脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應用，該脯氨酸特異性蛋白酶基因具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。將該脯氨酸特異性蛋白酶基因導入到黑曲霉中表達，其表達量比內源基因(SEQ ID NO.1)表達量顯著提高。本發明的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因經密碼子優化后合成兩段人工基因，分別構建的表達盒導入到黑曲霉中進行表達，能夠顯著提高其在黑曲霉中的表達量。
【專利說明】
脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及提高脯氨酸特異性蛋白酶在黑曲霉表達的兩段核 酸序列，具體涉及一種經密碼子優化的脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 脯氨酸特異性蛋白酶是一種能特異性地水解肽鏈中脯氨酸羧基端肽鍵的蛋白酶， 屬于絲氨酸蛋白酶家族。其活性中心由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的催化三聯體組成。由于 其獨特的水解特性，使得脯氨酸特異性蛋白酶被用于食品，釀造，烘焙等領域。如CN 101511211A公開了一種包含脯氨酸特異性蛋白酶的涂抹醬;CN 101490235A公開了釀造啤 酒時加入脯氨酸特異性蛋白酶以降低或消除啤酒冷渾濁的方法;W02005117595A1公開了烘 焙面包時添加脯氨酸特異性蛋白酶以改善性質的方法。迄今為止，絕大部分的脯氨酸特異 性蛋白酶都是從絲狀真菌發現的，如專利CN 101294153B，CN 103602605A，CN 103589741A 分別描述了來源于黑曲霉，米曲霉和煙曲霉的脯氨酸特異性蛋白酶。但是，上述專利中描述 的表達宿主都是畢赤酵母，由于脯氨酸特異性蛋白酶主要用于食品等領域，而畢赤酵母在 表達蛋白時，需要以甲醇為碳源進行誘導表達，具有潛在的安全隱患，因此使用畢赤酵母生 產食品添加劑并不是優選的。絲狀真菌作為細胞工廠生產有價值的產品（如酶）為人們熟 知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于'通常認為安全的'（Generally Recognized As Safe， GRAS)的特征而被廣泛用于表達宿主，因此工業上更加青睞黑曲霉和米曲霉用于生產脯氨 酸特異性蛋白酶。如專利CN 102046784B描述了利用黑曲霉表達來源于產黃青霉 (Penicillium chrysogenum)的脯氨酸特異性蛋白酶。
[0003] 在工業生產中，追求微生物最大化表達量蛋白質或酶的意義重大，可以顯著降低 生產成本，并減少能源消耗和環境污染。一般情況下，可以通過傳統菌種誘變方法提高微生 物表達量，也可以通過基因工程手段提高：如利用強啟動子，多拷貝基因，合適的信號肽等； 其中密碼子優化也是提高表達量一種方法，如CN 101294153B，CN 103602605A，CN 103589741A分別描述了將黑曲霉，米曲霉和煙曲霉的脯氨酸特異性蛋白酶基因經密碼子優 化后，可以提高在畢赤酵母的表達水平。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種經密碼子優化的脯氨酸特異性蛋白酶基因。
[0005] 本發明人發現對于黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，經密碼子優化后，構建的表 達盒導入到黑曲霉中進行表達，能夠顯著提高其在黑曲霉中的表達量。
[0006] 本發明的目的可以通過以下技術方案實現：
[0007] 高表達的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，具有如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所 示的核苷酸序列。
[0008] 編碼野生型黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 上述黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因密碼子優化后核酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示，他們編碼相同的氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示。
[0009] 兩段人工合成基因 （SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3)，他們編碼黑曲霉脯氨酸特異性 蛋白酶，導入到黑曲霉中表達，其表達量比野生型基因 （SEQ ID NO.1)表達量至少提高5%， 優選提高10 %，優選高20 %，更優選高40 %。
[0010] 包含所述黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因的表達盒、重組表達載體、重組菌、轉基 因細胞系。
[0011] 為了構建脯氨酸特異性蛋白酶表達盒，需要特定的啟動子，終止子，及調控序列： 如5 ' UTR，3 ' UTR等;上述元件的選擇和連接方式可通過參考本領域公開技術獲得。
