一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統的制作方法

一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統，屬于微生物基因工程領域。本發明的惡臭假單胞菌基因敲除系統和基因組精簡系統巧妙結合了自殺質粒敲除系統和位點特異性重組系統，大大提高了二輪篩選正確率，高達90％以上，在用于長達69個基因的基因簇的敲除時仍然表現出90％以上正確率。本發明實現基因簇的連續敲除，操作簡便，高效，正確率高，成本低。本發明為精簡優化惡臭假單胞菌基因組奠定了分子基礎，有利于實現合成生物學底盤細胞的高效構建。
【專利說明】
一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統
技術領域
[0001] 本發明涉及一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統，特別是一種基于同源 重組與特異位點重組相結合的敲除系統，屬于微生物基因工程領域。
【背景技術】
[0002] 惡臭假單胞菌是一類革蘭氏陰性菌，主要應用于生產聚羥基脂肪酸酯(PHA)，即廣 泛用于生物塑料及高附加值等醫學材料的生產。為了改善菌株本身生產特性，除了常規的 代謝工程改造外，優化其基因組勢在必行。從合成生物學角度出發，精簡優化該菌株的基因 組是優化其作為生產底盤細胞的重要手段，因此構建一套高效、快捷、準確地基因簇連續敲 除系統顯得尤為重要。
[0003] 隨著惡臭假單胞菌生理學，生物化學和遺傳學知識的積累，及惡臭假單胞菌全基 因組的測序，基因工程手段在精簡優化其基因組中地位越來越重要，也為構建優良的惡臭 假單胞菌底盤細胞奠定了基礎。從合成生物學角度出發，大范圍連續地敲除其基因組上的 非必需基因簇序列是必經之路，而利用現有的惡臭假單胞菌的傳統基因敲除方法就顯得力 不從心。目前應用廣泛的惡臭假單胞菌敲除載體為pKISmobsacB，傳統的敲除質粒構建過程 中，同源臂連接到一起，進行二輪篩選，但其由于第二輪交換回復為野生型的概率非常大， 為敲除篩選帶來很大麻煩，正確率很低，并且二輪篩選只能通過PCR驗證，造成很高的經濟 成本。這種傳統的自殺質粒敲除方法不適用于惡臭假單胞菌的基因組精簡。

【發明內容】

[0004] 本發明提供了一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統及其構建方法，通過 此敲除系統1)成功敲除惡臭假單胞菌KT2442基因 PP5288; 2)完成惡臭假單胞菌KT2442中基 因簇 PP3126-PP3142、PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397 的連續敲除。
[0005] 本發明構建的敲除系統包括：1)核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的模板質粒 PWJW101，用于擴增兩端帶有變異loxL/R位點的Gm抗性片段，作為二輪篩選的抗性標記;2) 核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID勵.3所示的表達質粒?1，102、？1，103，用于位點 特異性重組，其中，表達質粒PWJW102攜帶編碼Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因 ，Kan 抗性;表達質粒PWJW103攜帶編碼Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Gm抗性;表達質粒 PWJW102和pWJW103都是組成型表達Cre酶，強啟動子PlacM用于SacB表達，用于蔗糖平板篩 選培養來丟失質粒。
[0006] 所述模版質粒pWJWl 01的構建方法包括以下步驟：
[0007] 第一步：以PBBR1MCS-5為模板，PCR擴增得到gm基因，并在其兩端均引入Smal酶切 位點，經過酶切純化后，備用；以PDTW202質粒為模板，PCR擴增得到含有loxL/R位點的線性 pBSloxL/R質粒片段，并在兩端均引入Sma頂每切位點，經過酶切純化后，備用；
[0008] 第二步:將已經處理好的gm片段和pBSloxL/R質粒片段連接，得到PWJW101。
[0009] 所述表達質粒pWJWl 02、pWJWl 03的構建方法包括以下步驟：
[0010] 第一步：以PSH47為模板，以相應引物擴增重組酶Cre可移閱讀框，并在擴增片段的 5'和3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位點，Cre片段經過EcoRI和Xbal酶切純化后備用；以質粒 pDXW-3為模板，以相應引物擴增帶有強啟動子的PlacM-sacB片段，片段5'和3'末端分別引 入Xbal和SacI限制性內切酶切點，酶切純化后備用；
[0011] 第二步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經過EcoRI和Xba頂每切純化的質粒 pBBRlMCS-2 連接，得到 pWJW102;
[0012] 第三步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經過EcoRI和Xba頂每切純化的質粒 pBBRlMCS-5 連接，得到 pWJW103。
