一種針對miR?103?3p反義寡聚核苷酸及應用
【專利摘要】本發明屬于藥物制備領域，具體涉及一種針對miR?103?3p反義寡聚核苷酸。所述的針對miR?103?3p反義寡聚核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的針對miR?103?3p反義寡聚核苷酸可以用于制備治療蛛網膜下腔出血的藥物。本發明所提供的針對miR?103?3p反義寡聚核苷酸毒性小，能夠改善蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷。
【專利說明】
一種針對m i R-103-3p反義寡聚核苷酸及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于小分子生物藥物領域，涉及一種針對miR-103-3p反義寡聚核苷酸及應 用。
【背景技術】
[0002] 蛛網膜下腔出血（SAH)是指腦底部或腦表面血管破裂后，血液流入蛛網膜下腔引 起相應臨床癥狀的一種腦卒中，又稱原發性蛛網膜下腔出血。SAH約占全部腦卒中的5%-10%，年發病率約6-20/10萬人。
[0003] SAH的常見原因有先天性動脈瘤、腦血管畸形、腦底異常血管網病(moyamoya病）以 及夾層動脈瘤、血管炎、高血壓動脈硬化等。血液進入蛛網膜下腔，通過圍繞在腦和脊髓周 圍的腦脊液迅速播散，刺激腦膜引起腦膜刺激征。顱內容量增加引起顱內壓升高，甚至腦 疝。在腦室和腦地凝固的血液可阻塞腦脊液循環通路，使其吸收和回流受阻引起梗阻性腦 積水，或引起蛛網膜粘連，后交通動脈瘤的擴張或破裂出血可壓迫鄰近的動眼神經，產生不 同程度的動眼神經麻痹。血細胞釋放的血管活性物質可引起血管痙攣，嚴重者發生腦梗死。 血液刺激下丘腦可引起血糖升高、發熱等內分泌和自主神經紊亂。SAH在30天內病死率約為 25%或更高。再出血的病死率為50%，2周內再出血率為20%-25%。影響SAH患者預后的的 主要因素是早期腦損傷和血管痙攣導致的遲發型腦損傷等并發癥。目前臨床上SAH的治療 手段十分有限，僅有一般處理和對癥治療、降低顱內壓、防治再出血。對于早期腦損傷，尚缺 乏有效的治療策略。
[0004] MicroRNAs(miRNAs)為一類長度為18-25個核苷酸的短鏈非編碼RNA，在體內可與 目的基因 mRNA的3'UTR互補結合從而抑制目的基因的表達。從藥物開發的角度來看， MicroRNAs具有序列已知且短小，通常在物種間完全保守等顯著優勢。近年來越來越多的動 物實驗甚至臨床試驗表明疾病相關microRNAs的抑制劑反義寡聚核苷酸有望成為一種全新 的藥物。反義寡聚核苷酸是人工合成的一小段寡核苷酸，其可以與成熟的microRNAs互補結 合從而阻止microRNAs與目的基因 mRNA相互作用。為了實現對疾病相關microRNAs進行有效 抑制，反義寡聚核苷酸需經過一系列的化學修飾其中包括硫代磷酸骨架修飾，高親和力二 糖修飾以及膽固醇修飾。這些化學修飾使得反義寡聚核苷酸的核酸酶抵抗力，細胞攝取力 及其與目的基因的親和力均大大提高了，從而能有效的在體內發揮抑制作用。反義寡聚核 苷酸也有可能綁定其他相似序列造成脫祀現象(off-target effects)，從而引起無法預料 的后果。其真實藥效情況如何，既往并無研究證據。
[0005] miR-103_3p又稱低氧誘導microRNA，屬于miR-15/107家族成員。多種芯片信息表 明miR-103-3p在中樞神經系統中高度表達且在卒中后表達進一步上調，預示著其對于中樞 神經系統基因表達調控有著重要的作用。有研究顯示，miR-103-3p與中樞神經系統中將近 20%的mRNA有著高度重疊。目前已報道抑制miR-103-3p表達的慢病毒載體對胰腺癌細胞的 表達有抑制作用。但尚未見抑制miR-103-3p表達對腦血管病變有療效的報道。
