水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標記及應用
【專利摘要】本發明公開了一個水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標記及應用，它以廣譜高抗稻瘟病常規水稻品種：自選2號為供體，稻瘟病敏感水稻品種：麗江新團黑谷LTH為受體，通過二者正反雜交，構建F2群體，通過圖位克隆的方法定位到一個含NB?ARC結構域的抗稻瘟病目標基因，該目標基因在抗感親本之間僅存在1個氨基酸的差異，且差異位于NB?ARC結構域的磷酸結合環P?loop上，確定該基因為水稻抗稻瘟病基因Pitb，最后根據抗感基因的差異開發出相應的分子標記。將水稻抗稻瘟病基因Pitb轉入感稻瘟病的水稻品種中，有助于產生新的抗稻瘟病病水稻新品種。水稻抗稻瘟病基因Pitb的分子標記可大大提高該基因應用于育種選擇效率，縮短育種時間。
【專利說明】
水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標記及應用
技術領域
[0001]本發明涉及分子生物學技術及育種領域，尤其是涉及一個水稻抗稻瘟病基因 Pitb、分離克隆方法、分子標記及其在水稻改良中的應用。
【背景技術】
[0002]由稻痕病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻痕病是水稻種植中最具毀滅性的真 菌病害之一，也是世界性的真菌病害(Okuyama et al · ,2011; Inoue et al · ,2013)。至今已 有80余個國家有稻瘟病發生的報道，其中以亞洲和非洲發病最為嚴重，據不完全統計，全球 每年因稻瘟病造成水稻減產達11%~30%，年平均超過一千萬噸，嚴重威脅著世界的糧食 生產(Wilson et al.，2009;Zhai et al· ,2011 ;Xu et al· ,2014)。目前培育和推廣應用抗 性品種是防治稻痕病最經濟有效且環保安全的措施(Ashikawa et al.，2008;Takahashi et al.，2010)。常規育種囿于抗源缺乏、遠緣雜交的生殖隔離和效率低下，在培育抗稻瘟病 新品種上很難滿足生產要求(Hayashi et al.，2009;Yuan et &1.，2011)。實踐證明，利用 分子標記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)育種實現抗病基因的定向轉移和聚 合，在培育持久抗稻瘟病新品種上顯示出常規育種無法比擬的優勢(李彬等，2014)。水稻抗 稻瘟病新基因的克隆則是有效地開展水稻抗病分子標記輔助選擇育種的重要前提和基礎。
[0003] 抗稻瘟病基因的定位和克隆是進行水稻抗病分子作用機制研究的基礎，有助于揭 示寄主與病原菌互作機理，隨著分子生物學的發展，定位和克隆抗性基因已成為當今分子 病理學的熱門課題(Lee et al.，2009;Lei et al.，2013)。在過去的數十年，科學家對稻瘟 病抗性進行了廣泛的分子遺傳研究，截至2015年3月，已至少報道了69個抗稻瘟病位點，84 個主效基因，已成功克隆的有24個主效基因，其中Pik(Pik-l和Pik-2)、Pit、Pita、Piz-t、 卩1(12、？1(13/?125、？121、？136和？137等基因的抗病等位基因與感病等位基因之間的基因編 碼區存在堿基替換;其他基因的抗病等位基因與感病等位基因序列或片段長度也存在多態 性（國家水稻數據中心http: //www.ricedata. cn/gene)。
[0004] 在這些報道中，除？11、？12、？19、？1-20、？1-33、？1-40、卩11111、？11^-11^^54等少數幾 個具有廣譜抗性外，其余大都表現為生理小種特異抗性（Qu et al.，2006;Xu et al.， 2008;Zhu et al.，2012)。同時，所定位或克隆的抗稻瘟病基因多源于野生稻資源，而從具 有優良農藝性狀的水稻材料中定位和克隆抗性基因的報道不多見，由于野生稻的種質資源 本身農藝性狀較差，在育種實踐中容易出現不利基因的連鎖累贅，導致這些抗性基因難以 被直接利用，難以滿足抗稻瘟病育種的要求(Chen et al.，2006;Xu et al.，2014)。然而， 如果從農藝性狀優良的廣譜抗稻瘟病品種中挖掘新的抗病基因，將有利于縮短抗病品種的 育種周期從而提高育種效率。
[0005] 水稻抗稻瘟病基因有著類似的保守結構域，根據這一特點，可將抗稻瘟病性基因 分成三類:NBS_LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat motif)類、凝集素 受體類和脯氨酸受體類。目前已報道的抗稻瘟病基因除Pid2(Chen et al.，2006)和pi21 (Fukuoka et al. ,2009)外都屬于NBS-LRR類，NBS-LRR蛋白質含有2個典型的結構域:核苷 酸結合位點(NBS)及富亮氨酸重復序列(LRR)(劉浩等，2014) JBS結構域具有ATP或GTP結合 水解功能，通過獲得能量來抵御病原菌入侵，并能夠改變ATP的構象從而傳遞信號分子 (McHale et al.JOOehLRR結構域趨向高度可變，該區域內含有一系列的β折疊，基因片段 的插入與缺失會導致β折疊的方向改變，其易于改變的結構可能與其能夠特異性識別病原 物效應蛋白質有關(Joshi et al.，2013)。
