一種細胞因子il?7的表達方法

一種細胞因子il?7的表達方法
【專利摘要】本發明提供一種細胞因子IL?7的表達方法，步驟如下：（1）構建IL?7重組質粒pcDNA3.1?IL7；（2）將重組質粒pcDNA3.1?IL7轉染HEK293細胞；（3）將轉染后的細胞用含G418的高糖DMEM培養基繼續培養，得到陽性單克隆細胞株；（4）將陽性單克隆細胞株進行培養，得到含有生長因子IL?7的細胞上清。本發明應用人源細胞HEK293制備IL?7，培養后，IL?7的含量3.2ng/mL。
【專利說明】
_種細胞因子IL-7的表達方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種細胞因子IL-7的表達方法。
【背景技術】
[0002] Whitlock等在Witte-Whitlock骨髓培養中發現存在一種刺激pre-B和原B(pro-B) 細胞生長的一種細胞因子。經研究發現，只有在含骨髓基質細胞系的培養基上培養時，pre-B細胞才能持續生長，而其他重組或天然細胞活性物質均無法替代骨髓基質細胞的作用。為 進一步分析這種細胞因子，研究者們從培養基的基質成分中分離得到了一株單克隆細胞 株，命名為IxN/A6,隨后又從培養該細胞的上清溶液中分離純化出了一種單鏈糖蛋白，此蛋 白相對分子質量(Mr)大小為25KD，是一種可溶性生長因子，起先命名為淋巴細胞生成素-1 (Lymphopoiotin-1，Lp_l)，后又改稱為IL_7〇
[0003]在首次發現時，IL-7被當作是一種促進pre-B和原B(pro-B)細胞生長的一種細胞 因子，后來通過研究發現，其還具有促進B、T細胞生長和抗凋亡的功能。它不僅是B細胞生長 和pro-B細胞生存、分化、增殖的因子，而且還是T細胞生長、增殖所必需的細胞因子。在胸腺 早期的分化、增殖與樹突狀細胞的發育、分化等方面，IL-7也起到了至關重要的作用。但IL-7對抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的殺傷活性并沒有增強的作用，它首先從胸腺轉移到外 周血中，然后再誘導胸腺細胞或外周血淋巴細胞產生淋巴因子，激活并增強LAK活性，CD8+ 亞群就是IL-7的主要效應細胞，而且IL-7還可以支持記憶⑶8+T細胞穩態擴展和生存。IL-7 可以促進骨髓組織生成，它是多潛能干細胞和髓樣前體細胞的一種移動因子。IL-7不光能 刺激髓樣前體細胞和巨核細胞產生集落形成單位和血小板，使機體從環磷酰胺的免疫抑制 中得以恢復，而且在較高濃度時，它還能誘導增強巨噬細胞的細胞毒活性，作為生成CTL細 胞、NK細胞以及活化單核細胞的協同因子，誘導單核-巨噬細胞分泌各種細胞因子，促進炎 性因子表達:如巨噬細胞炎癥蛋白a(MIP-a)、MIP-f3、IL_8及單核細胞趨化蛋白-I(MCP-I) 等。通過活化炎性細胞產生的大量致炎因子，不僅能夠控制炎癥過程各組分之間的相互反 應，還能增強單核細胞源性炎性因子受體（Chemokinereceptors，CCR)如CCRl、CCR2及 CCR5的表達。除此之外，IL-7在誘導免疫反應方面也發揮著非常重要的作用，它不僅可以誘 導I型免疫反應，增加 IFN-γ和IL-2的產生，同時還能夠協同IL-12以誘導產生IFN-γ 和增殖T細胞。IL-7和轉化生長因子β之間也具有相互調節的作用，是免疫調控機制中非常 重要的一環。總之，IL-7具有非常廣泛的免疫效應，它在機體免疫系統的正常發育和維持免 疫功能等方面均發揮了不可替代的作用。
[0004] IL-7不僅能夠促進T細胞的免疫重建，而且還能夠誘導T細胞循環和BCL-2表達 的上調，這對拓寬循環T細胞受體庫的多樣性和持久性，增加 CD4+和CD8+T細胞的數量都具 有積極的促進作用，從而明顯改變了T細胞亞群的分布，而且對HIV抗原來說，擴增的T細胞 還能夠分泌IL-2與IFN-γ，具有很好的抗病毒功能。因此，IL-7能夠逆轉HIV特異性T淋巴 細胞在增殖、細胞因子的分泌和細胞功能的發揮等方面的缺陷，具有極大的臨床研究價值。
[0005] 基因工程制備蛋白類藥物是生物技術發展的必然趨勢，相對與提取工藝具有生產 批量自由、不受原料限制、安全可控、可修飾、易于純化等優點。目前尚未公開應用基因工程 的方法如何制備生長因子IL-7。

【發明內容】

[0006] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種細胞因子IL-7的表達方法， 是利用人源化HEK293細胞來表達的。HEK293細胞是人源化細胞，相對于其他種屬細胞而言， 在蛋白后期純化中，純度要求要稍低，人源化蛋白殘留對于人體而言，負面損害較低；用 HEK293細胞表達外源蛋白，在羰基化、甲基化修飾以及三級結構、四級結構等方面更接近天 然蛋白，蛋白活性和功能更接近天然蛋白。
[0007] 本發明提供一種細胞因子IL-7的表達方法，步驟如下： (1) 構建 IL-7 重組質粒 pcDNA3 · 1-IL7; (2) 將重組質粒pcDNA3.1-IL7轉染HEK293細胞； (3) 將轉染后的細胞用含G418的高糖DMEM培養基繼續培養，得到陽性單克隆細胞株； (4) 將陽性單克隆細胞株進行培養，得到含有生長因子IL-7的細胞上清。
