一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法
【專利摘要】本發明涉及微生物基因工程領域中的基因敲除技術，特別涉及一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，（a）構建適用于幽門螺桿菌的敲除模板質粒和輔助質粒；（b）設計目的基因同源重組雙交換同源臂，在敲除模板質粒基礎上構建目的基因敲除質粒，轉入幽門螺桿菌中得到基因敲除突變株；（c）將輔助質粒轉入上步驟得到的基因敲除突變株中，去除抗性基因，得到攜帶輔助質粒的無痕基因敲除突變株；（d）輔助質粒通過無抗生素傳代培養消除，最終獲得無痕基因敲除突變株。本發明，實現了幽門螺桿菌中無痕基因敲除突變株的構建，相比普通的基因敲除，該方法在實現目的基因敲除的同時不引入外源基因，使對目的基因的功能分析更為準確。
【專利說明】
一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法
技術領域
[0001]本發明涉及微生物基因工程領域中的基因敲除技術，特別涉及一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法。
【背景技術】
[0002]幽門螺桿菌(/fe2ico/7acier pylori,H.是感染胃部的最常見的病原性細菌，幽門螺桿菌感染是慢性胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍等胃腸道疾病發生的重要病因，并與胃癌、胃粘膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發生密切相關。幽門螺桿菌的全世界感染率為50%-80%，高發地區集中在東亞，包括中國、日本和韓國。我國是胃癌發病率和病死率較高的地區，每年全球新發100余萬胃癌患者中，我國占42%，約80萬死亡胃癌患者中，我國占35%，發病率和病死率均超過世界平均水平兩倍多。目前一般認為，幽門螺桿菌通過黏附定植于胃黏膜，釋放毒力因子，與宿主細胞相互作用產生一系列炎癥反應，最終導致慢性炎癥、潰瘍、癌癥等臨床結果。多種致病因子參于了幽門螺桿菌的致病過程，對致病因子的深入研究大大促進了我們對幽門螺桿菌致病機制的了解。然而迄今為止，幽門螺桿菌的致病機理仍不完全明確，而幽門螺桿菌感染導致的多樣化感染結局更不清楚。一些潛在的致病因子或功能基因仍有待于進一步發掘來不斷完善對幽門螺桿菌致病機制的認識。
[0003]基因操作是研究基因功能最直接和最有效的技術手段，經過多年技術積累，幽門螺桿菌的基因操作技術得到深入發展。轉座子插入突變技術被應用在幽門螺桿菌致病因子的早期研究中。由于轉座子插入突變具有隨機性和極性效應的劣勢，逐漸被基于同源重組的基因敲除方法所取代。幽門螺桿菌中大量致病因子的功能借助同源重組基因敲除的方法得以闡明。
【發明內容】
[0004]本發明構建了一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，與普通的同源重組基因敲除方法相比，在實現目的基因敲除的同時不引入外源基因，使得對目的基因的功能分析更為準確。
[0005]本發明一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，包括如下步驟:
(a)構建適用于幽門螺桿菌的帶有FRT位點的卡那霉素抗性敲除模板質粒和表達FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質粒；
(b)設計目的基因同源重組雙交換同源臂，在敲除模板質粒基礎上構建目的基因敲除質粒，轉入幽門螺桿菌中得到帶有FRT位點和卡那霉素抗性的基因敲除突變株；
(C)將表達FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質粒轉入上步驟得到的基因敲除突變株中，去除FRT位點之間的卡那霉素抗性基因，得到攜帶輔助質粒的無痕基因敲除突變株；
(d)輔助質粒通過無抗生素傳代培養消除，最終獲得無痕基因敲除突變株。