[0012] 啟動子可以是黑曲霉內源啟動子:如黑曲霉糖化酶啟動子，中性淀粉酶啟動子，酸 性淀粉酶啟動子，α_葡萄糖苷酶啟動子等;也可以是外源啟動子:如米曲霉中性淀粉酶啟動 子，米根酶糖化酶啟動子;也可以是啟動子變體:如黑曲霉中性淀粉酶變體。變體是指在野 生型序列基礎上通過插入、缺失或突變等方式對野生型序列中的核酸進行改變后的序列。
[0013] 與啟動子3'末端連接的可以是調控序列：如合適的前導序列（5'UTR)，即對于宿主 細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區，如米曲霉中性淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶前導序 列；
[0014] 優選的終止子選自如下酶的基因的終止子:黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、黑 曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋 白酶。
[0015] 任一段人工基因，在與啟動子，終止子相連接后形成表達盒。通過常規方法導入到 黑曲霉基因組中，可以隨機插入到基因組中，也可以定點整合到某個或多個基因座上。可選 的基因座有gla(糖化酶），amya(中性淀粉酶），amyb(中性淀粉酶），aa(酸性淀粉酶），agda(a 葡萄糖苷酶），agdb(a葡萄糖苷酶）。
[0016] 所述表達盒優選地可以與一個或多個選擇性標記連接，其允許簡單選擇經轉化、 轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗 性、對營養缺陷型的原養性(prototrophy to auxotrophs)等。用于絲狀真菌宿主細胞的選 擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶）、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶）、bar(草銨膦 phosphinothricin)乙酰轉移酶）、hyg(潮霉素磷酸轉移酶）、niaD(硝酸還原酶）（nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷_5'_磷酸脫駿酶）（orotidine_5'-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶）和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶（anthrani late synthase)以及它們的等同物。優選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉（Aspergillus ]11(1111&118)或米曲霉的&111(13和115^〇
[0017] 所述表達盒優選地可以與一個或多個反向選擇標記（負選擇標記)連接。用于絲狀 真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫 羧酶），hsvTK(單純皰疹病毒胸苷激酶）。
[0018] 所述的重組表達載體為將上述的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因插入表達載體 得到的。
[0019] 所述的重組菌為將上述的重組表達載體導入宿主菌如黑曲霉或米曲霉中得到的。
[0020] 上述的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因在提高脯氨酸特異性蛋白酶表達量中的 應用。
[0021] 上述的表達盒、重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系在提高脯氨酸特異性蛋白酶 表達量中的應用。
[0022] -種制備脯氨酸特異性蛋白酶的方法，將上述的轉基因重組菌發酵培養得到脯氨 酸特異性蛋白酶。
[0023]本發明中將DNA片段導入到宿主菌如黑曲霉或米曲霉內的方法為本領域常規方 法。
[0024]本發明的有益效果：
[0025] 本發明人發現，對于黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，經密碼子優化后合成兩段 人工基因，分別構建的表達盒導入到黑曲霉中進行表達，能夠顯著提高其在黑曲霉中的表 達量。
【附圖說明】
[0026] 圖1 pHphtk質粒圖譜
[0027] 圖2 pGla-PepWT質粒圖譜
[0028] 圖3 pGla-PepOPTl質粒圖譜
[0029] 圖4 pGla_Pep0PT2質粒圖譜
【具體實施方式】
[0030] 實施例lpHphtk質粒的構建
[0031 ]該質粒包含以下3部分，由GenScript公司構建完成，質粒圖譜見圖1。
[0032] (1 )pUC57質粒Xbal-Pcil雙酶切后得到的2305bp片段；
[0033] (2)hph基因表達盒，序列見SEQ ID N0.5;
[0034] (3)HSV-tk表達盒，序列見SEQ ID N0.6。
[0035] 實施例2 整合質粒 pGla-PepWT, pGla-PepOPTl 和 pGla_Pep0PT2 的構建