[0013]本發明還提供一種應用上述敲除系統敲除惡臭假單胞菌KT2442的基因或基因簇 的方法，如附圖4和附圖5所示，分別以惡臭假單胞菌自殺質粒為例進行說明。兩者所闡述的 基因敲除和基因簇敲除方法包括以下步驟：
[0014] 1)敲除質粒的構建，根據需要敲除的基因或基因簇的序列設計其同源臂，長度一 般為lOOObp左右，將同源臂擴增后酶切回收，同時擴增帶有loxL/R的抗性標記基因，將上游 同源臂，抗性標記基因，下游同源臂依次連接于惡臭假單胞菌自殺質粒上，構成敲除質粒；
[0015] 2)敲除質粒的第一輪交換，制備惡臭假單胞菌感受態，將1)中敲除質粒電轉入感 受態中，復蘇涂布后，對長出的轉化子進行蔗糖抗性篩選，有蔗糖致死的為一輪交換正確轉 化子；
[0016] 3)敲除第二輪交換，將一輪交換正確轉化子挑入Kan抗性LB培養基中培養12h，再 轉接無抗LB培養基培養12h，即可稀釋100倍涂布具有同源臂中間連接的抗性標記的抗性的 蔗糖平板，培養20h;對長出的單菌落進行抗性驗證，即無出發自殺質粒自身抗性的轉化子 為第二輪敲除正確轉化子，并進一步通過PCR驗證確定1-2個轉化子即可；
[0017] 4)去除抗性標記，將第二輪敲除正確轉化子制備成電轉感受態，電轉入表達質粒 PWJW102或pWJW103，在表達質粒相應的抗性平板培養20h，對長出的單菌落進行抗性驗證， 無二輪交換抗性的單菌落為正確轉化子，并進一步通過PCR驗證確定1-2個轉化子即可；
[0018] 5)表達質粒的去除，將抗性標記去除成功的菌落挑入LB培養基中培養12h，稀釋 100倍涂布于含有15g/100mL的蔗糖平板上培養20h，對所長出的單菌落進行抗性驗證，無 表達質粒抗性的單菌落為最終正確突變株，進一步PCR驗證確定1-2個轉化子即可。
[0019] 在本發明的一種實施方式中，所述自殺質粒可以是pK18mobsacB或pZJD29c。
[0020] 本發明所要解決的另一個技術問題是應用所構建的基因敲除系統和基因組精簡 系統 1)敲除 KT2442 中 PP5288; 2)KT2442 的基因簇 PP3126-PP3142，PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397的連續敲除，即KT2442的基因組精簡。利用pWJWlOl和pK18mobsacB構建了PP5288的 敲除載體PWJW201，敲除了 KT2442中的PP5288;利用pDTW202和？2邛29(：分別構建了基因簇 PP3126-PP3142、PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397 的敲除載體 pWJW202、pWJW203 和 pWJW204， 敲除了〇2442中的基因簇？？3126-??3142、？？1277-??1290和？？4329-??4397;獲得菌株 KT2442 Δ PP5288 和 KT2442 ΔΡΡ3126-ΡΡ3142;并完成 KT2442 中基因簇 PP3126-PP3142、 PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的連續敲除，獲得菌株KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-ΡΡ1290ΔΡΡ4329-ΡΡ4397。
[0021] 本發明很好地解決了傳統敲除方法的弊端，首先構建了一種基于自殺質粒同源重 組與特異位點重組相結合的敲除系統。自殺質粒同源重組主要是依賴于敲除質粒與目標基 因組存在一定相同的同源DNA序列，經過同源區的配對產生一輪交換，完成敲除質粒重組到 基因組的過程;再經過二輪篩選，不僅用蔗糖復篩，同時用同源臂中間引入的抗性篩選來獲 得正確敲除突變株，避免了傳統的二輪交換中回復野生的重組，大大提高了正確突變的概 率。通過自殺質粒同源重組，我們在抗性標記兩側引入loxL/R位點，利用Cre/lox特異重組 系統去除抗性標記。
[0022]用于惡臭假單胞菌傳統的敲除方法在第二輪交換中回復野生概率極大，突變株篩 選正確率很低，且只能通過PCR驗證突變基因型。本發明構建的敲除系統同時利用自殺質粒 同源重組及帶有變異loxL/R位點的位點特異性重組，結合兩者優勢克服傳統自殺質粒敲除 系統的缺陷，可用于惡臭假單胞菌的基因敲除和基因組精簡;敲除過程首先通過自殺質粒 同源重組到基因組上，然后通過蔗糖負篩和抗性標記篩選出被刪除目的基因的轉化子，該 步較傳統方法的正確率大大提高，再通過位點特異重組去除基因組上抗性基因，操作簡便 高效;可用于同一菌株中多個基因簇連續敲除;敲除完成后被改造菌株不攜帶任何抗性。適 用于有序精簡惡臭假單胞菌的基因組。本發明在第二輪交換中尤其體現了很高的篩選優 勢，正確率極高，通過菌落抗性驗證即可初步篩選突變基因型，大大降低了成本。此外，本發 明敲除系統也可以實現基因簇的連續高效敲除，隨著目的基因簇的增長，其正確率仍然很 高，并維持在90%以上，從而很好地實現惡臭假單胞菌KT2442的基因組精簡。
【附圖說明】
[0023]圖1模板質粒pWJWlOl的物理圖譜。
[0024] 圖2表達載體pWJW102和pWJW103的物理圖譜，分別為圖2a和圖2b所示。
[0025]圖 3??5288，？？3126-??3142，？？1277-??1290和？？4329-??4397的敲除質粒 pWJW201，pWJW202，pWJW203 和 pWJW204 的物理圖譜，分別為圖 3a，3b，3c 和 3d。