[0008] 作為優選，在構建重組質粒時，在IL-7基因起始密碼子ATG前加入一段序列 GCCACC0
[0009] 作為優選，所述構建重組質粒的具體方法為： (1) 在IL-7基因起始密碼子ATG前加入一段序列GCCACC，之后將其克隆至pUC57載體上； (2) 利用引物進行PCR擴增，所述引物為： YIL-7-F：CCGGAATTCCTCGAGGCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAGG YIL-7-R：ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCCCCGGGTCAGTGTTCTTTAGT； (3) 將擴增產物和pcDNA3.1載體分別雙酶切和膠回收，用T4連接酶進行連接，轉化至感 受態細胞BL21，誘導表達后，得到重組質粒pcDNA3.1-IL7。
[0010] 作為優選，所述重組質粒pcDNA3.1-IL7的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.2。
[0011] 作為優選，步驟(3)中所述G418的濃度小于等于600μg/ml。
[0012] 作為優選，步驟(4)中所述培養是在含胎牛血清的DMEM培養基中進行培養，培養條 件為37°C，50mL/L CO2,培養時間為2d。
[0013] 本發明應用人源細胞HEK293表達制備IL-7，培養后，IL-7的含量3.2ng/mL。
【附圖說明】
[0014]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中： 圖1為PCDNA3.1-IL7重組質粒驗證結果；其中，圖Ia為pcDNA3.1-IL7菌液PCR驗證;M: Ikb plusDNA 分子量 Marker;l:水的 PCR 產物；2-4: pcDNA3.1-IL7 的 PCR 產物；圖Ib 為 pcDNA3.1_IL7重組質粒酶切鑒定；M: Ikb plusDNA分子量Marker; 1-3:重組質粒 pcDNA3.1-IL7雙酶切產物。
[0015] 圖2為HEK293-IL7細胞與對照組細胞綠色熒光觀察結果（100\)。其中4，(：： pcDNA3 · 1-IL7轉染組24h; B，D: pcDNA3 · 1-IL7轉染組48h;E，G: pcDNA3 · I-EGFP對照組轉染 24h;F，H: pcDNA3.1-EGFP對照組轉染48h。
[0016] 圖3為冊1(293-幾7-263細胞中基因的轉錄表達檢測，其中，1:10(^?0財分子質量 標準;I:克隆細胞實驗組;2:對照組;3:水。
[0017 ]圖4為IL-7標準品的標準曲線及標準曲線方程。
[0018] 圖 5為IL-7蛋白的 Western-blot分析。
【具體實施方式】
[0019] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0020] 實施例1 1、獲取目的基因 從NCBI數據庫中獲取IL-7的核苷酸序列，結果如下所示： ATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCAT CTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGAC AGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAA GGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATC TCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCT GCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTT GTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACACTGA 為提高IL-7的表達效率，在基因的起始密碼子ATG前加入了一段kozak序列GCCACC，并 由廣州輝俊生物科技有限公司合成并克隆至PUC57載體上。
[0021] 2、設計引物及合成 根據PUC57-IL7載體的核苷酸序列和pcDNA3.1載體序列，用Primer Primer5.0等軟件 設計引物，送生工生物工程(上海)有限公司進行引物的合成，結果如下： YIL-7-F：CCGGAATTCCTCGAGGCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAGG YIL-7-R：ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCCCCGGGTCAGTGTTCTTTAGT 其中CCG和ATAAGAAT為保護堿基，GAATTC為價oRI酶切位點，GCGGCCGC為AfeiI酶切位點。