[0036] 將脯氨酸特異性蛋白酶表達盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以進行表達，使用糖化 酶啟動子和糖化酶終止子。分別構建pGla-PepWT，pGla-P印0PT1和pGla-Pep0PT2,可以使野 生型脯氨酸特異性蛋白酶序列PepWT(SEQ ID NO. 1)和人工合成經密碼子優化的序列 Pep0PTl(SEQIDN0·2)以及Pep0PT2(SEQIDN0·3)置換黑曲霉糖化酶基因。P印WT(SEQID N0.1)、Pep0PTl(SEQIDN0.2)和Pep0PT2(SEQIDN0.3)由南京金斯瑞生物科技公司合成。 整合質粒構建方法如下:將pHphtk質粒通過vector-F與vector-R引物進行線性化；以黑曲 霉(來自于中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC2462)基因組為模板，通過ΟΙα-δ ' -F 和 Gla-PepWT-5 ' -R ，Gla-PepWT-3 ' -F 和 Gla-3 ' -R 分別擴增糖化酶基 因側翼5 ' 和3 ' 序 列，每個片段長2000bp。利用P印WT-F和PepWT-R擴增野生型脯氨酸特異性蛋白酶序列PepWT (SEQ ID NO. 1)。將上述線性化的pHphtk載體、糖化酶基因側翼5'片段、3'片段和PepWT片段 通過GibsonAss.e.mbly?Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)進行重組，得到整合 質粒pGla-P印WT，經測序確認序列，質粒圖譜見圖2。以黑曲霉CICC2462基因組為模板，通過 Gla-5'-F 和 Gla-Pep0PTl-5'-R，Gla-Pep0PTl-3'-F 和 Gla-3'-R 分別擴增糖化酶基因側翼 5' 和3'序列，每個片段長2000bp。利用Pep0PTl-F和Pep0PTl-R擴增Pep0PTl(SEQIDN0·2)。將 上述線性化的pHphtk載體、糖化酶基因側翼5'片段、3'片段和PepOPTl片段通過Gibson As$.em.bly?Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)進行重組，得到整合質粒pGla-卩6?0?11，經測序確認序列，質粒圖譜見圖3。以黑曲霉(：1〇：2462基因組為模板，通過61 &-5'-F 和 Gla-PepOPT2-5 ' -R，Gla-PepOPT2-3 ' -F 和 Gla-3 ' -R 分別擴增糖化酶基因側翼5 ' 和3 ' 序 列，每個片段長2000bp。利用PepOPT2-F和PepOPT2-R擴增PepOPT2 (SEQ ID NO. 3)。將上述線 性化的pHphtk載體、糖化酶基因側翼5'片段、3'片段和PepOPT2片段通過GibsonAssembly? Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)進行重組，得到整合質粒pGla_PepOPT2,經 測序確認序列，質粒圖譜見圖4。糖化酶基因5'端側翼2kb DNA序列見SEQ ID NO. 7,其3'端 側翼2kb DNA序列見SEQ ID N0.8。
[0037] 相關引物序列如下：
[0038]
[0040] 實施例3PepWT，Pep0PTl和Pep0PT2整合到糖化酶基因座
[00411本實施例出發菌株為AND4L，是由CICC2462菌株經敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基 因和酸性淀粉酶基因后獲得的。黑曲霉基因敲除/敲入方法可參考專利CN 103937766A或CN 104962594A實施例中公開的技術方法實現。本實施例中PepWT，Pep0PTl和P印0PT2整合到糖 化酶基因座中與CN 10496 2 594A實施例使用相同方法實現，即參照Delmas(Appl EnvironMicrobiol. 2014,80(11): 3484-7)等人描述的方法。具體地，利用環狀DNA載體，包 含有agdB5'及3'側翼序列，選擇標記，反向選擇標記(或稱為負向選擇標記），以及大腸桿菌 復制序列。將環狀載體轉入到黑曲霉中，通過正向選擇獲得重組菌株，再經過反向選擇標記 獲得基因敲除/敲入菌株。
[0042] 采用原生質體轉化法將pGla-PepWT，pGla_PepOPTl和pGla_Pep0PT2分別導入，具 體操作步驟如下：
[0043] 原生質體的制備:在營養豐富的TZ液體培養基（牛肉膏粉0.8%;酵母浸膏0.2%; 蛋白胨0.5% ;NaCl 0.2% ;蔗糖3% ;pH5.8)中培養黑曲霉菌絲體。通過mira-cloth (Calbiochem公司）從培養液中過濾菌絲體并用0.7M NaCl(pH5.8)洗滌，菌絲體濾干后轉移 至含纖維素酶1 % (Sigma)、蝸牛酶1 % (Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2%的酶解液(pH5.8)中， 30°C，65rpm酶解3h。然后將含有原生質體的酶解液置于冰上并用四層擦鏡紙過濾，得到的 濾液經3000印111， 8〇代&4°(：離心101^11后，棄上清；附著在管壁上的原生質體用31'(：溶液（11 D-Sorbitol、50mM CaCl2、10mM Tris，pH7.5)洗滌一次，最后把原生質體重懸于適量的STC 溶液中。