[0006] NB-ARC結構域是NBS的擴大結構域(Takken ET AL.，2009)。咄41?(：結構域中，NB指 核苷酸結合序列（Nucleotide binging site)，ARC分別指凋亡蛋白酶激活因子1 (Apoptotic protease-activating factor-1)、抗病蛋白（Resistance protein)和線蟲死 亡蛋白4(Caenorhabditis elegans death_4protein) (Schmutz et al ·，2010) 〇 已有石開究 表明蛋白質的NB-ARC結構域在細胞凋亡、超敏反應及抗病反應中發揮重要作用，特定氨基 酸的變異會導致功能的改變，例如，Tameling等(2006)將番茄含有NB-ARC結構域的抗性蛋 白1-2，P-loop基序第495位氨基酸由天冬氨酸變為纈氨酸，導致該植株發生自激活的超敏 反應。Tang等(2011)將水稻含NB-ARC結構域的NLS1蛋白，NB結構域GLPL基序附近第366位由 絲氨酸變為蘇氨酸，第367位氨基酸由絲氨酸變為天冬氨酸，分別導致植株產生持續激活的 防衛反應。迄今，在水稻的抗稻瘟病基因研究中還未見含NB-ARC結構域基因的報道。
[0007] 傳統選育方法依賴于抗性鑒定和表型選擇，不僅周期長、效率低而且受許多條件 的限制，在培育抗稻瘟病新品種上難以滿足生產要求(陳德西等，2010)。隨著DNA分子標記 技術的迅猛發展，利用抗病基因相應的分子標記進行輔助選擇，可大大提高育種選擇效率 (楊勤忠等，2009;王惠梅等，2012)。作物育種實踐中已開發了許多種分子標記，如馬建等 (2015)根據抗感品種中Pi35等位基因序列差異特性，開發了功能性分子標記Pi35-dCAPS， 利用該標記成功的鑒定確認了 5份藤系138衍生品種及2份微核心種質品種攜帶Pi35基因。 劉洋等(2008)利用抗稻瘟病基因 Pib自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子標記結 合運用，可有效地從水稻種質資源中快速而準確地選擇出抗稻瘟病基因 Pib，并能在分離世 代群體中選擇出含抗稻瘟病基因 Pib的純合單株。
【發明內容】
[0008] 本發明的第一個目的是提供一個水稻抗稻瘟病基因 Pitb，以增加水稻抗稻瘟病基 因的儲備。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分離克隆方法。
[0010]本發明的第三個目的是提供一個水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記。
[0011] 本發明的第四個目的是提供水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育種中的應用。
[0012] 本發明的第一個目的是這樣實現的：
[0013] 一個水稻抗稻瘟病基因 Pitb，特征是:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因組序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 本發明的第二個目的是這樣實現的：
[0015] 一種水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分離克隆方法，特征是：
[0016] A、以廣譜高抗稻瘟病常規水稻品種：自選2號，為抗稻瘟病基因的供體材料，并與 稻瘟病敏感水稻品種：麗江新團黑谷LTH為試驗材料，通過二者正反雜交，構建F2群體；其 中：廣譜高抗稻瘟病常規水稻品種：自選2號是在水稻常規品種lemont與廣西普通野生稻雜 交的后代中，篩選得到的水稻抗稻瘟病水稻材料，目前已進行了6代連續自交，抗病性狀穩 定;通過來自全國ZA、ZB和ZC三個種群的15個菌株接種鑒定試驗，確認其為廣譜高抗水稻材 料；
[0017] B、通過圖位克隆的方法定位到一個抗稻瘟病目標基因，三個步驟如下：
[0018] (1)、首先利用BSA技術進行初步定位，將抗稻瘟病目標基因鎖定在水稻基因組第 12號染色體短臂上；
[0019] (2)、然后利用染色體步移的方法進行抗稻瘟病目標基因的精細定位，將抗稻瘟病 目標基因鎖定在了 143kb的區間內；
[0020] (3)、最后通過生物信息學分析和測序比對，該區間內有一個含NB-ARC結構域的基 因（0sl2g0270300)，該基因總長3454bp，包含1個外顯子和2個內含子，編碼899個氨基酸序 列;將含NB-ARC結構域的基因（0sl2g0270300)確定為抗稻瘟病目標基因；
[0021]編碼899個的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，或該序列替換、缺失、或添加一個或 幾個氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽；
[0022] C、經測序分析:該抗稻瘟病目標基因在抗感親本之間僅存在1個氨基酸的差異，即 第189位抗病產物為組氨酸，而感病產物為谷氨酰胺，且該差異位于NB-ARC結構域的磷酸 結合環P-loop上，因此確定該基因為水稻抗稻瘟病基因 Pitb;
[0023] D、通過抗性鑒定和遺傳分析發現:F1代的個體都表現為稻瘟病抗性，F2代植株呈 現明顯的抗感分離，在正交群體中，抗、感稻瘟病植株數分別為158、42,分離比為3:1(x 2 = 0.9<乂2(0.05)=3.8);在反交群體中，抗、感稻瘟病植株數分別為143、57，分離比為3:1(乂 2 =0.63<x2(0.05) = 3.8)，結果說明：自選2號對稻瘟病菌的抗性由1對顯性主效基因控制， 該顯性主效基因為水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0024] 本發明的第三個目的是這樣實現的：
