同一 個離心管中。
[0072] 1.9測序
[0073] 測序引物如SEQ ID 4所示，測序結果和EFl-MCS合成序列Blast，測序結果完全正 確。至此，構建成功了Pre-Lenti-EFl-MCS載體。Pre-Lenti-EFl-MCS全長序列如SEQ ID 1所 示，載體圖譜見附圖2，長度為:6867bp，比pLVX-IRES-Puro慢病毒載體小1273bp。
[0074] 實施例2表達CD19CAR慢病毒載體Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19的構建
[0075] 2.1.CD19CAR 基因合成
[0076] CD19CAR基因序列如SEQ ID 5所示。
[0077] 2.2引物設計
[0078] 使用PDRAW32軟件分析CD19CAR基因序列，發現單酶切位點EcoRI (識別序列 GAATTC)、BamHI (識別序列GGATCC)適合用于基因克隆，能夠和Pre-Lenti-EFl-MCS載體的多 克隆位點匹配，設計上、下游引物如下，
[0079] EcoRI-正向引物序列如SEQ ID 6所示；
[0080] BamHI-反向引物序列如SEQ ID 7所示。
[0081] 2.3PCR擴增:收到合成的序列和引物后，進行PCR擴增，反應體系見下(使用Toyobo 的高保真KOD Fx酶）， 2XPCR buffer for KOD Fx 25μI 2m MdN TP ΙΟμΙ IOmM Primer il. |i-'J 1.5 μ I IOmM Primer ,丨乂向 1,5μ1
[0082] .、 CD 19 CAR Template ΙμL i. 50ng/uL· KOD FX ΙμL _H1O_IOul 總體積 50μ]
[0083] 反應程序為 1： 94Γ 2min 步驟 2: 98 Γ IOsec 步驟 3: 50°C 30sec Γ ? 步驟4: 68°C 2min進入步驟2 重復5個循環
[0084] 丄 # 步驟 5: 98 〇C IOsec 步驟 6: 60Γ 30scc 步驟7: 68 °C 2min進入步驟5 重復30個循環 少驟 8: 68°C IOmin
[0085] 步驟 9: 4°C Ih
[0086] PCR產物電泳見附圖3。
[0087] 2.4酶切
[0088] 酶切反應體系如下： Pre-Lcmi-EFI-MCS 載體或 CDl9 CAR 基因 PCR 產物 2f.ig EcoRI-HF (NEB) 2μΙ
[0089] BamHI-HF (NEB) 2μΙ CutsmartbulTer (NEB) 5μΙ 補H2O至總體積50μΙ
[0090] 反應條件為37 °C水浴，酶切2小時。
[0091] 2.5回收酶切后產物，使用別〇11^8&膠回收試劑盒（貨號：0(：-3511-01)，步驟同前 Pre-Lenti-EFl-MCS 載體構建。
[0092] 2.6連接反應，操作同前Pre-Lenti-EFl-MCS載體構建。
[0093] 2.7轉化，涂氨芐平板，操作同前Pre-Lenti-EFl-MCS載體構建。
[0094] 2.8挑克隆，搖菌，PCR鑒定，引物為克隆所用引物，反應條件同前2.3PCR擴增，實驗 結果見附圖4。
[0095] 2.9質粒提取，使用Biomiga的無內毒素質粒提取試劑盒（貨號:PDl220-02)，步驟 同前Pre-Lenti-EFl-MCS載體構建。
[0096] 2.9測序
[0097] 測序引物為：Pre-up-Seq如SEQ ID 8所示；Pre-down-Seq如SEQ ID 9所示；
[0098] 測序結果經和⑶19CAR基因比對，完全正確。至此，得到⑶19CAR慢病毒載體Pre- Lenti-EFl-MCS-CD19。
[0099] 實施例 3 · Pre-Lent i -EFI-MCS-CD19 慢病毒包裝
[0100] 3.1慢病毒包裝遵循常規方法，大致如下：
[0101] 3. 1 · 1細胞培養293T細胞培養于37°C，5%C02孵箱內，培養基為DMEM/High Glucose/10%FBS〇
[0102] 3.1.2種植細胞包裝病毒前一天，胰酶消化293T細胞，5 X IO6細胞/孔種植IOcm培 養皿，準備包裝Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19慢病毒。
[0103] 3.1.3細胞轉染細胞轉染時，除了使用Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19質粒外，每種質粒 還需要和包裝質粒(提供病毒膜蛋白和結構蛋白）psPAX2、pMD2. OG共轉染。其中
[0104] Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19 使用 5yg，psPAX2 使用 3.75以8印]\?2.06使用1.25以8。轉染 時，將以上三種質粒的混合物加入500μ1 MEM培養基內，在另一個微型離心管內將25μ1
[0105] Lipofectamine 2000轉染試劑加入500μ1 MEM培養基內，然后，將稀釋后的轉染試 劑加入稀釋后的質粒上方，混勻，離心，室溫靜置20分鐘;時間到后，將質粒和轉染試劑的混 合物加入IOcm培養皿內，搖晃、混勻，放入孵箱。
[0106] 3.1.4收獲病毒細胞轉染3天后，可以收獲病毒，將9ml含病毒培養基轉入50ml離心 管內，4°C，1500rpm，離心5分鐘，去除死亡的293T細胞，然后，將含病毒培養基過濾分裝，-80 °C凍存。
[0107] 實施例4.熒光定量PCR測定病毒滴度
[0108] 4.1測定前一天，種植293T細胞至24孔板，2 X IO5個細胞/孔，一種病毒準備4個孔；
[0109] 4.2第二天，感染病毒；
[0110] 首先10倍比例系列稀釋病毒，具體為首先在1.5ml離心管準備180μ1細胞培養基， 第一管內加入20μ1病毒原液，吹打混勻，移出20μ1稀釋后的病毒液至第二管，吹打混勻，依 次往后稀釋，得到的每管內的病毒液為20μ1、2μ1、0.2μ1、0.02μ1，吸掉24孔板內培養基，加 入稀釋過的病毒液;C〇2孵箱培養72h;
[0111] 4.3DNA提取(組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒，博邁德生物技術有限公司）， 參照說明書，簡要步驟如下，
[0112] 收集IO5-IO6細胞到1.5ml離心管中，13000rpm離心10秒，使細胞沉淀下來，棄去上 清，加200μ11 X PBS重懸洗滌，13000rpm離心10秒，棄上清，180μ11 X PBS重懸，加入4μ1 RNaSeA(10mg/ml)溶液，振蕩15秒，室溫靜置5min，再加入20μ1蛋白酶k( 20mg/ml)溶液充分 混勻，然后加入200μ1結合液CB，立即渦旋振蕩混勻，在70°C放置10分鐘，冷卻后加 100μΙ異 丙醇，立即渦旋振蕩混勻，將混合物加入吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm離心 60秒，倒掉收集管廢液，加入500μ1抑制物去除液IR，12000rpm離心30秒，棄廢液，再加入500 μL漂洗液WB，12000rpm離心30秒，洗2次，再將吸附柱放回空收集管，13000rpm離心2分鐘，盡 量去除漂洗液，取出吸附柱AC，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加入100μΙ洗脫緩沖 液EB(先70°C水浴中預熱），室溫放置3-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，將所得液體再加入吸附 柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收DNA。
[0113] 4.4熒光定量PCR
[0114] 4.4.1設計熒光定量PCR引物，錨定CD19CAR基因的0)3ζ鏈，產物164bp，
[0115] ⑶3ζ-正向引物如SEQ ID 10所示，⑶3ζ-反向引物序列如SEQ ID 11所示。