[0022] 3、IL-7基因擴增 以上述PUC57-IL7載體為模板，配制PCR反應液，反應總體積為25yL，具體反應體系如下 所示： DEPC水 18.5yL 10XPCR buffer 2.5yL dNTPs(IOmM) 0.5yL YIL -IL7-F(20pmol/yL) 0.5yL YIL -IL7-R(20pmol/yL) 0.5yL Taq酶（2.5U/yL) 0.5yL PUC57-IL7 2. OyL 總體系 25. OyL。
[0023] 將配置好的反應液混和均勻，放入PCR儀中進行反應，條件為:95°C預變性5min; 94°C變性30s，69°C退火45s，72°C延伸lmin，進行35個循環，最后72°C再延伸lOmin。用核酸 電泳來檢測反應產物，剩余的樣品于-20°C保存以備用。
[0024] 4、構建重組表達載體pcDNA3.1-IL7 4.1雙酶切及膠回收 將上述擴增產物和pcDNA3.1載體分別用五C〇RI和AfeiI限制性內切酶進行雙酶切，于37 °C水浴鍋中水浴Ih。反應體系如下所示。
[0025] DEPC 水 2 .OyL IOXH buffer 5.OyL 10%BSA 2.OyL 0.1% TritonX-IOO 2.OyL EcoRl 2.OyL Notl 2.OyL IL-7 片段/pcDNA3.1 35. OyL 總體積 50.0 yL。
[0026] 用10 X loading buffer混合上述酶切產物，以30yL/每孔加入樣品，進行1.0%瓊脂 糖凝膠電泳，電泳完成后，在長波紫外燈光照射下，切下含目的基因和載體的瓊脂糖凝膠部 分，其余部分全部棄掉，稱量切下的凝膠重量，然后將其轉入5mL的離心管中，按照IOOmg= IOOyL的比例，將凝膠質量(mg)換算成液體體積(yL)，并向凝膠中加入三倍體積的GSB溶劑， 置于60°C水浴鍋中水浴IOmin左右。水浴期間，為加速溶解，可以每隔約2-3min左右輕彈或 搖晃離心管。待凝膠全部融化后，室溫靜置數分鐘，使其溫度降至室溫，因為如果凝膠溫度 太高，則不利于DNA與離心柱結合，使回收率偏低，將所有的凝膠溶液加入離心柱中，室溫靜 置l-2min，然后1000 Og離心2min，棄去濾液，將離心柱放入收集管中。向離心柱中加入650yL 的WB洗液，1000 Og離心2min，棄去濾液，將離心柱放回收集管中，最后1000 Og空離2min，把離 心柱放入一個新的1.5mL的EP管中，室溫靜置5-10min，確保離心柱中殘留的乙醇揮發干凈。 向離心柱的中央部位懸空滴加40yL的EB洗脫液，室溫靜置約2min左右，1000 Og離心2min洗 脫DNA，將回收好的DNA放于-80 °C冰箱中儲存備用。
[0027] 4.2 IL-7基因與pcDNA3.1載體連接 將上述膠回收的目的片段與表達載體用T4連接酶進行連接，體系如下： T4 Iigase 0.5yL 10xT4 ligation buffe I.OyL IL-7膠回收產物 7.5yL pcDNA3.1膠回收產物 l.OyL 總體積 10.0 yL 將反應體系置于恒溫循環槽中16°C反應約12h左右。
[0028] 4.3轉化感受態細胞此21 在-80°C冰箱中取出感受態細胞BL21，將其放入冰盒中，立即加入IOyL pcDNA3.1-IL7 連接產物，將兩者混合均勾，冰浴20min左右，在42 °C水浴鍋中放置90s。繼續冰浴3min，加入 0.6mL無抗LB液體培養基，37 °C 200r/min振蕩培養約60min后，取200yL涂布含有 Ampicillin的LB固體平板，后置于37°C靜置培養。
[0029] 4.4單克隆 挑取單一、圓潤的菌斑加入至含六11^1；[(3；[11;[11的1^液體培養基中，放在37<€，2001'11^|/1]1；[11 的搖床中培養8h。將菌液4 °C保存備用。
[0030] 4 · 5重組質粒pcDNA3 · 1-IL7的提取 在質粒抽提時，除了提取pcDNA3.1-IL7質粒外，還需提取對照組質粒pcDNA3.1-EGFP。 使用質粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司的高純質粒小提試劑盒)進行提取，具體 提取過程如下： 取上述菌液各1.2mL，加入到1.5mL的EP管中，12000 rpm離心l-2min，盡量吸除上清液， 并向沉淀中加入250yL的Pl溶液(使用前，需按說明書將RNase A加入到Pl中，并混合均勻）， 用槍尖吹打混勻沉淀，待沉淀完全混勻后，加入250yL的P2溶液，將EP管輕柔顛倒混勻10次 以便菌體裂解均勻。向EP管中加入350yL的溶液P3溶液，立即將EP管輕柔顛倒混勻10次，此 時，EP管中的溶液會出現白色絮狀沉淀，將其放入到離心機中12000 rpm離心5min。用移液 槍吸取500yL的平衡液BL加入到吸附柱CP3中平衡，12000rpm離心2min，棄去收集管中的平 衡液，將吸附柱CP3放回收集管中備用，經5min離心后，吸取EP管中的上清，注意不要吸到沉 淀，然后將上清轉移到已用平衡液BL平衡過的吸附柱CP3中，12000 rpm離心2min，棄去濾 液，加入500yL去蛋白液，12000 rpm離心Imin，棄去收集管中的濾液，將吸附柱CP3放回收 集管中，再向吸附柱中加入600yL洗液PW，12000 rpm離心2min，棄去洗液，重復加入PW洗液 一次，棄掉廢液后，將吸附柱CP3空離2min后，將其重新放入一個新的1.5mL EP管中，室溫晾 干5-10min，向吸附柱CP3的中央部位滴加 IOOyL洗脫緩沖液EB，室溫靜置約2min，12000 rpm 離心2mins，洗脫質粒，取出約IOyL用來檢測提取的質粒的濃度，其余質粒凍存于-80°C冰箱 中備用。試驗中檢測 pcDNA3.1-IL7 質粒濃度為 775yg/mL，pcDNA3.1-EGFPS2250yg/mL。