[0044] 分別將環狀 pGla-PepWT，pGla-PepOPTl 和 pGla-Pep0PT2 質粒 10μ1 (濃度為：100ng/ μL)加入到1〇〇μ1原生質體懸浮液中混勻后室溫放置25min;然后分3次共加入900μ1 PEG溶 液，混勾后室溫放置25min; 3000rpm，常溫離心10min，棄上清，原生質體附著于管壁上，將其 重懸于lml STC溶液中。把該懸浮液與預先降溫至45°C左右的TB3培養基(酵母浸膏0.3%、 酸水解酪蛋白0.3%、蔗糖20%、瓊脂0.7%)混合并鋪平板;待平板凝固后放入34 °C培養箱 中培養;24h后在平板上再鋪一層含300ngAU潮霉素(Hygromycin)的TB3固體培養基(瓊脂 1%，其余成分同上），繼續將平板置于34 °C培養箱中培養4-5天后，長出上層培養基的轉化 子稱為整合轉化子。隨機挑取幾個整合轉化子分別傳代于含300ngAU潮霉素的TB3固體培 養基上，34°C恒溫培養3天后，收集菌絲體用液氮冷凍后研磨粉碎，然后用真菌基因組提取 試劑盒(杭州博日科技有限公司）提取整合轉化子基因組DNA，最后對整合轉化子基因組DNA 進行 PCR 鑒定，鑒定引物為 Pep_5test_F 與 物經測序后確認整合到糖化酶基因座。
[0045] 相關引物序列如下：
[0046]
[0047] 將確認的陽性轉化子挑取適量碎菌絲放于含lml無菌水的離心管中，渦旋振蕩使 之形成菌絲懸液，取1〇〇μ1涂布于含1〇μΜ 5-F2dU(5_氟-2-脫氧尿嘧啶核苷，廠家:Sigma)的 TB3固體平板上，34°C恒溫培養4-5天，即有敲除轉化子長出。轉化子在10μΜ 5-F2dU平板上 傳兩代（防止轉化子不純）后，在300ngAU潮霉素平板上應不能生長;然后對敲除轉化子基 因組DNA進行PCR鑒定，引物序列及基因組提取方法同上。使用Pep-5test-F和Pep-3test-R 進行PCR鑒定，陽性轉化子產物應為5.8kb，而陰性轉化子為6.3kb。陽性轉化子經PCR產物測 序后確認，從而得到AND4L-P印WT，AND4L-P印0PT1和AND4L-P印0PT2菌株。
[0048] 實施例 4AND4L-PepWT，AND4L-PepOPTl 和 AND4L-Pep0PT2 菌株搖瓶發酵
[0049] 將實施例3中獲得的AND4L-PepWT，AND4L-PepOPTl和AND4L-Pep0PT2菌株分別接種 至含50ml YPM培養基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，2 %的麥芽糖）的搖瓶中，34°C，220rpm 培養六天，取上清進行活力測定。稱取〇.〇171g Z-Gly-Pr〇-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨 酸-硝基苯胺，百靈威生物科技有限公司），加入4ml二惡烷溶解，加入6mlPH4.0檸檬酸-磷酸 氫二鈉緩沖溶液溶解，使得Z-Gly-Pro-pNA濃度為4mM，在lml 100mM梓檬酸-磷酸氫二鈉 (pH 5.0)中，加入0.25ml上述底物，在37°C預熱3min，加入0. lml酶液，立即計時反應lOmin后，立 即加入碳酸鈉溶液3ml，在410nm下測定樣品吸光度，即可計算酶活力。活力定義為ρΗ5·0 37 °〇條件下每分鐘從Z-Gly-Pro-pNA釋放ΙμΜ pNA所用的酶量為一個酶活力單位，以U表示。搖 瓶相對活力如表1所示，AND4L-PepOPTl和AND4L-PepOPT2菌種都表現出較高活力。
[0050] 表 1 AND4L-PepWT，AND4L-PepOPT 1 和 AND4L-Pep0PT2菌株活力對比
[0051]
[0052] 本發明通過對黑曲霉特異性蛋白酶基因序列進行密碼子優化，獲得兩條人工合成 序列，組成的表達盒轉入到黑曲霉中，都表現出了更高的發酵活力。
【主權項】
1. 一種高表達的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列。2. 包含權利要求1所述黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因的表達盒、重組表達載體、重組 菌、轉基因細胞系。3. 根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于為將權利要求1所述的黑曲霉脯氨 酸特異性蛋白酶基因插入表達載體得到的。4. 根據權利要求2所述的重組菌，其特征在于為將所述的重組表達載體導入宿主菌中 得到的。5. 根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述的宿主菌選自黑曲霉或米曲霉。6. 權利要求1中所述的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因在提高脯氨酸特異性蛋白酶表 達量中的應用。7. 權利要求2所述的表達盒、重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系在提高脯氨酸特異 性蛋白酶表達量中的應用。8. -種制備脯氨酸特異性蛋白酶的方法，其特征在于將權利要求2中所述的重組菌發 酵培養得到脯氨酸特異性蛋白酶。
【文檔編號】C12R1/685GK106086049SQ201610628459
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月3日 公開號201610628459.5, CN 106086049 A, CN 106086049A, CN 201610628459, CN-A-106086049, CN106086049 A, CN106086049A, CN201610628459, CN201610628459.5
【發明人】白挨璽, 張垠, 卞芙蓉, 王彩梅, 孫艷, 徐紅
【申請人】南京百斯杰生物工程有限公司