[0026] 圖4以pK18mobsacB為自殺質粒的基因敲除過程示意圖。
[0027]圖5以pZJD29c為自殺質粒的基因簇敲除過程示意圖。
[0028]圖6實施例2-4中第二輪交換平板抗性驗證圖。
[0029] 圖7基因型驗證圖；a，實施例2-5中，采用本發明基因敲除和基因簇敲除系統的敲 除轉化子PCR驗證;圖b，對照實施例2中采用pK18mobsacB傳統敲除方法敲除轉化子PCR驗證 圖。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1模板質粒pWJWlOl及表達質粒PWJW102和PWJW103的構建
[0031 ] (1)用于擴增兩端有同向的loxL/R位點的Gm抗性片段的模板質粒pWJWlOl的構建： 第一步：以pBBRlMCS-5(Kovach，M.E.et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes .Gene 166，175-176( 1995) ·)為模板，以gm-F/gm-R引物對作為模板，PCR擴增得 到gm基因，并在其兩端均引入Smal酶切位點，經過酶切純化后，備用；以pDTW202(Hu J， TanY，LiY，Hu X, Xu D,ffang X. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.Plasmid，2013，70 (3):303-313)質粒為模板，以？851 〇認4和？851〇以-1?引物作為模板，？0財廣增得到含有 loxL/R位點的線性pBSloxL/R質粒片段，并在兩端均引入Smal酶切位點，經過酶切純化后， 備用。
[0032] 第二步:將已經處理好的gm片段和pBSloxL/R質粒片段連接，轉化JM109,新質粒命 名為 PWJW101。
[0033]用于基因或基因簇敲除的gm盒模板擴增的引物gm-F/gm-R位于重組位點外側，擴 增產物兩端帶有變異10XL/R位點的Gm抗性片段，稱為gm盒，便于后續的位點特異重組。 [0034] (2)Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB表達載體pWJW102和pWJW103的構建方法，兩質 粒分別為Km抗性和Gm抗性，分別用于去除敲除質粒二輪交換的Gm抗性標記和Km抗性標記。 [0035] 表達載體pWJW102和pWJW103的構建步驟如下：
[0036]第一步：以pSH47(Guldener U，Heck S，Fielder T，et al ·A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res，1996， 24( 13) :2519-2524)為模板，以引物cre-F/cre-R擴增重組酶Cre可移閱讀框，并在擴增片段 的5'和3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位點，Cre片段經過EcoRI和Xbal酶切純化后備用；以質 |ipDXff-3(Tan Y,Xu D,LiY,ffang X.Construction of a novel sacB-based system for marker-free gene deletion in Corynebacterium glutamicum.Plasmid,2012,67(1): 44-52)為模板，以PlacM-sacB-F/sacB-R擴增帶有強啟動子的PlacM-sacB片段，片段5'和3' 末端分別引入Xbal和SacI限制性內切酶切點，酶切純化后備用。
[0037] 第二步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經過EcoRI和Xba頂每切純化的質粒 pBBRlMCS-2(Kovach,Μ.E.et al.Four new derivatives ofthe broad-host-range cloning vector pBBRIMCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene 166,175-176(1995) ·)連接，轉化JM109,新質粒定名為pWJW102〇
[0038] 第三步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經過EcoRI和Xba頂每切純化的質粒 pBBRlMCS-5連接，轉化JM109,新質粒定名為pWJW103。
[0039] Cre/lox重組系統發現于P1噬菌體，包括重組酶和重組位點兩部分，其中，Cre是隸 屬于AInt酶超基因家族的重組酶，可以接到重組位點間的基因序列被刪除或重組；loxp位 點是可供Cre重組酶識別作用的重組位點，當兩個loxp位點位于一條DNA鏈上并且方向相同 時，Cre重組酶能切除兩個loxp位點間的序列。loxL/loxR為突變loxp位點，兩個重組位點經 過Cre酶重組后，產生一個不能再被Cre重組酶識別的位點loxL/R，該位點不再參與位點重 組。
[0040] 該實施例中所需引物序列如下表1所示。
[0041] 表1本實施例涉及的引物序列
[0042]
[0043] 實施例2惡臭假單胞菌KT2442中PP5288的敲除 [0044] 1.敲除質粒PWJW201的獲得