[0031] 4.6菌液PCR鑒定 按照如下體系配制，向PCR管中加入IyL菌液進行PCR，反應體系如下： DEPC水 19.5yL 10XPCR buffer 2.5yL dNTPs(IOmM) 0.5yL YIL-IL7-F(20pmol/yL) 0.5yL YIL-IL7-R(20pmol/yL) 0.5yL Taq酶（2.5U/yL) 0.5yL pcDNA3.1-IL7菌液 I .OyL 總體系 25. OyL。
[0032] 將配置好的反應液混和均勻，放入PCR儀中進行反應，條件為:95 °C預變性5min; 94 。(:變性30s，69 °C退火45s，72 °C延伸Imin，進行35個循環，最后72 °C再延伸IOmin。
[0033] 4.7質粒酶切驗證 將提取的PCDNA3.1-IL7質粒分別用五C〇RI和AbiI限制性內切酶進行雙酶切，于37°C水 浴鍋中水浴lh。配制1.2%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳，驗證目的條帶的大小。
[0034] 4.8測序鑒定 將測序結果與Genbank中公布的序列進行對比，發現核苷酸沒有發生改變，同源性為 100%，將測序并鑒定正確的質粒命名為PCDNA3.1-IL7。重組質粒pcDNA3.1-IL7的核苷酸序 列如下： CCGTGGGGGTAATAGCAGAGCTCGTTTAGTGACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACC TCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCGAATTCCTCGAGGCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACT TCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCATCTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATG AGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAA TTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAG GCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGT TGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAA AATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTG TTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACACTGACCCGGGGGATCCGCGGCCGCGAAGGATCTGCGATCGCTCC GGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTG 下劃線部分為IL-7序列，其他為質粒部分核苷酸。
[0035] 5、細胞G418最小致死濃度的篩選 將HEK293細胞按I X IO5個/孔鋪24孔板，然后取不同濃度梯度的G418加入24孔板中， 6418的濃度梯度為048/1111^、20(^8/1111^、40(^8/1111^、60(^8/1111^、80(^8/1111^、100(^8/111匕培養10-14d并每天觀察細胞狀態。
[0036] 6 轉染 HEK293細胞 6.1鋪板 復蘇HEK293細胞，傳代2-3次，挑選處于對數生長期并生長良好的細胞以I X IOiMVmL 接種至6孔細胞培養板中，培養24h后觀察細胞并轉染pcDNA3.1-IL7質粒。
[0037] 6.2轉染 轉染細胞時，用無血清opti-MEM將HEK293細胞洗兩遍，然后每孔加入1.5mL的opti-MEM。取重組pcDNA3 · 1-IL7質粒10 · 4yL(質粒含量為8yg)加入到489 · 6uL opti-MEM中，混合 均勻，靜置5min，命名為A液；取20yL Lipofectamine 2000加入到480yL opti-MEM中，混合 均勻，靜置5min，命名為B液；取重組pcDNA3.1-EGFP質粒3.2仙（質粒含量為8ng)加入到 496 · 8yLopti-MEM中，混合均勻，靜置5min，命名為Al液；取20yL Lipofectamine 2000加入 到480μ?ορΜ-ΜΕΜ中，混合均勻，靜置5min，命名為Bl液；將A液加入到B液中，室溫靜置 20min，將Al液加入到Bl液中，室溫靜置20min，20min后將AB與Α1ΒΓ混合液分別逐滴加入到 HEK293細胞中，每孔250UL。在37°C、50mL/L CO2培養箱中反應約5h，用移液槍吸除轉染液， 然后向每孔細胞中加入2mL含10%新生牛血清的新鮮DMEM培養基(Gibco公司）培養。