[0116] 4.4.2用THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix(Toyobo)進行擴增，實驗操作按產品說明書 進行，反應體系為： 滅菌蒸餾水 8μ1 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix ΙΟμΙ CD3C-正向引物 （)·5μ1 C〇117] 033ζ-反向引物 0.5μ1 DNA ! μ! 總體積 20μ!
[0118]擴增程序：95￡€6〇8〇。，（95。(：1586。，60。(：1586。，72 1€4586。）\40個循環，
[0119]熔解曲線如附圖5所示。
[0120] 擴增曲線如附圖6所示。
[0121] 4.4.3標準曲線和滴度計算：
[0122] 標準曲線樣品用Pre-Lenti-EFl-MCS質粒換算為拷貝數，根據質粒濃度和分子量 將樣品稀釋成4000拷貝數/μ1、400拷貝數/μ1、40拷貝數/μ1、4拷貝數/μ1、0拷貝數/μL，具體 如下表：
[0124] 表1標準曲線樣品Ct值和病毒拷貝數對應表
[0125]測算測定病毒的滴度方法，具體為：20μ1的ct均值為22.46,將該值代入γιο . 371 x+11. 98 得4 .01， 4X1O4·01 =41510.8, 就說明 20μ1 病毒感染的該孔中拷 貝數為 41510.8，10μ1就有20755.4個拷貝，所以該病毒滴度就是2.1 X IO6Ail.取平均值為2.25 X IOfVml，即包裝所得Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19
病毒的滴度為2.25 X 106pfu/ml。
[0127] 表2標準曲線樣品Ct值、病毒拷貝數和病毒滴度對應表
[0128] 實施例5.⑶19CAR-T制備和殺傷實驗
[0129] 5 .IPBMCs 分離
[0130] (1)抽血:在無菌的條件下抽取人體的靜脈血。
[0131] (2)稀釋:將獲得的血液用相同體積的1640培養基(RPMI Medium Modified)稀釋。
[0132] (3)在離心管中加入血液稀釋完后的體積的二分之一的"人淋巴細胞分離液" (Human Lymphocyte Separation Medium，達科為生物工程有限公司）。
[0133] (4)用移液槍將血液貼壁緩慢的加入到離心管中，保證血液在分離液的上層。
[0134] (5)將離心管放入低溫高速離心機中以700g在22°C下離心25分鐘。使得血液在分 離液中發生分層。
[0135] (6)淋巴細胞在組織勻漿層和分離液之間的白膜層中，
[0136] (7)用84滴管盡量將白膜層吸到另一支離心管中。注意不要吸到分離液。
[0137] (8)將離心管放入低溫高速離心機中以250g在22°C下離心10分鐘。
[0138] (9)吸掉上層的液體，用加人白介素 -2(IL2)的含滅活血清的1640培養基重懸，計 數。
[0139] 5.2T細胞純化
[0140] (1)將分離出來的淋巴細胞計數，取個淋巴細胞于微型離心管中。
[0141] (2)將微型離心管放入低溫高速離心機中以250g在22°C下離心10分鐘。
[0142] (3)吸除上層液體，并用80μ1磁珠分離緩沖液重懸，并加入20μ1的CD3Micr〇BeadS。
[0143 ] (4)在4 °C的冰箱中放置1小時，并將磁體放入生物安全柜中滅菌。
[0144] (5)1小時之后在微型離心管中加入ImL的緩沖液。再在低溫高速離心機以317g，在 5 °C離心10分鐘。此時準備過濾柱子，將過濾柱安放在磁鐵上，用500μ1的緩沖液洗，緩沖液 隨著重力向下流。
[0145] (6)離心棄上清，細胞用500μ1的緩沖液重懸，并加入柱子，下面用離心管接收廢 液。緩沖液隨著重力向下，并用500μ1的緩沖液沖洗四次。
[0146] (7)沖完之后，將柱子從磁鐵上取下來，并用ImL緩沖液將T細胞沖下來。
[0147] (8)將沖下來的細胞在低溫高速離心機以317g，在5°C離心10分鐘。
[0148] (9)最后用加了 IL2的含滅活血清的1640培養基重懸，計數。
[0149] 5.3T細胞慢病毒感染
[0150] (1)將純化的T計數，I X IO6個T細胞/孔(6孔板)種植，培養過夜后，加入MOI為2的 對照病毒液(空載體包裝，Control)和Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19病毒液，感染過夜。
[0151] (2)感染第二天，加入1ml新鮮培養基。
[0152] (3)感染后第三天，T細胞已充分活化，增殖旺盛，此時將T細胞轉入25cm2小培養 瓶。
[0153] (4)感染5天后，進行殺傷實驗。
[0154] 5.4殺傷實驗
[0155] (1)計數表達CD19分子的Raji細胞，IX IO4個Raji細胞/孔(96孔板）；計數病毒感 染的T細胞(Control病毒液感染的Control T細胞和Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19病毒感染的 ⑶19CAR-T細胞），按照效靶比10:1，5:1，2.5:1的比例加入Raji細胞上層，實驗設計如下表：
[0157] 表3殺傷實驗設計表
[0158] 5.5殺傷測量
[0159] 使用Promega試劑盒(CytoTox 96非放射性細胞毒性檢測，貨號:G1780)通過測量 死亡細胞的LDH酶得到CAR-T細胞殺死Ra j i細胞的百分率。操作照試劑盒說明書，
[0160] (1)殺傷實驗進行4小時后，最大釋放孔加入試劑盒提供的10 X細胞裂解液。
[0161] (2) 2小時后，每孔取50μ1上清，加入50ylLDH反應底物，反應20分鐘后，于酶標儀測 量492nm處吸光度0D492。
[0162] 5.6殺傷率計算
[0163] 按照公式" ％細胞毒性=[(實驗-效應細胞自發-靶細胞自發)/(祀細胞最大-靶細 胞自發）]X 1〇〇"計算殺傷率，其中實驗孔為不同效靶比得到的0D492,效應細胞自發為 Control T細胞或CD19CAR-T細胞單獨的0D492,靶細胞自發為Raji單獨(最小釋放），靶細胞 最大為Raji單獨(最大釋放）。計算得到的殺傷率見附圖7,表明我們構建的Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19載體能夠成功地包裝為慢病毒，制備CAR-T，具有殺傷功能，完全能夠滿足CAR-T研 究和應用的需要。
[0164] 序列表 <110>北京普瑞金科技有限公司、普瑞金（天津）生物技術有限公司 <120>用于CAR-T制備的慢病毒載體及其構建方法和應用 <130、 2016 <160> 11 <170， PalcnlIn version 3.5 <2i0> I <211> 6266 <212> DNA <2丨3>人丨：合成 <400> 1 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60 ckckaggeta cttccctgat tagoagaaet acacaccagg geeaggggtG agatatc€ac 120 tgaeetttgg atggtget汍e aagctagtac eagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagG ttgttacacc Ctgtgageet gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaea gG€g：eetagc atttcateae gtggeeegag 3〇Q agctgcatee ggagtacttc aagaactgct gat ate gage ttgctacaag ggactttccg 360 C 112 I; Si' SI C ? t t C C LI Li, 12 cl 12, U C t ii, C C t ii, Li C ii, Π C t ii, Li, 12 ? t ii, C I; i\ C C C t C Π cl t 42 0 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgettc aagtagtgtg tgcecgtetg ttgtgtgact c'tggtaacta gagatcoctc 600 agaccGtttt agteagtgtg gaaaatGtct agcagtggcg