水稻苗期葉片白化性狀基因Oscaac1及其應用

水稻苗期葉片白化性狀基因Oscaac1及其應用
【專利摘要】本發明公開了水稻苗期葉片白化性狀基因Oscaac1及其應用，屬于水稻育種領域。本發明從一個苗期第一、第二片葉白化性狀突變體中圖位克隆了突變基因Oscaac1，其基因組序列如SEQ ID NO.4所示；其野生型基因編碼一個葉綠體被膜ATP/ADP轉運蛋白。將Oscaac1基因導入到水稻保持系、不育系中，培育具有苗期白化葉片性狀的三系和/或兩系不育系；當制種獲得的雜交F1代進行幼苗期鑒定時，出現白化葉片的植株為不育系自交的假雜種。本發明公開的Oscaac1基因在水稻育種的雜交F1代雜種純度鑒定和不育系自交繁殖保種純度鑒定工作中具有應用前景，對提高種子純度、減少雜交水稻生產風險具有重要的意義。
【專利說明】
水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaacl及其應用
技術領域
[0001]本發明屬于水稻育種領域，具體涉及水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaacl及其應 用。
【背景技術】
[0002] 高等植物葉綠體基因組一般編碼大約100個蛋白質，而葉綠體中含有的蛋白質至 少超過2000個。因此，絕大多數的葉綠體蛋白是由核基因編碼的，在細胞質中翻譯后運輸到 葉綠體中(Abdallah et al. ,2000)。質體基因的轉錄是由兩類RNA聚合酶來完成的，即質體 編碼的RNA聚合酶(PEP)和核基因編碼的RNA聚合酶(NEP)(Maliga，1988 ;Hajdukiewiczet al.，1997;Hedtke et al. ,1997)。這兩種RNA聚合酶各自負責不同類別的葉綠體基因的轉 錄(Allison et al.，1996;Hajdukiewicz et al.，1997)，如與光合作用密切相關的基因是 由PEP轉錄，而持家基因則由NEP轉錄。但是，少數葉綠體基因如atpB可以被PEP和NEP同時轉 錄。核基因和質體基因的協同表達是葉綠體發育所必需的。
[0003] 葉色復綠(Virescent)突變體是指葉片發育早期葉綠素含量降低，到成熟時期葉 片葉綠素含量幾乎恢復正常的一類突變體(Archer and Bonnett, 1987)。與其它葉色突變 體不同，這類突變是非致死的，純合突變體個體能夠存活和結實，是研究葉綠體發育的良好 材料。目前只有少數的水稻virescent突變體的基因被鑒定，它們的功能尚未完全闡明。
[0004] 水稻在我國糧食生產中占有極其重要的地位。據聯合國糧農組織統計，近四十年 來，我國水稻歷年播種面積均為4.7億畝，最高為5.4億畝，占糧食作物播種面積的2.15% ; 稻谷產量平均為10419.7萬噸，最高為17825萬噸占糧食產量的43.7%。水稻生產關系到國 計民生，在糧食生產中舉足輕重。
[0005] 目前，我國雜交水稻面積占水稻生產面積的50%左右，其技術體系以三系法和兩 系法并存，仍以三系法雜交水稻為主。伴隨雜交水稻的大面積推廣，在生產實踐中，雜交稻 仍面臨親本繁殖和制種兩大環節中純度保持技術上的困難，這是限制一些強優組合生產應 用的主要障礙。雜交稻科種子真偽不易辨認，種子純度鑒定困難等造成的真假雜種不易識 另IJ、雜種純度不易保證的問題十分突出，給農民造成重大損失的事件時有發生。為此，廣大 育種工作者在培育優質高產雜交稻的同時，也在謀求解決雜交稻種子和親本的純度鑒定和 真假種子識別的辦法。隨著生物科學技術的不斷發展，同工酶法、DNA指紋技術在真假雜種 識別上已獲成功，但這些分子生物學手段技術含量高，需要精密儀器設備，投入大，花費昂 貴，一般種子生產和銷售單位難以掌握和應用于實際。因此，需要一種簡便可靠的辦法來解 決雜交稻親繁和制種的純度檢測問題。
[0006] 水稻形態標記性狀在真假雜種識別上具有直觀、可靠、簡便易行等優點，已為一些 育種工作者所采用。水稻形態標記性狀有多種，主要性狀如穗色、穗形、著粒密度、籽粒顏 色、芒的有無等;細微性狀如種子的大小、形狀(長寬比）、程尖色、浮毛長短、柱頭外露遺跡 等;特有性狀如紅色或紫紅色的穎殼和米粒以及香味等;易變性狀如株高、穗長、分蘗力、開 花抽穗期、生育期、葉片長短、葉色深淺等。水稻葉色標記性狀屬于特有性狀，常見的有紫 葉、紅葉、淡綠葉、黃葉、斑馬葉、白化轉綠葉等。