[0038] 6.3轉染細胞的繼續培養 轉染24h后，向細胞培養基中加入G418，使G418終濃度為eOOng/mL，繼續培養細胞。 [0039] 6.4細胞觀察 分別在轉染24和48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞的生長狀態以及對照組綠色熒光的 表達情況，以初步判斷轉染效率。
[0040] 7、HEK293細胞克隆 將細胞用〇. 25%胰蛋白酶消化下來，用含eOOug/mL的G418的高糖DMEM培養基稀釋細胞， 按1個細胞/孔接種96孔板，每孔200μL培養基，培養7-14d左右，在第一周后每天按時用倒置 顯微鏡觀察細胞克隆情況。發現有3孔細胞只有一個細胞集落，確定為單克隆細胞，分別命 名為 2G3、1A7、1B1。
[0041 ] 8、克隆細胞保存 將克隆細胞株2G3、1A7、1B1從96孔板中用0.25%胰蛋白酶消化下來，加入1ml含有10%新 生牛血清的DMEM培養基中培養，置于24孔板中培養，然后同法置于6孔板培養，最后到75ml 細胞培養品中。然后用〇. 25%胰蛋白酶將細胞消化下來，取一部分細胞繼續培養，其余部分 細胞凍存。凍存方法:取I OmL新鮮培養基(含有10%新生牛血清的DMEM培養基)將細胞重懸， 然后將IOmL細胞懸液加入到50mL離心管中，取約500UL細胞懸液進行計數并計算細胞總數， 將細胞1000 rpm，離心10min，然后取適量凍存液（10%二甲基亞砜、20%新生牛血清、70%DMEM 培養基)將細胞吹打均勻，使細胞密度為300萬/mL。然后按每管300萬/支分裝細胞，將分裝 并標記好的凍存管放于4°C冰箱中靜置2h，然后將其塞入棉包中，-80°C冰箱放置過夜，第2d 將其放入液氮罐中長期保存。
[0042] 9、克隆細胞株的IL-7基因轉錄表達 9.1總RNA提取 將步驟8中放大培養后的陽性克隆細胞活化培養2-3代后，應用北京天根生化科技有限 公司的細胞總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，具體方法如下： 取狀態良好且處于生長對數期的HEK293-IL7克隆細胞，棄去細胞培養基（用移液器吸 取細胞瓶中培養基），將細胞上清用PBS清洗3次，用0.25%胰酶消化，并用10%新生牛血清的 Fl2或高糖DMEM培養基IOmL將細胞吹打下來，加入到50mL離心管中，1000 rmp離心10min，棄 掉培養基，用ImL無菌PBS重懸并洗滌細胞，1000 rmp離心10min，棄掉上清，重復洗滌操作2-3 次，最后用ImLPBS重懸細胞后，進行細胞計數，細胞總數為4 X IO6個，然后向細胞中加入350 HL RL液裂解細胞，并用漩渦振蕩器混勻，待液體呈明亮透明且不粘稠時，說明裂解充分，把 所有溶液轉移到過濾柱CS中，12000rpm離心lmin，將收集管中的濾液加入350UL 70%乙醇， 混合均勻，這時可能會有一些白色沉淀，將溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3中，12000rpm離 心Imin，如果液體太多，可分多次離心，棄去收集管中的濾液，取70ULRDD溶液加入到IOyL DNase I儲液中輕輕用槍尖混合均勻后，然后將8〇tiL的上述DNase I工作液8〇tiL加入到吸附 柱中心位置，室溫放置15min，向吸附柱中加入350yL去蛋白液，12000rpm離心Imin棄濾液， 把吸附柱放回收集管中，加入500yLRW洗液，室溫靜置約2min，12000rpm離心Imin棄濾液，重 復上述漂洗過程一次，然后將吸附柱放回收集管中，12000rpm空離2min，將吸附柱放于一支 新的1.5mLEP管中，室溫瞭干約lOmin，再取約60yL RNase-Free ddH2〇加入吸附柱中央位 置，室溫放置約2-3min，12000rpm離心2min，濾液即HEK293-IL7克隆細胞的總RNA溶液。提取 的RNA為避免降解，應盡快放入-80 °C冰箱中保存。
[0043] 9.2兩步法反轉錄 對HEK293-IL7克隆細胞的總RNA進行反轉錄，用IL-7基因的特異引物YIL-IL7-F/R進行 PCR驗證，用核酸電泳試驗來檢測目的基因的轉錄及表達情況。本實驗采用兩步法反轉錄 HEK293-IL7細胞的總RNA，反轉錄第一步體系如下，將下列各溶液充分混合均勻后，在70°C 條件下反應5min，然后迅速冰浴3min。
[0044] Oligo(dT) 12-?8(10μΜ) 2. OyL dNTPs(IOmM) 2.OyL RNAsafe(20 X) 1.0 pL 總RNA(模板） 10.0 yL 總體系 15.0yL。