[0006]本發明，實現了幽門螺桿菌中無痕基因敲除突變株的構建，相比普通的基因敲除，該方法在實現目的基因敲除的同時不引入外源基因，使對目的基因的功能分析更為準確。此方法不僅可以用于幽門螺桿菌的基因敲除，而且可以用于適用此基因敲除原理的其它微生物基因敲除的構建。
【附圖說明】
[0007]圖l:pTSKHP 質粒圖；
圖2:pCHFHP質粒圖；
圖3:pTSKHP-0788 質粒圖；
圖4: 無痕基因敲除步驟。
【具體實施方式】
[0008]實施例一
一般性說明
PCR反應使用的DNA聚合酶是北京全式金生物技術有限公司的高保真PfuDNA聚合酶。質粒構建過程中酶切連接使用的各種限制性內切酶為F ermentas公司產品，T 4DNA連接酶使用的是Takala公司產品。用于連接產物轉化的大腸桿菌DH5a感受態購自北京全式金生物技術有限公司。細菌基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。
[0009]結合圖1至圖4，做如下具體說明:
1、在幽門螺桿菌中構建FLP-FRT重組系統原件
(I)包含FRT位點的同源重組雙交換敲除模板質粒的構建
在實驗室構建的同源重組雙交換敲除模板質粒PSJHK的基礎上，構建包含FRT位點的敲除模板質粒。以 PKD3 為模板，以 FRT-1 (CTTAGAGCTCATCAAGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG )和FRT-2( CGGAGGTACCGAATTAGCCATGGTCCATATG)為引物擴增包含FRT的基因片段，得到的基因片段經SacI和KpnI酶切后連入實驗室構建的同源重組雙交換敲除模板質粒pSJHK中，得到pSJHK-FRT。利用引物BssHI 1-KmF(CTAGCTGCGCGCTGCCGCAAGCACTCA)和BssHI1-KmR(GCCTTCGCGCGCGATACCCCTCGAATTGA)以pSJHK為模板擴增卡那霉素抗性基因(apW)，經BssHII酶切后重新連入pSJHK-FRT質粒中，得到包含FRT位點的同源重組雙交換敲除模板質粒pTSKHP。圖1顯示質粒pSJHK-FRT的模式圖，在卡那霉素抗性基因的兩端分別有一個FRT位點，再向外是兩組多克隆位點，用于連入同源重組雙交換的同源臂。
[0010](2)幽門螺桿菌中FLP重組酶表達質粒的構建
利用在Cj i opAaga hutch in son i i中表達F LP重組酶的質粒p CHF為模板構建用于幽門螺桿菌中FLP重組酶的表達質粒pCHFHP。以幽門螺桿菌中的內源質粒pHel I作為復制起始子，以pHel1-1(CTTGATGAGCTCGAAGCTTGTCCGTTAG)和pHel1-2(CGTCTTGGTCGACTAGAAAGGGAAATG)為引物擴增PHell質粒序列，得到的擴增片段經SacI和Sail酶切后連入到質粒pCHF上的相應位點，構建質粒pCHF-p。氯霉素抗性基因(ca t-GO 以cm_l (TCCGATGTCGACCCGGTTTTTGTTAATCC)和cm-2(CACCAGGCATGCGTAACTCCTTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC)為引物，以質粒PTnMax9為模板擴增，得到的擴增片段經SalI和SphI酶切后連入到質粒pCHF-p上的相應位點，構建質粒pCHFHP，如圖2所示。
[0011]2、利用FLP-FRT重組系統實現幽門螺桿菌中基因無痕敲除以基因例說明利用FLP-FRT重組系統實現幽門螺桿菌中基因無痕敲除的步驟(圖 4)。
[0012]如07斯含有1500個核苷酸，有研究報道發現如07斯對于K pWori在胃中的定植是不可缺少的，生物信息學分析預測A/707貓編碼一個外膜蛋白(HP0788，499個氨基酸)。對于這個外膜蛋白的功能研究目前還不清楚，推測它可能作為一個粘附因子，類似于其他已知的粘附因子(AlpAB，BabA，HopZ)在77.pj^ori的定植中發揮粘附作用；也可能作為一個表面蛋白，在菌體與胃黏液相互作用中起到穩定細胞外膜、保護菌體的作用。
[0013]本研究中獲得的基因敲除突變株為深入研究基因功能提供了前提，而該基因功能的闡明有助于進一步分析K的致病機制，同時可能作為疫苗開發的潛在靶位點。