【發明內容】
[0006] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種針對miR-103-3p反 義寡聚核苷酸。
[0007] 本發明的另一個目的在于提供上述miR-103-3p反義寡聚核苷酸的應用。
[0008]本發明的目的可通過以下技術方案實現：
[0009] -種針對m i R - 1 〇 3 - 3 p反義寡聚核苷酸的核苷酸序列如下：5'_ TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'（SEQ ID N0.1)。
[0010] 所述的針對miR-103-3p的反義寡聚核苷酸優選經過5'端膽固醇修飾和3'端甲基 化修飾。
[0011]本發明所述的針對miR-103-3p的反義寡聚核苷酸在制備治療腦血管病的藥物中 的應用。
[0012] 所述的腦血管病優選治療蛛網膜下腔出血、蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷。
[0013] 一種用于治療腦血管病的藥物，包括藥理學有效劑量的本發明所述的針對miR-l〇3-3p的反義寡聚核苷酸以及藥理學可接受的載體。
[0014] 所述的腦血管病優選蛛網膜下腔出血、蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷。
[0015] 所述的載體描述了對有機體不造成明顯刺激并且不消弱miR-103-3p反義寡聚核 苷酸生物活性和性能的物質。載體必須有足夠的純度和足夠低的毒性，以使其適合施用至 正在治療的對象。載體可以是惰性的，或它可以具有藥學益處。
[0016] miR-103-3p反義寡聚核苷酸和所述的載體可被制備成脂質體、納米材料、微乳液、 微球、凝膠或囊泡等劑型。這些劑型的制備方法和所用的輔料均為現有技術。
[0017] 有益效果：
[0018]本發明通過實驗發現，一定濃度的miR-103-3p反義寡聚核苷酸能夠改善蛛網膜下 腔出血后的早期腦損傷，包括改善血腦屏障的破壞，降低神經元的死亡和凋亡，進而對腦組 織起到保護作用，可用于制備治療蛛網膜下腔出血的藥物。
[0019] 相對于其他miRNAs抑制劑，本發明提供的針對miR-103-3p反義寡聚核苷酸具有分 子量小，毒性小，穩定性及細胞攝取率高等優點，可用于腦血管疾病的實驗治療研究，有一 定的藥物開發前景。
【附圖說明】
[0020]
[0021] 圖1為假手術組、反義寡聚核苷酸陰性對照組(簡稱陰性對照組，下同）、miR-103_ 3p反義寡聚核苷酸組(簡稱反義寡聚核苷酸組，下同）建模后miR-103-3p表達情況的比較。 圖2為在出血量嚴重程度評分時對腦底基底池的具體分區。
[0022] 圖3為假手術組、反義寡聚核苷酸陰性對照組、miR-103_3p反義寡聚核苷酸組建模 后腦基底池出血量嚴重程度評分的比較。
[0023] 圖4為假手術組、反義寡聚核苷酸陰性對照組、miR-103_3p反義寡聚核苷酸組建模 后24h血腦屏障破壞程度比較結果。
[0024] 圖5為假手術組、反義寡聚核苷酸陰性對照組、miR-103_3p反義寡聚核苷酸組建模 后1，3,7，14,28天的行為學的比較。
【具體實施方式】 [0025] 實施例1
[0026] 1 方法
[0027] 1.1實驗動物
[0028] 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠300_350g，由南京軍區南京總醫院動物實 驗中心提供，術前單籠飼養3天，以避免非特異性因素的影響，飼養于室溫20±2°C，12小時 光照/12小時黑暗環境中，保證自由飲食飲水。
[0029] 1.2實驗方法
[0030] 1.2.1動物分組
[0031] 將SD大鼠隨機分為假手術組（Sham)、反義寡聚核苷酸陰性對照組、miR-103-3p反 義寡聚核苷酸組。