[0045] 按以下試劑配制下一步反應體系，混和均勻后，放入PCR儀中反應，42 °C反應Ih，95 °C反應5min，反應的最終產物就是所需要的IL-7基因的cDNA，可將cDNA在-80 °C冰箱中長期 保存。
[0046] 5XFirst Stand Buffer(含DTT) 5.OpL TIANScripM-MLV l.OpL 第一步RT(反轉錄)產物 15. OyL 總體系 21.0yL。
[0047] 9.3 IL-7基因 PCR擴增及檢測 弓丨物與2中所用引物相同。以上述cDNA為模板，按以下反應體系配制PCR反應液，總體積 為25tiL，反應體系如下。
[0048] DEPC水 19.5yL 10XPCR buffer 2.5yL dNTPs(IOmM) 0.5yL YIL-IL7-F(20pmol/yL) 0.5yL YIL-IL7-R(20pmol/yL) 0.5yL Taq酶（2.5U/yL) 0.5yL cDNA I.OyL 總體系 25. OyL。
[0049] 混勻后置于PCR儀中進行反應，條件為：94 °C預變性5min，94 °C變性30 s，63 °C退火 30s，72°C延伸lmin，進行35個循環，最后72°C再延伸lOmin。
[0050] 反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳來檢測，剩余的樣品-20°c保存以備用。
[0051 ] 9 · 4陽性克隆細胞株中IL-7的ELISA檢測 9.4.1標準品稀釋 (1) 向IL-7 Standard管中加入400仙雙蒸水，溶解IL-7標準品（美國Abcam公司）粉末， 配置75ng/mL標準液； (2) 取8yL上述標準液，加入到592yL的I XAssay Diluent B中，配置標準品UlOOOpg/ mL)； (3) 取200UL上述標準液1，加入到400UL的IXAssay Diluent B中，配置標準品2 (333.3pg/mL)； (4) 取200yL上述標準液2,加入到400yL的IXAssay Diluent B中，配置標準品3 (111. lpg/mL)； (5) 取200yL上述標準液3,加入到400yL的I XAssay Diluent B中，配置標準品4(37pg/ mL)； (6) 取200yL上述標準液4,加入到400yL的IXAssay Diluent B中，配置標準品5 (12.4pg/mL)； (7) 取200仙上述標準液5,加入到400仙的IXAssay Diluent B中，配置標準品6 (4.lpg/mL)〇
[0052] 9.4.2樣品的制備 將HEK293-IL7陽性克隆細胞(2G3、1A7、1B1)分別在含1%胎牛血清的DMEM培養基中進行 培養，37°C、50mL/L CO2培養箱培養2d后，分別收取細胞上清做為檢測樣品，并將樣品用含 10%新生牛血清的高糖DMEM培養基稀釋10倍。
[0053] 9.4.3檢測方法 (1) 從-20 °C冰箱中取出ELISA板及其他試劑，室溫放置約Ih，待試劑均溶化后方可開始 試驗； (2) 每孔加入IOO1IL標準品及9.4.2得到的稀釋后的樣品，室溫孵育3h(置于平板搖床 上，并將其調至最慢轉速）； (3) 甩去板中樣品，并用IXWash Buffer洗板6-7次，每孔加入洗液約300μΚ或加滿）， 每次洗完后均用衛生紙和毛巾拍干； (4) 每孔加入IOOyL IXBiotinylated IL-7 Detection Antibody，室溫孵育Ih(置于 平板搖床上，并將其調至最慢轉速）； (5) 甩去板中樣品，并用IXWash Buffer洗板6-7次，每孔加入洗液約300μΚ或加滿）， 每次洗完后均用衛生紙和毛巾拍干； (6) 每孔加入IOOyL I XHRP-Streptavidin Solution，室溫孵育45min(置于平板搖床 上，并將其調至最慢轉速）； (7) 甩去板中樣品，并用IXWash Buffer洗板6-7次，每孔加入洗液約300μΚ或加滿）， 每次洗完后均用衛生紙和毛巾拍干； (8) 每孔加入IOOyL TMB One-Step Substrate Reagen，室溫避光孵育30min(置于平板 搖床上，并將其調至最慢轉速）； (9 )向每孔中加入終止液50μ L，并以450nm讀板，分別得到IL-7標準品和樣品的0D·值， 以IL-7標準品的0D45Q值繪制標準曲線。
[0054] 9.5 SDS-PAGE電泳 配制0.5%濃縮膠和1.2%分離膠，收集9.4.2中得到的IL細胞上清樣品，經凍干后加入 IOmL PBS溶解，相當于將樣品濃縮了100倍。取12仙濃縮樣品加入3仙5 XSDS-PAGE loading buffer混勾點樣，將起始電壓設為64V，電泳約30min或待溴酸藍帶跑過分離膠界 面時，可將電壓加大到105V。電泳1.5h左右，待膠跑好后，關閉電源開關，用刀片切去多余的 膠，然后放入考馬斯亮藍中進行快速染色，用脫色液處理膠，直至條帶可顯示清楚時觀察結 果。