[0045]以惡臭假單胞菌P.putidaKT2442基因組為模板，分別以相應引物擴增得到PP5288 基因的上游片段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分別引入EcoRI和Xbal，在下游片段 的5'和3'端分別引入BamHI和Hindm酶切位點。以pWJWlOl作為模板，以引物
[0046] gm-lox-Xbal(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG,
[0047] gm-l〇x-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG，
[0048] 擴增兩端含有loxL/R位點的gm盒，在5'和3'末端分別引入Xbal和BamHI酶切位點。 將PP5288上游片段經過EcoRI和Xbal酶切純化，下游片段經過BamHI和Hindlll酶切純化，gm 盒片段經過Xbal和BamM酶切純化，pK18mobsacB經過EcoRI和Hindlll酶切純化，四個片段 連接，轉化JM109，新的質粒即為PP5288敲除質粒，命名為pWJW201 (如附圖2a);自殺質粒 pK18mobsacB可用于多種微生物基因的敲除，為Kan抗性，帶有鹿糖果聚糖酶表達基因 sacB， 可降解蔗糖從而抑制細胞分裂，可用于蔗糖負篩選。
[0049] 2.敲除感受態的制備及電轉化
[0050] 接種惡臭假單胞菌02442菌于1^液體培養基中，30°(：，200印111過夜培養。按2%接 種量轉接50mL LB液體培養基，30°C，200rpm培養至0D6QQ = 0.7時，將培養液冰浴半小時后轉 入預冷的50mL離心管中，4°C，8000rpm離心10min收集菌體，沉淀用預冷的10%甘油洗滌3 次，最后用〇.5mL 10%甘油懸浮，每管80yL分裝至預冷的無菌EP管中。
[0051 ] 將1000_5000ng敲除質粒pWJW201加入感受態細胞中，混勻，冰浴15min，1.5kv電擊 5ms，30°C，200rpm孵育lh，涂布30yg/mL卡那霉素的LB固體平板，30°C培養20h;
[0052] 3.敲除流程
[0053] (1)一輪交換
[0054]挑取電轉轉化子于含30yg/mL卡那霉素及15g/100mL蔗糖的LB固體上劃線培養 20h，篩選菌周圍有粘液化透明物質分泌的轉化子，并PCR驗證確認第一輪交換成功單菌落。 [0055] (2)二輪交換
[0056] 選取驗證正確的單菌落，即pWJW201質粒通過同源臂重組與染色體交換使得整個 質粒整合到P. putidaKT2442的染色體上，接種于含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，30 °C培養約12h，轉接至LB液體培養基中，30 °C培養12h，稀釋100倍后涂布于含30yg/mL慶大霉 素和15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養約20h;對所長出的單菌落進行Km抗性驗證，即 劃取50個單菌落在Km固體平板上培養20h，不生長的單菌落即為正確敲除轉化子，僅有5個 轉化子生長，正確率達到90%，抗性驗證平板見附圖6a所示，進一步PCR驗證2個正確單菌 落，即P · putidaKT2442 Δ PP5288-gm。
[0057] (3)抗性標記去除
[0058]將PCR驗證正確的單菌落接種含30yg/mL慶大霉素的LB液體培養基中，制備感受 態，轉入PWJW102質粒，涂布于含30yg/mL卡那霉素的LB固體培養基上培養20h，挑取單菌落 驗證其抗性，無 Gm抗性并PCR驗證正確的轉化子，即P. putidaKT2442 Δ PP5288/pWJW102。 [0059] 4.pWJW102 的去除
[0060] 將上一步驗證正確的P.putidaKT2442 Δ PP5288/pWJW102單菌落挑取至LB液體培 養基中過夜培養，涂布含有15g/100mL蔗糖的固體平板，30 °C培養20h，對單菌落進行Km抗性 驗證，即將單菌落劃線卡那霉素的固體平板，30°C培養20h，不生長且進一步PCR驗證正確的 菌落即為敲除成功的無抗目的菌株，即P.putidaKT2442 Δ PP5288。
[0061 ] 表2基因 PP5288敲除的PCR驗證引物
[0062]
[0063] 結果如圖7a基因型驗證圖：
[0064] Lane 1:PP5288U-F/PP5288D-R 引物驗證 P.putidaKT2442APP5288-gm 基因型的 PCR圖，結果正確；
[0065] Lane 2:PP5288U-F/PP5288D-R引物驗證？411衍(^10'2442八？？5288無抗突變株基 因型的PCR圖，結果正確；
[0066] Lane 3、4:PP5288-in-test-F/PP5288-in-test-R引物驗證P.putidaKT2442 Δ PP5288無抗突變株基因型的PCR圖，結果正確；
[0067] Lane 5:PP5288-in-test-F/PP5288-in_test-R引物驗證P.putida KT2442野生菌 基因型的PCR圖。
[0068] 對照實施例2惡臭假單胞菌KT2442中PP5288的敲除
[0069] 1 ·敲除質粒 pK18mobsacB_PP5288 的獲得