eecgaacagg gaGttgaaag 660 Cgaaagggaa aceagaggag etctctegae geaggactcg gettgctgaa gcgcgcaegg 720 eaagagggga ggggeggcga Gtggtgagta cgqcaaaaat tttgactage ggaggctaga 78 0 aggagagaga tgggtgcgag age;g：tc：agta 11a：ageggg.g gagaattaga tcgcgatggg 840 aaaaaatteg gnaaggcca gggggaaciga a a a cUitataa attaaa；icar atagtcUgug 900 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960 gtagacaaat actgggaeag ctacaaecat ccetteagac aggatcagaa gaacttagat IQ20 cattataiaa； tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080 ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
[0165] aagcggecgg ccgctgatct tcagaccigg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260 aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320 gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtea atgacgctga cggtacaggc 1 38:0 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gGa.gaacaat ttgetgaggg ctattgaggc 144U gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caa^aatcct 1500 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560 actcatttgc aceactgctg tgcettggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620 gatttggaat caeaegaect ggatggagtg ggaeagagaa attaaeaatt aeacaagett 1680 aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740 ：gga at tag at a a a t gg g c aa grttgtggaa ttggtttaaG ataacaaatt ggctgtggta 1800 tataaiaatta ttcataatga tngtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860 actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacceacct 1920 cccaaccccg aggggacccg ncaggcccga aggaatagna gaagaaggtg gagagagaga I 9S0 c a g a g i\ c a g n tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt a a a a g a i\ a a g 2()40 gggggatigg ggggraciigt gdggggiiwi CiUiUHMgCii iicagitcnrHc 2 I 00 aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160 acagcagaga tccagtttat cgatgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag 2220 ctgaagcttc gaggggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc °280
[0166] catccacgcc ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg 2340 tccgccgtct aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gccttigtcc ggcgctccct 2400 tggagcctac ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc 2460 tacgtctltu tttcgttttc tgttctgGge cgttaciagat ccaagctgtg accggcgcct 2520 acgctagacg aattcctcga gaetagttct agagcggccg cggatccacg cgtgcctcga 2580 etgtgeette tagttgecag ecatctgttg tttgcccctc ecccgtgcct tecttgaecc 2640 tgg.aaggtge cacteGeaet gtcctitcct aataaaatga gga：aattgca tegcattgtc 2700 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacageaag ggggaggatt 2760 gggaagacaa tagcaggcat gctggggact gicagtcgaga cctagaaaaa eatggagcaa 2:820 tcacaagtag eaatacagca: gctaccaatg ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg 2880 aggaggaggt gggtttteca gteaeacetc aggtaccttt aagaecaatg acttacaagg 2940 cagctgtaga tcttagccac tttitaaaag aaaagagggg actggaaggg ctaattcaet 3000 CGcaaegaag aGaagatatc cttg:atctgt ggat<itaee3 Caeacaaggc tacttccctg 3060 attagcagaa ctacacacca g；gg:Geagggg tcagatatcc actgaeGttt ggatggtgct 3120 acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga gagaacacca 3180 gctigttaca ccctgtgagc ctgeatggga tggatgaccc ggagagagaa gtgttagagt 3240 ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact j300 tGaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac tttccaggga 3 360 ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata taagcagctg 3420 ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 3480