[0032] (1)假手術組:線栓插入顱內，但并不刺破血管；
[0033] (2)反義寡聚核苷酸陰性對照組：SAH建模前24h，按照0.2nmo 1/uL(總共5uL)，以 luL/10min經側腦室給予反義寡聚核苷酸陰性對照， 3'（SEQ ID NO.2)同樣經過5'端膽固醇修飾和3'端甲基化修飾的寡聚核苷酸，但是不具有 抑制miR-103-3p的功能。
[0034] (3)miR-103-3p反義寡聚核苷酸組：SAH建模前24h，按照0.2nmol/uL(總5uL)，以 luL/10min經側腦室給予miR-103-3p反義寡聚核苷酸。
[0035] 1.2.2 SAH模型制備
[0036] 用10%水合氯醛將大鼠麻醉達適宜狀態后，仰臥位固定于鼠板，以顱內血管穿刺 法建立大鼠 SAH模型。大鼠頸部備皮并消毒，解剖并充分暴露出右側頸總、頸內、頸外動脈， 結扎頸外動脈和頸總近心端，并在頸內動脈起始處預留一根線，在兩個結之間的頸總動脈 上用顯微手術剪剪一個小口，用手術鑷持帶有尖端的4-0線栓通過頸總上的小口緩慢插入， 經頸內動脈入顱，直到感覺到阻力后再將線栓向前3mm以刺破大腦前和中動脈的分支處。刺 破后立即將線栓抽出，將頸內動脈結扎，即成功建造大鼠 SAH模型。假手術組的大鼠，在線栓 緩慢入顱后感覺到阻力即撤出，并不刺破血管。術中、術后都注意大鼠的保溫以及隨后能自 由飲食飲水，直到取腦安樂死。
[0037] 1.3實時熒光定量PCR測定miR-103-3p的表達量
[0038]引物由上海杰瑞公司合成，m i R - 1 〇 3 - 3 P逆轉錄引物：5 ' CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATAG 3'（SEQ ID 腸.3)，上游引物：5' ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGGC 3 ' ( SEQ ID NO · 4 )，下游弓| 物^-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 '（ SEQ ID NO · 5);內參U6:上游引物：5 ' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '（ SEQ IDN0·6)，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQIDN0·7)。取正常或SAH術后大鼠 右側半球腦組織，用TRIzol提取組織總RNA并測定RNA濃度。取200-400ng的RNA為模板，使用 逆轉錄試劑盒(Thermo)逆轉錄成cDNA，PCR反應體系為25ul，cDNA 2ul，上游引物0.5ul，下 游引物0.5ul，SYBR混合液12.5ul，采用兩步法PCR反應，反應條件:預變性95度X 30s，1個循 環;變性95度X 15s，退火加延伸60度X 30s，46個循環。反應結束后計算機自動結算結果，結 果以表示。
[0039] 1.4 SAH嚴重程度評分測定
[0040] 各組大鼠造模后24h取腦，將腦底拍照，在照片中，將基底池分為6個部分（圖1)，然 后按照表1的評分標準進行評分。
[0041 ] 表1 SAH后出血嚴重程度評分標準
[0042]
[0043] 1.5大鼠神經功能評分
[0044] 在建模1，3，7，14，28天后進行大鼠運動感覺功能評分(如表2)。
[0045] 表2大鼠運動感覺神經功能評分標準
[0046]
[0047] 1.6 Evans Blue法檢測血腦屏障通透性