[0070]以P.putidaKT2442基因組為模板，分別以相應引物擴增得到PP5288基因的上游片 段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分別引入EcoRI和Xbal，在下游片段的5'和3'端分 別引入Xbal和Hindlll酶切位點。將PP5288上游片段經過EcoRI和Xba頂每切純化，下游片段 經過Xbal和Hindin酶切純化，pK18mobsacB經過EcoRI和Hindin酶切純化，三個片段連 接，轉化JM109,新的質粒即為PP5288敲除質粒，命名為pK18mobsacB-PP5288。
[0071] 2.敲除感受態的制備及電轉化
[0072]同實施例2;
[0073] 3.敲除流程
[0074] (1)一輪交換
[0075] 同實施例2;
[0076] (2)二輪交換
[0077] 選取驗證正確的單菌落，即pK18mobsacB_PP5288質粒通過同源臂重組與染色體交 換使得整個質粒整合到P.putidaKT2442的染色體上，接種于含30yg/mL卡那霉素的LB液體 培養基中，30 °C培養約12h，轉接至無抗LB液體培養基中，30 °C培養12h，稀釋100倍后涂布于 含15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養約20h;對所長出的單菌落進行PCR驗證，驗證50 個單菌落，全部為回復野生型，無正確突變型。
[0078] 表3 PP5288傳統方法敲除的PCR驗證引物
[0079]
[0080] 轉化子PCR驗證結果均如同圖7b基因型驗證圖：
[0081 ] Lane 1-14: PP5288U-F/PP5288D-R 引物驗證采用pK18mobsacB 傳統敲除方法篩選 的轉化子PP5288基因型的部分PCR圖，結果全部為野生型大小。
[0082] 實施例3惡臭假單胞菌KT2442中基因簇PP3126-PP3142的敲除 [0083] 1.敲除質粒PWJW202的獲得
[0084] 以P.putidaKT2442基因組為模板，以相應引物擴增得到PP3126-PP3142基因簇的 上游片段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分別引入SacI和Xbal，在下游片段的5'和 3'端分別引入BamHI和Sac頂每切位點。以pDTW202作為模板，以引物
[0085] kan-lox_XbaI(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG，
[0086] Kan-lox-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG,
[0087] 擴增兩端含有loxL/R位點的kan盒，在5'和3'末端分別引入Xbal和Bamm酶切位 點。將PP3126-PP3142基因簇的上游片段經過SacI和Xba頂每切純化，下游片段經過BamHI和 SacI酶切純化，kan盒片段經過Xbal和BamHI酶切純化，pZJD29c(Yano T, Sanders C， Catalano J,Daldal F.sacB-5-Fluoroorotic acid-pyrE-based bidirectional selection for integration of unmarked alleles into the chromosome of Rhodobacter capsulatus.Appl Environ Microbiol.2005Jun;71(6): 3014-24.)經過 SacI酶切純化，四個片段連接，轉化JM109,新的質粒即為PP3126-PP3142敲除質粒，命名為 pWJW202(如附圖213)。？2邛29〇質粒為Gm抗性，也帶有sacB基因，我們發現該質粒在惡臭假單 胞菌中也是不能復制的，可以用于基因敲除或基因組精簡。
[0088] 2.敲除感受態制備及電轉
[0089]同實施例2,僅將電轉質粒換成pWJW202;
[0090] 3.敲除流程 [0091] (1)-輪交換
[0092]同實施例2;
[0093] (2)二輪交換
[0094] 選取驗證正確的單菌落，即pWJW202質粒通過同源臂重組與染色體交換使得整個 質粒整合到P. putidaKT2442的染色體上，接種于含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，30 °C培養12h，轉接LB試管培養12h，稀釋100倍后涂布于含30yg/mL卡那霉素和15g/100mL蔗糖 的LB固體平板，30°C培養約20h;對所長出的單菌落進行Gm抗性驗證，即劃取50個單菌落在 Gm固體平板上培養20h，不生長的單菌落即為正確敲除轉化子，僅4個轉化子生長，正確率達 到92%，如附圖6b所示，進一步PCR驗證2個單菌落，正確，即P.putida ΚΤ2442ΔΡΡ3126-PP3142-kan〇
[0095] (3)抗性標記去除
[0096]將PCR驗證正確的單菌落接種含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，制備感受 態，轉入PWJW103質粒，于含30yg/mL慶大霉素的LB固體培養基上培養20h，挑取單菌落驗證 其抗性，無 Km抗性并PCR驗證正確的轉化子，即P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142/ pffJW103〇