[0055] 凝膠的配制方法為： ①1.2%分離膠的配制方法： H2O 1.6mL 30%丙烯酰胺溶液 2.0 mL 1.5 M Tris-HCKpH 8.8) 1.3ml 10% SDS 0.05ml 10%過硫酸銨 0.05ml TEMED 0·002ml〇
[0056] ②0.5%濃縮膠的配制方法： H2O 0.68mL 30%丙烯酰胺溶液 0.17 mL I M Tris-HCKpH 6.8) 0.13ml 10% SDS 0.01ml 10%過硫酸銨 0.01ml TEMED 0.001ml〇
[0057] 9.6 Western-blot分析 先按9.5步驟對樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，用刀片小心地將凝膠切割下來， 多余的膠全部棄掉，放入轉膜緩沖液中浸泡，用裁紙機裁取適當大小的PVDF膜，然后將膜浸 泡在甲醇中30s-60s，再將其放入轉膜緩沖液中浸泡lOmin，然后將凝膠及銷酸纖維素濾膜 平鋪于半干轉儀槽中，由下至上的順序為:5層濾紙、PVDF膜、膠、5層濾紙，在鋪濾紙和膜時， 記得要將各層之間的氣泡趕出，否則影響轉膜效果，然后將半干轉儀槽插入半干轉儀中 25V，IA電轉30min。將膜取出后用2.5%脫脂奶粉室溫封閉約2h，然后向其加入1:800稀釋的 鼠單克隆抗體-IL7約8mL，4°C孵育過夜；用I 3BST將膜洗滌30min，加入1:5000稀釋山羊抗小 鼠-HRP約IOmL，室溫搖床孵育Ih，用PBST洗滌30min后進行DAB顯色。
[0058] 9.7克隆細胞株凍存 由Western-blot分析可知，三株陽性克隆細胞均能有效表達IL-7,表達量分別為 0.8ng/mL、2.4ng/mL和3.2ng/mL，挑選表達量最高的HEK293-IL7-2G3細胞進行培養和凍存。 [0059]凍存方法:凍存細胞時，先棄去培養基，然后加入ImL 0.25%胰蛋白酶消化數分鐘， 待消化充分后，將細胞瓶中的胰蛋白酶棄去，用吸管吸取IOmL完全培養基(高糖DMEM完全 培養基)將細胞從細胞瓶上吹打下來，離心后去上清，再加入適當體積的細胞凍存液(10%二 甲基亞砜、20%新生牛血清、70%DMEM培養基)吹打混勻細胞，并以1.5mL/管分裝到凍存管中， 將分裝好的細胞在4°C靜置2h后放于-80°C冰箱中過夜（約12-24h)，第2d，從冰箱中取出細 胞并長期保存在液氮中。
[0060]四、試驗結果 1、構建重組表達載體PCDNA3 · 1-IL7 將PUC57-IL7的PCR擴增產物與pcDNA3.1載體的雙酶切產物進行膠回收、連接并轉化入 BL21感受態細胞中，用質粒高提試劑盒提取質粒，并進行菌液PCR、酶切及測序鑒定，結合測 序及瓊脂糖凝膠電泳結果可知，在540bp處出現符合大小的目的基因條帶，測序結果與 Genbank中公布的序列進行對比，發現核苷酸沒有發生改變，同源性為100%，將測序并鑒定 正確的質粒命名為pcDNA3.1-IL7，結果如圖1所示。
[0061 ]其中，圖Ia為pcDNA3 · 1-IL7菌液PCR驗證;M: Ikb plusDNA分子量Marker; 1:水的 PCR產物;2-4: pcDNA3 · 1-IL7的PCR產物； 圖Ib為pcDNA3.1-IL7重組質粒酶切鑒定;M: Ikb plusDNA分子量Marker; 1-3:重組質 粒pcDNA3.1-IL7雙酶切產物。
[0062] 2、細胞G418最小致死濃度的篩選 加入不同濃度的G418培養14d發現，當G418濃度為eOOug/mL時，HEK293細胞恰好全部死 亡，所以HEK293細胞G418的最小致死量600μ g/mL。
[0063] 3、轉染細胞觀察 將pcDNA3.1-IL7與對照組pcDNA3.1-EGFP轉染HEK293細胞后，在24h就可觀察到對照組 出現綠色熒光，在48h時達到最強，說明pcDNA3.1-IL7成功轉染HEK293細胞，如圖2所示。
[0064] 由于實驗組沒辦法觀察，采用同載體加綠色熒光質粒作為對照，同期實驗，通過觀 察對照組熒光，初步判斷實驗組的轉染率，等于間接對照。
[0065] 圖2為HEK293-IL7細胞與對照組細胞綠色熒光觀察結果（100\)。其中4，(：： pcDNA3 · 1-IL7轉染組24h; B，D: pcDNA3 · 1-IL7轉染組48h;E，G: pcDNA3 · I-EGFP對照組轉染 24h;F，H: pcDNA3.1-EGFP對照組轉染48h。
[0066] 4、HEK293-IL7 細胞克隆 將HEK293-IL7細胞用含eOOug/mL的G418的高糖DMEM完全培養基稀釋，按1個細胞/孔接 種96孔板，培養2周，在第一周后每天按時觀察細胞，共發現HEK293-IL7單克隆細胞株3個， 分別命名為2G3、1A7、1B1。
[0067] 5、克隆細胞株IL-7基因的轉錄表達檢測 結果如圖3所示。克隆細胞總RNA可擴增出IL7基因片段（540bp)，說明重組IL7基因在 HEK293細胞中成功轉錄表達。
[0068] 圖3為HEK293-IL7-2G3細胞中基因的轉錄表達檢測，其中，M:100bp DNA分子質量 標準;1:克隆細胞實驗組;2:對照組;3:水。