[0167] taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 3540 tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 3 600 tggaaaatct ctageagtag tagttxatgt catettatta ttcagtattt ataacttgca 3 660 aagaaatgaa tatcagagag tgagaggcct tgacattgct agcgtttacc gtcgacctct 3 720 agctagagct tggegtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 3 7^0 acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 3 840 gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 3900 tcgtgccagc Tgcattaatg aatcggcqaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtatiggg 3960 cgctcttccg Gttcctegct c-aGtgaetcg Ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 4020 gtatcagctc actcaaciggc ggtaatacgg iratccaca^ aarcagggga taacucagga 4080 aagaacatgt gagcaaaagg ecagcaaaag gccaggaaec gtaaaaagge egcgttgctg 4140 gcgtttttpc nraggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgiicg crcaagtcag 4200 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttGGccctgg aagctccctc 4260 gtgcgctctc cfgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4320 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggt：atc tcagttcggt gtaggtcgtt 438Θ cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaecc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 4440 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgaet tatcgccact ggcagcagcc 4500 actggrnaca ggattagcag ngCLUiggrat gtaggcggtg ctacagagtr cttgaagtgg 45 60 tggcctaact ncggctacac t a g a n g a a c a gtatttggra tctgcgcrcr gctgaagccn "
[0168] gttaccttCg. gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 4680 ggtggttttt ttgtttgcaa geageagatt acgegcagaa aaaaaggate tcaagaagat 4740 cctttgatct tttctacggg gtctgacget cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 4800 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc aectagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 4860 tttaaatca珠 tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 4920 ag t g a g g c a ο ct at etc age gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 4980 gtcgtgtaga taactacgat acgggagggG ttaecatctg gc-c-c-c；agtg：c· tgcaatgata 5040 CGgGgagaGG Gacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaacoagcc agccggaagg 5100 gccgagcgca gaagtggtec tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 5160 cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 5.2.20- acaggcatcg tg.gtgtca.cg ctcgtcgtn ggtatggctt eatteagetc cggttGccaa 5280 cgateaaggG g a g 11 a c at g at c c c c G a tg； 11 g:t:g;c a a a a aageggttag ctcctteggt 53 40 cctccgatcg： ttgtcagaag taagttggGe gGagtgttat cactcafggt latggcagca： 5400 ctgeataatt ctettactgt eatgceatee gtaagatget tttctgtgac tg：gtga：g;tae 5460 tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg Qggcgac.ega gttgctcttg c.ccggcgtca 5520 ataegggata ataccgcgcc acatagpaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaa.egt 5580 tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 5fi40 actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca cca.gcgtttc tgggtgagca 5700 aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata j 760 ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 58,0
[0169] ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 5S80 cgaaaagtgc cacctgacgt cgacggatcg ggagaicaac ttgtttattg cagcttataa 5940 tggitacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 6000 ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcaactggat 6060 aactcaagct aaccaaaatc atcccaaact tcccacccca Iaccctatta ccactgccaa 6120 ttacctgtgg tttcatttac tetaaaeetg tgattcctct gaattatttt eattttaaag 61 8 0 aaattgtatt tgttaaatat gtactacaaa cttagtagtt tttayagaaa ttgtatttgt 6°40 taaatatgta ctacaaactt agtagt 6266 <210> 2 <211> 383 <'212> DNA <213>人工合成 <400> 2 gttctttttc gcaacgggtt tgeegccaga aCacagctga agcttcgagg ggctcg-catc 6Q tetGctteac gegcecgceg cectacctga ggccgecatc eacgGCggtt gagtcgcgtt 12D ctgccgcetc ccgcctgtgg tgcctGCtga actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag 18:0 ctcaggtcga gaccgggcct ttgtceggeg efeGcttgga gGctacetag aetcageGgg 140 ctctccacgc tttgectgaG cctgcttgct caactctacg tcUlgtttc gttttGtgtt 3 00 ctgcgecgtt acagatecaa gctgtgaecg gcgcctacgc tagacgaatt cctcgagact 360 agttctagag cggccgcgua toe 383