[0048] 各組大鼠建模后24h，按5ml/kg的劑量經尾靜脈注射2%Evans blue生理鹽水溶 液，循環60分鐘后，進行心臟灌注，取腦后將腦組織分為左右半球，并分別稱量左右半球的 重量(g)，分別加入3ml甲酰胺，然后置于60°C水浴箱中24h后取出，在620nm下測吸光度值， 計算出左右半球的EB含量(ug)，EB的含量/腦組織重量(ug/g)即代表血腦屏障被破壞程度。
[0049] 2統計學分析
[0050] 本實驗所有數據均使用均數土標準差表示，采用SPSS 16.0統計軟件，行單因素方 差分析或t檢驗，P〈0.05為差異有統計學意義。
[0051 ] 3 結果
[0052] 3.1 miR-103-3p反義寡聚核苷酸能夠明顯抑制SAH術后miR-103-3p表達。
[0053] 如圖1所示miR-103-3p反義寡聚核苷酸組相對于反義寡聚核苷酸陰性對照組，SAH 術后24h miR-103-3p表達顯著下調（P〈0.01) AAH術前24h側腦室給予0.2nmol/uL(總共 5uL)的miR-103-3p反義寡聚核苷酸可顯著抑制miR-103-3p的表達。
[0054] 3.2 SAH嚴重程度情況
[0055] 假手術組腦基底池并無出血，而反義寡聚核苷酸陰性對照組、miR-103_3p反義寡 聚核苷酸組腦基底池出血嚴重程度之間并沒有顯著差異(P>〇.〇5)(如圖3)。
[0056] 3.3血腦屏障通透性改變
[0057] 伊文思藍染料滲透試驗可顯示血腦屏障的通透性，伊文思藍滲出越多說明血腦屏 障損傷越嚴重。相對于假手術組，反義寡聚核苷酸陰性對照組、miR-103-3p反義寡聚核苷酸 組血腦屏障的均有不同程度的破壞，但是相比于反義寡聚核苷酸陰性對照組，miR-103-3p 反義寡聚核苷酸組伊文思藍染料的滲出明顯減少(P〈〇.01)。（如圖4)
[0058] 3.4神經行為學改變
[0059] 大鼠的改良Garcia評分在SAH術后1，3，7，14，28天進行，主要從運動、感覺和前庭 功能等方面對大鼠的神經功能進行評估。每組大鼠行為學評分顯示如圖5,各個時間點假手 術組大鼠之間行為學均無明顯差異(Ρ>〇.〇5)ΑΑΗ術后1天miR-103-3p反義寡聚核苷酸組大 鼠的運動、感覺及前庭功能評分較反義寡聚核苷酸陰性對照組有明顯改善(P〈〇.05)，隨后 評分略有上升，但是3,7，14天miR-103-3p反義寡聚核苷酸組與反義寡聚核苷酸陰性對照組 相比差異仍具有統計學意義(P〈〇. 05)。
[0060]上述結果證實:miR-103-3p反義寡聚核苷酸能夠改善蛛網膜下腔出血后的早期腦 損傷，包括降低神經元的死亡和凋亡，改善血腦屏障的破壞，進而對腦組織起到保護作用， 可用于制備治療蛛網膜下腔出血的藥物。
【主權項】
1. 一種針對miR-103-3p的反義寡聚核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.l 所示。2. 根據權利要求1所述的針對miR-103-3p的反義寡聚核苷酸，其特征在于:所述的針對 miR-103_3p的反義寡聚核苷酸經過5 '端膽固醇修飾和3 '端甲基化修飾。3. 權利要求1或2所述的針對miR-103-3p的反義寡聚核苷酸在制備治療腦血管病的藥 物中的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的腦血管病為蛛網膜下腔出血、蛛網膜 下腔出血后的早期腦損傷。5. -種用于治療腦血管病的藥物，其特征在于包括藥理學有效劑量的權利要求1或2所 述的針對miR-103-3p的反義寡聚核苷酸以及藥理學可接受的載體。6. 根據權利要求5所述的藥物，其特征在于所述的腦血管病為蛛網膜下腔出血、蛛網膜 下腔出血后的早期腦損傷。
【文檔編號】A61P9/10GK106086026SQ201610489433
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月28日
【發明人】葉瑞東, 王劉敏, 劉新峰
【申請人】葉瑞東