[0097] 4.pWJW103 的去除
[0098] 將上一步驗證正確的P.putida KT2442APP3126_PP3142/pWJW103單菌落挑取至 LB液體培養基中過夜培養，涂布含有15g/100mL蔗糖的固體平板，30 °C培養20h，對單菌落進 行Gm抗性驗證，即將單菌落劃線慶大霉素的固體平板，30°C培養20h，不生長且進一步PCR驗 證正確的菌落即為敲除成功的無抗突變株，即P.putidaKT2442APP3126-PP3142。
[0099] 表4基因簇PP3126-PP3142敲除的PCR驗證引物
[0100]
[0101] 結果如圖7a基因型驗證圖：
[0102] Lane 6 :PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R 引物驗證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142-kan基因型的PCR圖，結果正確；
[0103] Lane 7 :PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R引物驗證P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142無抗突變株基因型的PCR圖，結果正確；
[0104] Lane 8、9:PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物驗證 P. putida KT2442 Δ PP3126-PP3142無抗突變株基因型的PCR圖，結果正確；
[0105] Lane 10:PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物驗證 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR圖。
[0106] 實施例4惡臭假單胞菌KT2442 Δ PP3126-PP3142中基因簇PP1277-PP1290的敲除 [0107] 1.敲除質粒PWJW203的獲得
[0108] 同實施例3;僅PP1277-PP1290基因簇上游同源臂的酶切位點換作SacI和BamHI，下 游同源臂的酶切位點換作Xba I和Sac I，中間帶有1 〇xL/R位點的kan盒兩端酶切位點換作 BamHI和質粒如附圖3c。
[0109] 2.敲除感受態制備及電轉
[0110] 同實施例2,僅將電轉質粒換成PWJW203。
[0111] 3.敲除流程
[0112] 同實施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290: : loxL-kan-loxR命名為 KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290-kan;同樣挑取50個單菌落，驗證其抗性，5個單 菌落生長，正確率為90%，如附圖6c所示。
[0113] 4.pWJW103 的去除
[0114] 同實施例 3,〇2442&??3126-??3142&??1277-??1290:1(?171?命名為1〇'2442厶 PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290。
[0115] 表5基因簇PP1277-PP1290敲除的PCR驗證引物
[0116]
[0117] 結果如圖7a基因型驗證圖：
[0118] Lane ll:PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R引物驗證P.putida KT2442APP3126-PP3142APP1277-PP1290-kan基因型的PCR圖，結果正確；
[0119] Lane 12: PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R 引物驗證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290無抗突變株基因型的PCR圖，結果正確；
[0120] Lane 13、14:PP1277-PP1290-in-test-F/PP1277-PP1290-in-test-R 引物驗證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290無抗突變株基因型的PCR圖，結果正 確；
[0121] Lane 15:??1277-?卩1290-111-七68卜卩/??1277-??1290-111-七68七-1?引物驗證 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR圖。
[0122] 實施例5惡臭假單胞菌KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290中基因簇 PP4329-PP4397 的敲除
[0123] 1.敲除質粒pWJW204的獲得
[0124] 同實施例質粒如附圖3d。
[0125] 2.敲除感受態制備及電轉
[0126] 同實施例2,僅將電轉質粒換成pWJW204。
[0127] 3.敲除流程