[0007]在葉色標記性狀用于雜交水稻育種研究上，中國水稻研究所董鳳高等（1994)通過 連續回交將隱性的淡綠葉形態標記導入光、溫敏不育系，以期解決由于秈型光、溫敏核不育 系育性不穩而導致的雜交水稻制種純度難以保證的問題。曹立勇等（1999)將隱性紫葉形態 標記性狀回交轉入溫敏不育系育成中紫S。浙江大學核農所應用核輻射技術培育出帶葉色 標記雜交水稻不育系全龍A等。葉榮國（1999)篩選出了周緣白化，黃白葉片的不育系。牟同 敏等（1995)選育出了紫葉標記光溫敏互作不育系，并對紫葉性狀的遺傳特性進行了分析。 南京紅太陽種業有限公司和安徽肥東良種繁育總場成功應用輻射及化學誘變技術，選育出 幼苗葉片帶隱性白化標記的水稻兩系、三系不育系及其具有推廣價值的新品種（系），其中 新組合"紅優Γ是使用白化標記不育系廬86A與恢復系166配組而成，已在生產上示范推廣。 [0008] 參考文獻：
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【發明內容】

[0034]本發明的目的在于提供一種控制水稻苗期葉片白化性狀的新基因 Oscaacl及其應 用。
[0035] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0036] 一種水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaacl，為ATP/ADP carrier基因（文中將該基 因命名為OsCAACl基因）的突變基因。所述的ATP/ADP carrier基因編碼的蛋白質的氨基酸 序列如SEQ ID N0.3所示，該蛋白質屬于線粒體轉運蛋白質家族;ATP/ADP carrier基因的 基因組序列如SEQIDN0.1所示，編碼核苷酸（cDNA)序列如SEQIDN0.2所示。所述的突變 基因指在ATP/ADP carrier基因的編碼核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核 苷酸而生成的等位基因。
[0037]優選的，所述的水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaacl的基因組序列如SEQ ID N0.4 所示。
[0038]本發明的水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaacl是從一個水稻苗期白葉突變體 caacl mutant中發現的，突變體caacl mutant的表型為苗期第一葉和第二葉白化，且為隱 性突變。本發明利用圖位克隆的方法將Oscaacl基因初步定位在第6號染色體長臂介于 RM6298和RM7434兩個標記之間，進一步設計SSR標記將其精確定位在80kb的區段。對該區段 內的基因進行測序，初步將一個ATP/ADP carrier基因定位為OsCAACl的候選基因。構建能 表達該候選基因的互補載體，通過農桿菌將互補載體轉入突變體caacl mutant后，其幼苗 第一葉和第二葉均表現為正常的綠色，由此確認了突變體caacl mutant第一葉和第二葉白 化現象是由OsCAACl基因的缺失造成的。這些結果表明Oscaacl基因能控制水稻葉片葉綠體 早期發育。
[0039] 因此，基于Oscaacl基因產物調控水稻葉綠體發育，從而產生苗期葉片白化的標記 性狀，其具有在雜交水稻F1代雜種純度鑒定和/或不育系自交種子純度鑒定方面的應用。
[0040] 本發明還同時提供了一種雜交育種去除假雜種的方法，該方法包括如下步驟:將 Oscaacl突變體植株與水稻保持系、不育系材料雜交、回交，進而將Oscaacl基因導入到水稻 保持系、不育系中，培育具有苗期白化葉片性狀的三系和/或兩系不育系；當制種獲得的雜 交?:代進行幼苗期鑒定時，出現葉片表型為白化葉片的植株為不育系自交的假雜種，應作 去除處理，從而實現去除假雜種的目的。
[0041] 備注說明：因為突變體的表型為第一葉和第二葉白化，且為隱性突變，所以雜合子 和野生型一樣，為正常表型。將突變體基因導入水稻保持系和不育系，因為是突變體，外在 表型是第一葉和第二葉白化。而雜交稻為雜合子，表型正常。
[0042]本發明的雜交育種去除假雜種的方法適應于三系、兩系法雜交育種的所有水稻品 種。
[0043]本發明的有益效果是：本發明提供的控制水稻苗期葉片白化性狀的新基因 Oscaacl在水稻育種的雜交F1代雜種純度鑒定和不育系自交繁殖保種純度鑒定工作中具有 應用前景，其對提高種子純度、減少雜交水稻生產風險具有重要的意義。