[0025] 一個水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記，特征是:根據序列差異，利用BioEdit軟 件搜索酶切位點，再利用Primer 5.0設計的擴增引物，得到適合水稻抗稻瘟病基因 Pitb的 分子標記（CAPS): GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT，Bsp 12861。
[0026] 本發明的第四個目的是這樣實現的：
[0027] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育種中的應用，得到抗稻瘟病的水稻。
[0028] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記在水稻育種中的應用，得到抗稻瘟病的水稻。 [0029]本發明具有如下的有益效果：
[0030] 將本發明提供的水稻抗稻瘟病基因 Pitb轉入感稻瘟病的水稻品種中，有助于產生 新的抗稻瘟病水稻新品種。本發明提供的水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記可大大提高該 基因應用于育種選擇效率，縮短育種時間。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0032] 實施例1:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的遺傳分析
[0033] 以廣譜高抗稻瘟病常規水稻品種：自選2號為水稻抗稻瘟病基因的供體，稻瘟病敏 感水稻品種:麗江新團黑谷LTH為水稻抗稻瘟病基因的受體，通過二者正反雜交，構建F2群 體，通過抗性鑒定和遺傳分析發現:F1代的單株都表現為稻瘟病抗性，F2代植株出現了抗感 分離，且符合3:1的分離比，即：自選2號對稻瘟病菌的抗性由1對顯性主效基因控制，該顯性 主效基因為水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0034] 實施例2:水稻抗稻瘟病基因 Pi tb的定位
[0035] 采用圖位克隆的方法定位水稻抗稻瘟病基因 Pitb，分為三個步驟：
[0036] (1)、首先利用BSA技術進行初步定位，將抗稻瘟病目標基因鎖定在水稻基因組第 12號染色體短臂上；
[0037] (2)、然后利用染色體步移的方法進行抗稻瘟病目標基因的精細定位，將抗稻瘟病 目標基因鎖定在了 143kb的區間內；
[0038] (3)、最后通過生物信息學分析和測序比對，該區間內有一個含NB-ARC結構域的基 因（0sl2g0270300)，該基因總長3454bp，包含1個外顯子和2個內含子，編碼899個氨基酸序 列;將含NB-ARC結構域的基因（0sl2g0270300)確定為抗稻瘟病目標基因；
[0039]編碼899個的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，或該序列替換、缺失、或添加一個或 幾個氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
[0040]經測序分析:該抗稻瘟病目標基因在抗感親本之間僅存在1個氨基酸的差異，即第 189位抗病產物為組氨酸，而感病產物為谷氨酰胺，且該差異位于NB-ARC結構域的磷酸結合 環P-loop上，因此確定該基因為目標基因：水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0041 ] 實施例3:水稻抗稻痕病基因 Pitb的分子標記(CAPS)的開發
[0042]水稻抗稻瘟病基因 Pitb在抗感親本之間僅存在1個氨基酸的差異，即：第189位抗 病產物為組氨酸，而感病產物為谷氨酰胺，該差異也是由1個堿基變異引起(C/A)。
[0043]
【申請人】根據這一特點，利用BioEdit和Primer5.0軟件設計和開發了分子標記 (GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT，Bsp 12861)，分子標記在群體中未檢測到重組 體，表現為共分離。
[0044] 實施例4:
[0045] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb用在水稻育種中，得到抗稻瘟病的水稻。
[0046] 實施例5:
[0047]水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記用在水稻育種中，得到抗稻瘟病的水稻。
[0048] 附錄：
[0049] 序列表獨立文本：
[0050] A、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因組序列：SEQ ID NO: 1;
[0051 ] 〈110>井岡山大學
[0052] 〈120>水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標記及應用
[0053] <160>3
[0054] <210>1
[0055] <211>3454
[0056] <212>DNA
[0057] 〈213>水稻（Oryza sativa L.)