[0128] 同實施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397: : loxL-kan-loxR命名為KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397-kan;同樣挑 取50個單菌落，驗證其抗性，4個單菌落生長，其正確率達到92 %，如附圖6d所示。
[0129] 4pWJW103 的去除
[0130] 同實施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397: : loxL/R 命名為KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397。
[0131] 表6基因簇PP4329-PP4397敲除的PCR驗證引物
[0132]
[0133] 結果如圖7a基因型驗證圖：
[0134] Lane 16 : PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物驗證P · putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397-kan基因型的PCR圖，結果正 確；
[0135] Lane 17 : PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物驗證P · putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397無抗突變株基因型的PCR圖，結 果正確；
[0136] Lane 18、19:PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R 引物驗證 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397無抗突變株基因型 的PCR圖，結果正確；
[0137] Lane 20:PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R引物驗證 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR圖。
[0138] 雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統，其特征在于，包括：1)核苷酸序列如 SEQIDN0.1所示的模板質粒pWJW101;2)核苷酸序列分別如SEQIDN0.2、SEQIDN0.3所 示的表達質粒口1，102、?1，103;其中，表達質粒?1，102攜帶編碼〇6重組酶和蔗糖果聚糖 酶SacB的基因，Kan抗性;表達質粒pWJW103攜帶編碼Cre重組酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基 因，Gm抗性。2. -種構建權利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統的方法，其特 征在于， 模板質粒PWJW101的構建方法包括以下步驟： 第一步：以PBBR1MCS-5為模板，PCR擴增得到gm基因，并在其兩端均引入Smal酶切位點， 經過酶切純化后，備用；以PDTW202質粒為模板，PCR擴增得到含有loxL/R位點的線性 pBSloxL/R質粒片段，并在兩端均引入Sma頂每切位點，經過酶切純化后，備用； 第二步:將已經處理好的gm片段和pBSloxL/R質粒片段連接，得到pWJWlOl; 所述表達質粒PWJW102、pWJW103的構建方法包括以下步驟： 第一步：以PSH47為模板，以相應引物擴增重組酶Cre可移閱讀框，并在擴增片段的5'和 3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位點，Cre片段經過EcoRI和Xbal酶切純化后備用；以質粒 pDXW-3為模板，以相應引物擴增帶有強啟動子的PlacM-sacB片段，片段5'和3'末端分別引 入Xbal和SacI限制性內切酶切點，酶切純化后備用； 第二步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經過EcoRI和Xbal酶切純化的質粒 pBBRlMCS-2 連接，得到 pWJW102; 第三步：酶切純化的片段Cre和PlacM-sacB與經過EcoRI和Xbal酶切純化的質粒 pBBRlMCS-5 連接，得到 pWJW103。3. -種應用權利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統敲除惡臭假單 胞菌的基因或基因簇的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 敲除質粒的構建，根據需要敲除的基因或基因簇的序列設計其同源臂，長度一般為 lOOObp左右，將同源臂擴增后酶切回收，同時擴增帶有loxL/R的抗性標記基因，將上游同源 臂，抗性標記基因，下游同源臂依次連接于惡臭假單胞菌自殺質粒上，構成敲除質粒； 2) 敲除質粒的第一輪交換，制備惡臭假單胞菌感受態，將1)中敲除質粒電轉入感受態 中，復蘇涂布后，對長出的轉化子進行蔗糖抗性篩選，有蔗糖致死的為一輪交換正確轉化 子； 3) 敲除第二輪交換，將一輪交換正確轉化子挑入Kan抗性LB培養基中培養12h，再轉接 無抗LB培養基培養12h，即可稀釋100倍涂布具有同源臂中間連接的抗性標記的抗性的蔗糖 平板，培養20h;對長出的單菌落進行抗性驗證，即無出發自殺質粒自身抗性的轉化子為第 二輪敲除正確轉化子，并進一步通過PCR驗證確定1-2個轉化子即可； 4) 去除抗性標記，將第二輪敲除正確轉化子制備成電轉感受態，電轉入表達質粒 PWJW102或pWJW103，在表達質粒相應的抗性平板培養20h，對長出的單菌落進行抗性驗證， 無二輪交換抗性的單菌落為正確轉化子，并進一步通過PCR驗證確定1-2個轉化子即可； 5) 表達質粒的去除，將抗性標記去除成功的菌落挑入LB培養基中培養12h，稀釋100倍 涂布于含有15g/ 100mL的鹿糖平板上培養20h，對所長出的單菌落進行抗性驗證，無表達質 粒抗性的單菌落為最終正確突變株，進一步PCR驗證確定1-2個轉化子即可。