[0170] <210> 3 <211> 8140 <212> DNA <2]3>人工合成 <400> 3 tggaagggct aattcactGC caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaecaca 60 caca n ggcta cttcc： c：tgat trnzcngaa ct acacnccagg gcc^ggggtc ajzatntcciic 12D IgaGGtttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcet gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcnrcc ggagracrtc aagaactuct i]atatcgagc trgctncaag gyactttccg '()() ctggggdctt tecdgggdgg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgoctgt aetgggtctc tctggttaga oeagatotga 48G gcctgggagc tctetggGta actagggaac ccactgetta agcctcaata aagcttgcct 54Q tgagtgcttc aag：t：ag.tgtg '；t.g,cecg:t.etg ttgtgtgaGt ctggtaacta gagatGCetc 600 agaecctttt ag：te:ag:tgtg gaaaatctct agca：gtg；geg ecegaacagg gacttgaaag 060 egaaagggaa aceagaggag ctetctcgae gcaggaetpg gcttgetgaa g.cgc-gcacgg 720 Gaagaggcga ggggcggcga etggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 tgggrgcg：ig agcgtcagta ttaniiciiggg gamuUtagn tcucgntggg 840 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900 ca ag c a g g g a g c t a g a a e g a ttegeagtta atectggcct gttagaaaca tcagaaggct 960 gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
[0171] cartatataa tacagtagca accctcratt grgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 108U ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140 aagcggcegg ccgctgatet tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag :1200 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc I 26:0 aaagagaaga gtggxgcag-.a gagaaaaaag ageagtggga ataggagctt tgttccttgg 132U gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc [3 80 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440 gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560 aotcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctetggaaea 1620 gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt aGacaagett 1680 aataeaetec ttaattgaag aatcgcaaaa ceagcaagaa a^gaaigaae aa^aaiiatt 1740 g g a a t ? ag at an atgggcaa gtttgtgga a rtggtrtnac ataacaaatt ggctL'tggta 1800 tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860 acttictata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920 ccciinccccg ^ggggacccg ncaggcccgn itggitatng;in gniignHggtg gngiigngii^a 1980 CMgiigacaga tccattcgnt tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt a a m Mga a a ag 2040 gggggattgg ggggtacagt gcaggggn a a gnara graga cataatagcii acagacatac 2100 aaactaaag：a attacaaaaa caaattataa aaatteaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
[0172] acagcagaga tccagttiat cgataagett gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2.220 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280 ttcccatagt aaGgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcG aagtaGgccc cctattgacg 2400 teaatgacgg taaatggcee gcctggcatt at：g；cccagt：a catgacctta tgggactttc 2460 ctaettggca gtacatetac g t a t ? a g t c a t：c g c t a 11 a c catggtgatg cggttttgge 2520 agtaeatcaa tgggcgtgga tageggtttg actcacgggg； atttecaagt ctceaeeeea 25 80 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaaeg g.gaetttcCa aaatgtegta %640 acaactcGgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700 gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ceatecacgc tgttttgacc 2760 tceatagaag acaccgactc taetagagga tctatttccg gtg a attest