[0069] 6、克隆細胞株 HEK293-IL7-2G3 中 IL-7 的 ELISA 檢測 將HEK293-IL7-2G3細胞在細胞瓶中培養2d后，收取細胞上清做為檢測樣品，并將樣品 用含10%新生牛血清的高糖DMEM培養基稀釋，ELI SA檢測結果如表1所示。
[0070] 表1 HEK293-IL7-2G3 細胞的 ELISA 檢測結果
ELISA檢測標準曲線及IL-7含量計算公式如圖4所示。
[0071 ]圖4為IL-7標準品的標準曲線繪制及標準曲線方程。
[0072] 7、Western_blot 分析 收集培養2d的HEK293-IL7-2G3細胞上清，經凍干后濃縮100倍，進行SDS-PAGE電泳后， 做Western-blot分析，結果如圖5所示，在25kD處出現特異性條帶。表明IL-7基因成功在 HEK293細胞中表達，表達蛋白能夠與鼠抗IL-7發生特異性結合，具有較好的反應原性。
[0073] 圖 5為IL-7蛋白的 Western-blot分析。
[0074] 8、凍存細胞的復蘇 8.1細胞復蘇 HEK293-IL7-2G3細胞在凍存前，平均活力為99%，復蘇后，細胞活力為95 · 2%。細胞凍存 前及復蘇后活力均保持較好。
[0075]復蘇的方法為： 根據細胞凍存記錄從液氮中取出HEK293-IL7-2G3細胞，然后立即投入約40°C左右溫 水中快速搖晃并解凍，將凍存管以1000 rpm離心10min后，在無菌條件下吸除細胞凍存液， 并用ImL新鮮培養基(含1%胎牛血清的DMEM培養基)重懸細胞，將其轉移至細胞瓶中，取少 許樣品，進行細胞計數，測定細胞活力。37°C/5% CO2培養箱中培養。
[0076] 8.2細胞形態觀察 HEK293-IL7-2G3細胞復蘇后貼壁良好，但生長較緩慢，一般要3d才能長滿。
[0077] 9、小結 在本次試驗中，成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-IL7，在轉染HEK293細胞后，在第 24h觀察時，細胞已出現熒光，并隨著時間的推移，熒光強度逐漸增強。經Western-blot及 ELISA方法檢測發現，IL-7蛋白為分泌性表達，在培養2dHEK293-IL7-2G3細胞上清中檢測到 IL-7的含量3.2ng/mL，表達量均較低，需進一步優化實驗條件，提高IL-7的蛋白表達量。
[0078] 最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的 保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種細胞因子IL-7的表達方法，其特征在于:步驟如下： (1) 構建 IL-7 重組質粒 pcDNA3 · 1-IL7; (2) 將重組質粒pcDNA3.1-IL7轉染HEK293細胞； (3) 將轉染后的細胞用含G418的高糖DMEM培養基繼續培養，得到陽性單克隆細胞株； (4) 將陽性單克隆細胞株進行培養，得到含有生長因子IL-7的細胞上清。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:在構建重組質粒時，在IL-7基因起始密碼 子ATG前加入一段序列GCCACC。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述構建重組質粒的具體方法為： (1) 在IL-7基因起始密碼子ATG前加入一段序列GCCACC，之后將其克隆至pUC57載體上； (2) 利用引物進行PCR擴增，所述引物為： YIL-7-F：CCGGAATTCCTCGAGGCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAGG； YIL-7-R：ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCCCCGGGTCAGTGTTCTTTAGT； (3) 將擴增產物和pcDNA3.1載體分別雙酶切和膠回收，用T4連接酶進行連接，轉化至感 受態細胞BL21，誘導表達后，得到重組質粒pcDNA3.1-IL7。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述重組質粒pcDNA3.1-IL7的核苷酸序列 為序列表中SEQ ID No.2。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中所述G418的濃度小于等于600μ g/ml〇6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4)中所述培養是在含胎牛血清的 DMEM培養基中進行培養，培養條件為37°C，50mL/L C02,培養時間為2d。
【文檔編號】C12N15/66GK106086073SQ201610508120
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】馮若飛, 馬忠仁, 徐雷, 李向茸, 張海霞, 令瑛
【申請人】西北民族大學