【附圖說明】
[0044]圖1是水稻苗期白葉突變體caacl mutant與幼苗在二葉期與三葉期的植株葉色表 型圖。突變體caacl mutant和9311幼苗在二葉期與三葉期的植株葉色比較：突變體caacl mutant在二葉期的葉片表現出白化特征，而9311的葉片為正常的綠色；在三葉期，突變體 caacl mutant的第三片葉子恢復正常，和9311的第三片葉一樣為綠色。
[0045]圖2是OsCAACl基因在水稻第6染色體上的定位示意圖。利用突變體caacl mutant 和RPY粳雜交后代的?2群體中的突變重組植株，根據數據庫中的SSR標記，將OsCAACl基因初 步定位在第6號染色體上RM6298和RM7424這兩個標記的區間內。在此區間內自行開發出P1、 P2、P3、P4和P5這幾個新的SSR標記，進行精細定位，將OsCAACl基因定位在一段80kb范圍的 區間內，該區間內有13個基因，分別測序驗證后發現，第五個基因發生了堿基缺失造成移碼 突變，因此作為OsCAACl基因的候選基因。
[0046]圖3是pBWA(V)H-〇sCAACl載體圖譜。該載體為轉基因互補材料的轉化載體，將正常 的OsCAACl基因序列導入突變體caacl mutant中。
[0047]圖4是功能互補實驗1^代轉基因水稻的表型圖；caacl為突變體，1-3為轉入互補載 體pBWAW^-OsCAACU^Ti代植株。從互補1\代陽性材料中隨機選取三個株系，其幼苗第一葉 和第二葉均表現為正常的綠色，由此可以確認白葉現象是由OsCAACl基因的缺失造成的。
【具體實施方式】
[0048]下面結合實施例對本發明做進一步的描述，應理解，這些實施實例僅僅是說明性 的、而不用于限制本發明的范圍。
[0049] 實施例1 Oscaacl基因的定位 [0050] 1、材料與方法
[00511 水稻苗期白葉突變體caacl mutant(該突變體又命名為水稻斑點突變體caacl，保 存于湖北省農業科學院糧食作物研究所的湖北省農作物種質資源中期庫（保存號 HB216002,日期2016年5月20日）來自于珍汕97/成恢178雜交后代，其表型如圖1所示。與 9311相比，突變體caacl mutant幼苗在二葉期的葉片表現出白化特征，而9311的葉片為正 常的綠色;在三葉期，突變體caacl mutant的第三片葉子恢復為正常，和9311的三葉一樣為 綠色。
[0052]培養方法及條件:水稻種子經鹽水選種后，放置于培養皿中，37°C黑暗條件下浸種 2天至露白，然后將種子均勻的鋪在培養盆的泥土上，在光溫可控水稻培養箱中生長至二葉 期。培養箱的具體條件為:溫度控制：白天28°C，夜晚24°C ;光照時間：7 :00-20:00 ;光照強 度：100μηιο1 · m-2 · s-、
[0053] 2、遺傳分析和定位群體
[0054] caacl mutant突變體作為母本和RPY粳、MP3、培矮64S、CPSL017分別作為父本雜 交，Fi自交，F2水稻按上述條件培養，二葉期時統計正常綠葉幼苗和白葉突變體幼苗的數目， 并用統計學方法計算分離比例。實驗結果如表1所示，這些雜交組合^植株具有正常的葉色 表型，F 2植株中的正常綠苗和白化突變體的分離比符合孟德爾單基因隱性突變的分離比， 說明Oscaacl為單隱性基因。
[0055] 表1.不同雜交組合F2植株幼苗表型株數
[0056]
[0057] F2定位群體是由caac 1 mutant突變體(秈稻）和粳稻品種(RPY粳）雜交獲得，總共 鑒定出1430個葉色突變表型的F2個體，單株取葉片，用來提取基因組DNA。
[0058] 3、通過SSR(Simple Sequence Repeat，簡單重復序列）標記定位Oscaacl基因
[0059] 采用CTAB法提取水稻葉片的基因組DNA。取大約0.2g水稻幼嫩葉片，經組織研磨機 破碎，提取總DNA，獲得的DNA溶解于50yL無菌水中。每個SSR反應用lyL DNA樣品。