cgagactagt 2B20 tctagagcgg CCgCggatGC cgecGCtctc eetcee.ccGC ecctaacgtt actggccgaa 2§ SG gcegattgga ataaggccgg tgtgGgirtg tetaMt'gtt attttGcacc atattgecgt 294 O ettttggcaa tgtgagg：gCe cggaaaeetg gecctgtctt ettgacgagc attcetaggg 3U00 gt；ctttc：e；ec: tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagoagttc J060 ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc 3 120 ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa 3 ISO aggcggcaca accceagtgc eacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc 3240 tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgecca gaaggtacce Gattgtatgg 3300 gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttaeatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac 33i>0
[0173] gtcraggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt 1420 gccacaaccc acaaggagac： gaccttccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc 3480 cacccgcgac gacgtccccc gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc 35:40 cgccacgcgc cacaccgtcg acccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga 360:0 actcttcctc acgcgcgtcg ggotcgaeat ：eggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcge 3660 cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 37^0 cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 3780 cctectggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggtic ctggccaccg tcggcgtctc 3 840 gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc 3900 cgagcgcgcc ggggtgcccg octtcctgga gacctccgcg ccccgcaaec tccccttcta 3960 ggcttcacGg tc；acegG€ga cgtcgaggtg cccgaaggae cgcgeaGCtg 4020 gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctagac gcgtctggaa caattaacct ctggattaca 4080 aaatttgtga aagattgaet ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 4140 acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 4200 ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 426Θ gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 4320 cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 4380 tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 4440 tggtgttgtc ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 4500
[0174] ttctgcgcgg. gacgtccttc tgctacgtcc ettcggccct caatccagcg gaccttectt 4560 cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcge cctcagacga 4620 gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggaattaa ttctgcagtc gagacctaga 4680 aaaacatgga gcaatcacaa gtagoaatac agcagctacc aatgctgat.t gtgcctggct 4740 agaagcacaa gaggaggagg ^ggtgggttt tGcagt；cae：a cctcaggtac ctttaagaeG 4800 aatgacttae aaggGagctg tagatcttag CGaGttttta aaagaaaaga ggggactgga 4860 agggetaatt cactcccaac g a a： g a： c a a g a t at e e 11： g a t etgtggatct aecacacaca 492.0 aggetaettc cctgattagc agaactacac aGcagggcca ggggrcagat atccactgac 4980 Ctttggatgg tgetaeaagG tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa 5040 aggagagaac accagcttgt tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag 5100 agaagtgtta gagtggaggt ttgacagecg cctagcattt catcaegtgg eccgagagct 516:0 gcatc：G：ggag t：aettcaaga actgctgata tGgagcttgc tacaagggac tttccgctgg 5220 ggaetttcca gggaggcgtg gcetgggegg gaetggggag tggcgageco tcagatcctg 5280 eatataagea getgcttttt gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atct.gagect 5340 ggg.ag：ct.ctc tgg.etaaqta gggaacccac tgettaagce tcaataaage ttgcGttgag 5400 tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 5460 ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc atgteatett attattcagt 5520 Rtttaraact tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag gccttgacat tgctagcgtt 5580 taccgtcgac etctagctag agcttggegt aatcatggtc ata-gctgttt cctgtgtgaa 5640 attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 5700