[0014](I)同源重組雙交換敲除質粒pTSKHP-0788的構建
根據基因上下游核苷酸序列及引物設計原則設計并合成如下引物:
0788-1:GAACGGTGGATCCGAACAGGCGTAAAGAAATCG；
0788-2:TAAGCCAGGTACCTCATAAAGGTTTCGGTAGG；
0788-3:TAGACGGTCGACCCGCCACCGATCAAGACA；
0788-4:GGACTGGAGCTCTATTAACCAAAGCCACAAAGAC；
以幽門螺桿菌基因組DNA為模板，利用上述引物0788-1/0788-2進行PCR擴增，得到0.8kbp的核苷酸片段作為同源重組的上游同源臂(Hl)，經BamHI和KpnI酶切后連入pTSKHP中；下游同源臂(H2)是以引物0788-3/0788-4進行PCR擴增得到的1.1 kbp的核苷酸片段，經SalI和SacI酶切后再連入該質粒中。由此構建hp0788的同源重組雙交換敲除質粒pTSKHP-0788，如圖3所示。
[0015](2)敲除質粒電擊轉化幽門螺桿菌
制備幽門螺桿菌電擊轉化感受態，將敲除質粒pTSKHP-0788通過電擊轉化的方法轉入到幽門螺桿菌中，電擊后的感受態細胞先涂布于無抗生素的空腸彎曲菌血瓊脂上復蘇，然后利用15 yg/ml卡那霉素篩選陽性轉化子。
[0016]設計同源重組驗證引物testl/kt2，kt3/test4。如圖3所示，testl位于同源臂擴增弓丨物0788-1的5’端，test4位于同源臂擴增引物0788-4的3’端，kt2和kt3位于卡那霉素抗性基因內部。以轉化子基因組為模板分別利用驗證引物testl/kt2和kt3/test4進行基因擴增，野生型基因組為模板作為對照。若以轉化子基因組為模板分別能夠擴增出理論大小的PCR產物，而以野生型基因組為模板無法擴增出理論大小的PCR產物，則證明上、下游同源臂均發生同源重組。此時基因區域被卡那霉素抗性基因取代，在抗生素基因的兩端分別有FRT位點。
[0017](3)輔助質粒電擊轉化卡那霉素抗性陽性突變株
取上步驟中的陽性敲除株制備電擊轉化感受態，將輔助質粒pCHFHP通過電擊轉化的方法轉入到突變株中，同理，電擊后的感受態細胞先涂布于無抗生素的空腸彎曲菌血瓊脂上復蘇，然后利用10yg/ml氯霉素篩選陽性轉化子。
[0018]經過10-15天的培養，挑取轉化子菌落，提取基因組，利用PCR驗證FRT位點之間序列是否被剪切，引物使用testl和test4。未轉化輔助質粒的突變株基因組作為對照，若氯霉素陽性突變株擴增出的基因片段較卡那霉素突變株擴增出的基因片段小卡那霉素抗性基因的大小，說明FRT位點之間的核苷酸序列被剪切。
[0019](4)輔助質粒的消除
取上步驟中的陽性敲除株在無抗生素的血瓊脂平板上培養，傳代3次后挑取菌落同時轉接無抗生素血平板，氯霉素血平板和卡那霉素血平板，菌落僅能在無抗生素血平板上生長，而不能在氯霉素血平板和卡那霉素血平板上生長說明菌株丟失輔助質粒。該菌株即為如無痕基因敲除突變株。
【主權項】
1.一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，包括以下步驟: (a)構建適用于幽門螺桿菌的帶有FRT位點的卡那霉素抗性敲除模板質粒和表達FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質粒； (b)設計目的基因同源重組雙交換同源臂，在敲除模板質粒基礎上構建目的基因敲除質粒，轉入幽門螺桿菌中得到帶有FRT位點和卡那霉素抗性的基因敲除突變株； (c)將表達FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質粒轉入上步驟得到的基因敲除突變株中，去除FRT位點之間的卡那霉素抗性基因，得到攜帶輔助質粒的無痕基因敲除突變株； (d)輔助質粒通過無抗生素傳代培養消除，最終獲得無痕基因敲除突變株。
【文檔編號】C12N15/74GK106086054SQ201610458378
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】季曉飛, 趙慧琳, 李波清, 張瑩, 王穎
【申請人】濱州醫學院