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述自殺質粒是pK18mobsacB或pZJD29c。5. -種應用權利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統敲除惡臭假單 胞菌KT2442的PP5288基因的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以自殺質粒pK18mobsacB為出發質粒，連接PP5288的同源臂和pWJWlOl中的gm盒，轉 化E.coli JM109,構建PP5288敲除質粒； (2) 將（1)中PP5288敲除質粒從E. col i JM109中提取，電轉化惡臭假單胞菌KT2442菌 株，涂布于含有卡那霉素的固體恢復培養基，30 °C培養約20小時； (3) 挑取平板上單菌落，即一輪轉化子，進行PCR驗證，選取驗證正確的單菌落，進行蔗 糖平板劃線培養，有明顯透明粘液的菌為正確的轉化子； (4) 挑取上述(3)中驗證正確的一輪轉化子，接到Kan抗性的LB培養基中，30 °C培養12小 時，轉接LB無抗試管培養12h，稀釋100倍，涂布Gm抗性的LB固體平板； (5) 挑取平板上單菌落進行PCR驗證，選取驗證正確的單菌落； (6) 將(5)所得菌株接種于LB液體培養基，30 °C過夜培養，并制備正確單菌落的電轉感 受態； (7) 從E. co 1 i JM109中提取pWJWl02，電轉入上述感受態中，30 °C培養約20小時，PCR驗 證轉化子，選取驗證正確的單菌落； (8) 挑取平板上正確的單菌落入LB液體培養基，30 °C培養約12小時，稀釋100倍涂布含 15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養約20小時； (9) 挑取(8)中單菌落，畫格子驗證是否有Kan抗性，無 Kan抗性的單菌落，再經過PCR驗 證，選取正確的單菌落，即為敲除無抗突變株。6. -種應用權利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統敲除惡臭假單 胞菌基因簇的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以自殺質粒pZJD29c為出發質粒，連接目的基因簇的同源臂和kan盒，轉化 E.coliJM109,構建敲除質粒； (2) 將（1)中敲除質粒從E.coli JM109中提取，電轉化要敲除的惡臭假單胞菌，涂布于 含有卡那霉素的固體恢復培養基，30°C培養約20小時； (3) 挑取平板上單菌落，即一輪轉化子，進行PCR驗證，選取驗證正確的單菌落，進行蔗 糖平板劃線培養，有明顯透明粘液的菌正確； (4) 挑取上述(3)中驗證正確的一輪轉化子，接到Kan抗性的LB培養基中，30 °C培養12小 時，轉接LB無抗試管培養12h，稀釋100倍，涂布Kan抗性的LB固體平板； (5) 挑取平板上單菌落進行PCR驗證，選取驗證正確的單菌落； (6) 將上步所示菌株接種于液體培養基，30°C過夜培養，并制備正確單菌落的電轉感受 態； (7) 從E. co 1 i JM109中提取pWJWl03，電轉入上述感受態中，30 °C培養約20小時，PCR驗 證轉化子，選取驗證正確的單菌落； (8) 挑取平板上正確的單菌落入LB液體培養基，30 °C培養約12小時，稀釋100倍涂布含 15g/100mL蔗糖的LB固體平板，30°C培養約20小時； (9) 挑取(8)中單菌落，畫格子驗證是否有Kan抗性，無 Kan抗性的單菌落，再經過PCR，選 取正確的單菌落，即為敲除無抗突變株。7. 權利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統在惡臭假單胞菌的基因 敲除中的應用。8. 權利要求1所述的惡臭假單胞菌基因敲除和基因組精簡系統在惡臭假單胞菌的基因 組精簡中的應用。
【文檔編號】C12N15/78GK106086056SQ201610415109
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610415109.0, CN 106086056 A, CN 106086056A, CN 201610415109, CN-A-106086056, CN106086056 A, CN106086056A, CN201610415109, CN201610415109.0
【發明人】王小元, 王建莉, 馬文漸, 林琳, 王雨舟, 王甜憶, 黃舒婷, 王雨倩, 張怡平, 孫康康, 李燁
【申請人】江南大學