[0175] ggggtgccta atgagtgagc taacrcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 5760 agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 5820 gtttgcgtat tgggcgctet tecgcrtcct cgcteactga cfGgGtg：cg:e tcggtcgttc 5 8 80 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 5940 gggaiaacge aggaaagaac atgigagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 6000 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 6060 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 6120 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 6180 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 6240 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 6300 ：gGtg；Ggcctt atGGggtaac tatcgtettg agtccaaccc ggiaagacac 孩acttategci 6360 eactggcagc agccactggt aacaggatta ^cagagcgag gtatgtagg：：e： ggt<r ctacag 6420 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 6480 ctctgctgaa gccagttacc trcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc gucaaiiiCLUiia 6540 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 6600 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 6660 cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6720 attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 67 80 accaatgctt aatcagtgag gcacctatct eagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 6840
[0176] ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 6900 gtgctgcai\t gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatrtatca gcaataaacc 6960 agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 7020 etattaattg ttgccgggaa getagagtaa giagttc：gce agttaatagt ttgcgcaacg 7080 ttgttgceait tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtat.g gcttcattca 7140 geteeggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatccec catgttgtgc aaaaaagegg 7200 ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtea gaagtaagtt g gccg c a gt g tt ate a etc a 7260 tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 7320 tgactggtga giactcaacc aagtcaitct gagaatagtg t.atgeggcga ccgagttgct 7380 cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 7440 teattggaaa acgttctteg ggg.cgaaaaG tctcaaggat cttaeegetg ttgagatoca 7500 gttcgatgta acccactcgt gcacce:aact gatgHqage atcttttact ttcaccagcg 7560 tttGtgggtg agcaaaaaGa g；gaagg：eaaa atgGcgqaaa aaagggaata ag：ggegacae 7620 ggaaatgttg aaiacUrata Qtcttcettt tteaatatta it g a age art tatcag'ggtt 7680 attgtctcat gag e g g a t ac a t a t t：t g a a t gtatttagaa aaataaacaa ataggggtte 7740 CgCgCacatt tGceegaaaa gtgeeapctg aegtegaegg： ateg容gagai eaacttgtit: 7800 attgcagctt ataatggtta etaataaagG aatageatea eaaattteaG aaataaagca 7860 tttttttcac tgeattctag ttgtg：gtttg tccaaaetca teaatgtatc ttatcatgtc 7920 tggatcaact ggataactca agctaaecaa aatcatccca aaettccGaG cGcatacect 7980 attaccaetg ccaattac:￡;t gtggtttcat ttactctaaa cctgtgattc Gtctgaatta 8040
[0177] 、 ttttcatttt aaagaaattg tatttgttaa atatgtacta eaaaettagt agtttttaaa 810 0 gaaattgtat ttgttaaata tgtactacaa acttagtagt 8140 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 4 gggtncagrg cagggg；u<ag 20 <210> 5 <211> 1623 <：12> DNA <213>人工含成 <400> 5 gccaccatge ctctgqtget： getgctgcea： ctgctgtggg GaggagGact ggctc.aggtg 60 cagctgcagc agtecggagc agagcttgtg aggccaggca getccgtcaa aatcagctgc 120 aaggcttccg gctatgcatt ctctagttae tggatgaact gggtgaaaca gGg：accag:g：a 180 cagggaetgg agtggatcgg ：gcagatttgg cctggagaeg gcgataGtaa ct往taatg:ge 24:0 aagttcaaag ggaaggccac tctgacGgct gacgaatcaa gctccacagc ttatatgcag 300 e:tgtctagt€ t:ggcatcGga ggattGtgcc gtgtacttti gcgctcggag agaaaccaca 160 actgtcggcc ggtactatta Ggceatggac Iaciggggge agggaaccae agigaccgtc 420 tfiaagcggag gaggaggetc aggaugagga gggtecggag gcgggggatc tgatatceag 480 ctgacGcaga gtcctgcate actggccgtg agtctgggce age gage a ac aatttcctgt 540