[0000]在Oscaac 1基因的初步定位試驗中，對44個F2個體進行SSR分析。根據公布的粳稻 和秈稻創建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物（SSR標記包括 RM583、RM5497、RM4355、RM13678、RM14795、RM5488、RM16589、RM1359、RM17954、RM18926、 RM4332、RM494、RM21161、RM1306、RM22761、RM23409、RM23759、RM5786、RM25181、RM25754、 1?17283、冊26937、冊101、冊28466)，根據已知的反應條件進行？0財廣增，然后在3%的瓊脂糖 凝膠電泳分離，檢測PCR產物的多態性，進而進行初步定位分析。定位結果表明，Oscaac 1基 因初步定位在第6號染色體長臂介于RM6298和RM7434兩個標記之間。
[0061 ]精細定位Oscaacl基因時，對由1430fF2突變個體組成的群體進行SSR分析。根據 分子標記RM6298和RM7434之間的粳稻和秈稻序列的差異，設計了5個新的SSR標記(P1-5)， 引物序列見表2。利用這些分子標記，將Oscaacl基因精確定位于P1和P5之間80kb的區段（圖 2) 〇
[0062] 表2.0scaacl精細定位及互補載體構建引物序列信息
[0063]
[0064] 5、基因預測和比較分析
[0065] 根據精細定位的結果，Oscaacl基因位于第6號染色體的P1和P5標記之間80kb范圍 之內。對該區段內的13個基因測序發現，一個ATP/ADP carrier基因的第一個外顯子發生了 4個堿基的缺失（圖2)，因此將該基因定位為Oscaacl的候選基因。
[0066] OsCAACl基因的基因組核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.2所不，編碼的蛋白質的氣基酸序列SEQ ID NO.3所不。有4個喊基缺失的Oscaacl基因的 基因組序列如SEQ ID N0.4所示。
[0067] 實施例20scaacl基因功能互補實驗
[0068] 構建了以OsCAACl基因自身的啟動子、基因片段及終止子全長5759bp的互補載體， 艮p pBWA(V)H-0sCAAC 1 (圖3)。利用高保真酶以水稻品種9311的基因組DNA為模板擴增 OsCAACl基因自身的啟動子、基因片段及終止子全長5759bp的片段（所用引物見表2)，用 Bsal酶切該片段和pBWA(V)H載體(武漢伯遠生物科技有限公司提供），然后用T4連接酶鏈接 酶切片段和pBWA(V)H載體骨架，得到轉基因載體pBWA(V)H-〇sCAACl。將pBWA(V)H-〇sCAACl 轉入大腸桿菌中擴增，并提取其載體質粒pBWA(V)H-〇sCAACl。
[0069] 用互補載體pBWA(V)H-〇sCAACl轉化到農桿菌EHA105中，轉化水稻caacl mutant突 變體，轉化方法為農桿菌介導法。從互補!^代陽性材料中隨機選取三個株系，按實施例1中 的條件進行培養，其幼苗第一葉和第二葉均表現為正常的綠色（圖4)，即互補載體能夠完全 恢復突變體caacl mutant的突變表型，由此可以確認白葉現象是由OsCAACl基因的缺失造 成的。
[0070] 以上所述僅為本發明的若干個【具體實施方式】，應當指出，對于本領域的普通技術 人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范 圍。
【主權項】
1. 一種水稻苗期葉片白化性狀基因 fccaad，其特征在于：為基因組序列如SEQ ID NO. 1所示的基因的突變基因。2. 根據權利要求1所述的水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaad，其特征在于：其基因組 序列如SEQ ID NO.4所示。3. 權利要求1或2所述的水稻苗期葉片白化性狀基因 Oscaad在雜交水稻Fi代雜種純度 鑒定和/或不育系自交種子純度鑒定中的應用。4. 一種雜交育種去除假雜種的方法，其特征在于:包括如下步驟:將包含權利要求1或2 所述的水稻苗期葉片白化性狀基因 fccaad的突變體植株與水稻保持系、不育系材料雜交、 回交，進而將fccaad基因導入到水稻保持系、不育系中，培育具有苗期白化葉片性狀的三 系和/或兩系不育系；當制種獲得的雜交Fi代進行幼苗期鑒定時，出現葉片表型為白化葉片 的植株為不育系自交的假雜種，作去除處理。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086036SQ201610554461
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月14日
【發明人】胡道恒, 李陽生, 陽菁
【申請人】武漢大學