[0058] <400>1
[0060]
[0061 ] B、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的編碼區序列：SEQ ID N0:2;
[0062] <210>2
[0063] <211>2700
[0064] <212>DNA
[0065] 〈213>水稻（Oryza sativa L.)
[0066] <220>
[0067] <221>CDS
[0068] <222>(1)...(2700)
[0069] <400>2
[0071]
[0072] C、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的編碼氨基酸序列：SEQ ID N0:3;
[0073] <210>2
[0074] <211>899
[0075] <212>PRT
[0076] 〈213>水稻（Oryza sativa L.)
[0077] <400>3
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
【主權項】
1. 一個水稻抗稻瘟病基因 Pitb，其特征在于：水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因組序列如 SEQ ID N0:1 所示。2. -種水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分離克隆方法，其特征在于： A、 以廣譜高抗稻瘟病常規水稻品種：自選2號為抗稻瘟病基因的供體材料，并與稻瘟病 敏感水稻品種:麗江新團黑谷LTH為試驗材料，通過二者正反雜交，構建F2群體； B、 通過圖位克隆的方法定位到一個抗稻瘟病目標基因，三個步驟如下： (1) 、首先利用BSA技術進行初步定位，將抗稻瘟病目標基因鎖定在水稻基因組第12號 染色體短臂上； (2) 、然后利用染色體步移的方法進行抗稻瘟病目標基因的精細定位，將抗稻瘟病目標 基因鎖定在了 143kb的區間內； (3) 、最后通過生物信息學分析和測序比對，該區間內有一個含NB-ARC結構域的基因： 0sl2g0270300,該基因總長3454bp，包含1個外顯子和2個內含子，編碼899個氨基酸序列;將 含NB-ARC結構域的基因：0sl2g0270300確定為抗稻瘟病目標基因； 編碼899個的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，或該序列替換、缺失、或添加一個或幾個 氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽； C、 經測序分析：該抗稻瘟病目標基因在抗感親本之間僅存在1個氨基酸的差異，即第 189位抗病產物為組氨酸，而感病產物為谷氨酰胺，且該差異位于NB-ARC結構域的磷酸結合 環P-loop上，因此確定該基因為水稻抗稻瘟病基因 Pitb; D、 通過抗性鑒定和遺傳分析發現:F1代的個體都表現為稻瘟病抗性，F2代植株呈現明 顯的抗感分尚，在正交群體中，抗、感稻痕病植株數分別為158、42,分尚比為3:1，x 2 = 0.9< 7(0.05)=3.8;在反交群體中，抗、感稻瘟病植株數分別為143、57，分離比為3:132 = 0.63 <x2(0.05) = 3.8，結果說明：自選2號對稻瘟病菌的抗性由1對顯性主效基因控制，該顯性 主效基因為水稻抗稻瘟病基因 Pitb。3. -個水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記，其特征在于：根據序列差異，利用BioEdit 軟件搜索酶切位點，再利用Primer 5.0設計的擴增引物，得到適合水稻抗稻瘟病基因 Pitb 的分子標記:GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT，Bsp 12861。4. 水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育種中的應用。5. 水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標記在水稻育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106086032SQ201610414870
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610414870.2, CN 106086032 A, CN 106086032A, CN 201610414870, CN-A-106086032, CN106086032 A, CN106086032A, CN201610414870, CN201610414870.2
【發明人】孫惠敏, 鄭卓, 吳麗花
【申請人】井岡山大學