[0178] aaagcctcc.c： agtctgtcga ctatgatggg gactcttatc tgaactggta eeag'cagatc 600 Ocaggacagc cccctaagct gctgatttac gacgcctcta atettgtgag tggcatccca 660 oeeagattea gtggctGagg gagcg；g：aaca gattttactc tgaatattca cccagtggaa 720 aaggtegaeg ecgctaecta tc：attg：t：ca：g cagagcaeeg aggacecctg gacatttgge 780 gg^ggaacta aacrggaaat taagagiact ccagcgaagc ccaccncgac gccngcgccg 840 cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg rcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900 tgccggGcag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc cGcacgcaaa 960 attgaagtta tgtatcctce tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 1020 catgigaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 1080 tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 1140 tttattattt tetgggtgag gagtaagagg agcaggetcc tgeacagtga ctaeatgaac 1200 atgactccec gccgccccgg gcccacGCgc aagcattacc agccciat;g:c cccaccacge 1260 gaettcgcag CetategGtc eagagtgaag tteagcagga gcgeagacg.c ceccgegtac 1320 cagcagggGG agaaceagct ctataaegag cteaatetag gacgaagaga ggagtacgat 13 SO gttttggaca agagacgtgg cegggaccet gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag H4U aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggqetacagt 1500 gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1560 etcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct ：gccecCtcgc 1620 taa 1623
[0179] <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213>人工合成 <400> 6 cggaattcgc caccatgcct ctgctgctg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213>人工合成 <400 7 cgggatcctt agcgaggggg cagggcetg 29 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 8 ggagcc tacc titga etc itgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 9 caaccaggat ttatacaagg 20
[0180] <2i0> IO <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 H 10 ggggaaagcc gcagagaagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <40Q> 11 ggtaaagg.ee atcgtgcc.cc 2.0
【主權項】
1. 用于CAR-T制備的慢病毒載體，其特征在于，所述慢病毒載體為Pre-Lenti-EFl-MCS， 其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。2. 如權利要求1所述的慢病毒載體的制備方法，包括以下步驟： 步驟1:基因合成EF1-MCS序列，兩端設置Clal和Mlul限制性內切酶位點，所述EF1-MCS 序列如SEQ ID 2所示； 步驟2:用限制性內切酶Cla I和Mlul雙酶切pLVX-IRES-Puro載體和所述EF1-MCS序列， 分別回收酶切后目的產物； 步驟3:連接步驟2回收獲得的酶切后目的產物獲得慢病毒表達載體Pre-Lenti-EFl-MCS〇3. 如權利要求1所述慢病毒載體的使用方法，包括下述步驟： 步驟1:將目的基因克隆入Pre-Lenti-EFl-MCS載體獲得重組慢病毒載體； 步驟2:將步驟1獲得的重組慢病毒載體和psPAX2和pMD2.0G共同轉染宿主細胞； 步驟3:培養宿主細胞； 步驟4:分離獲得重組慢病毒。4. 如權利要求3所述慢病毒載體的使用方法，其特征在于，所述宿主細胞為：293或293T 細胞。5. -種重組慢病毒載體，所述重組慢病毒載體由如下方法制備得到：將針對腫瘤相關 抗原(TAA)的CAR基因克隆入如權利要求1所述Pr e-Lent i -EF1-MCS的多克隆位點處。6. 如權利要求5所述的重組慢病毒載體，其特征在于，其中所述CAR基因識別的腫瘤相 關抗原（TAA)選自 0)19丄020、0)22丄033、0)138、801^、0)38、疆620、1?01?1、間皮蛋白、(3-]^七、 EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、⑶-2 或其任意組合。7. 如權利要求1所述的慢病毒載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。8. 如權利要求5或6所述的重組慢病毒載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。9. 一種測定重組病毒滴度的方法，包括如下步驟： 步驟1:慢病毒包裝：用如權利要求5所述慢病毒載體和提供病毒膜蛋白和結構蛋白的 包裝質粒共轉染宿主細胞，收獲重組病毒； 步驟2:制備梯度濃度的DNA樣品：按照5-15倍比例梯度濃度稀釋步驟1制備得到的重組 病毒，制成3-10組等梯度濃度的重組病毒稀釋液，用稀釋后的等梯度濃度的重組病毒稀釋 液分別感染相同濃度的宿主細胞并培養，收集等體積經感染和培養的293或293T細胞分別 提取DNA，制3-10組梯度濃度的DNA樣品； 步驟3:設計熒光定量PCR引物:設計靶向CAR基因胞內段CD3G基因的引物； 步驟4:熒光定量PCR方法測定重組病毒滴度:分別取等量步驟2提取的梯度濃度的DNA 樣品和步驟3獲得的熒光定量PCR引物構建熒光定量PCR擴增體系，相同條件下進行擴增，分 析實驗結果，用絕對定量的方法測定重組病毒滴度。10. 如權利要求9所述的測定重組病毒滴度的方法，其特征在于所述提供病毒膜蛋白和 結構蛋白的包裝質粒為psPAX2和pMD2.0G，所述宿主細胞為293或293T細胞。
【文檔編號】A61P35/00GK106086077SQ201610526284
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】何昱
【申請人】北京普瑞金科技有限公司, 普瑞金（天津）生物技術有限公司