紫苑石斛的分子特異性標記引物及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及紫苑石斛的分子特異性標記引物，以及一種能對紫苑石斛進行快速鑒定的方法。所述引物序列為：上游引物：5′?AGCGGCCGCGCCTTCC?3′；下游引物：5′?GGAAGGCGCGGCCGCT?3′。本發明有益效果主要體現在：本發明分子特異性標記引物可對紫苑石斛進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別石斛品種所不能替代的分子手段。
【專利說明】
紫苑石斛的分子特異性標記引物及檢測方法 (一)
技術領域
[0001] 本發明涉及紫苑石斛的分子特異性標記引物，以及利用該引物對紫苑石斛進行鑒 別和檢測的方法。 (二)
【背景技術】
[0002] 石斛(D. orchids )，又名石斛蘭，是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物， 廣泛分布于亞州和大洋州的中國、日本、菲律賓、泰國、印度、馬來西亞、澳大利亞和新西蘭 等國，約有1000多個種，我國有74種和2個變種。石斛作為一種優良的藥用植物，具有較高的 藥用及保健價值，最早見于《山海經》，藥用始載于《神農本草經》，其后被《本草綱目》等歷代 本草錄述，具有"主傷和，除痹，下氣，補五藏虛勞贏瘦，強陰，厚腸胃，輕身，延年"等功效。
[0003] 藥用植物種質資源是中藥生產的源頭，是進行中藥材品種改良、新品種培育及遺 傳工程的物質基礎，尤其是野生近緣植物和古老的地方種是長期自然選擇和人工選擇的產 物，具有獨特的優良性狀和抵御自然災害的特性。隨著石斛的傳統功效不斷被人們通過現 代藥理研究和臨床療效所肯定，石斛產品越來越受到消費者推崇，以石斛為原料的藥品和 保健品也逐步開發并進入市場，據浙江省中藥材產業協會鐵皮石斛分會統計，2013年全省 石斛相關產業總產值達30億元，2015年達到40億元。為保障石斛產業又好又快發展，要充分 認識石斛品種對發展石斛產業的重要性，必須加快石斛優良種苗發展和強化質量管理。對 石斛種苗質量的監督管理要著力解決目前生產上石斛種苗的混亂局面，并首先從技術層面 上對石斛品種進行鑒別保護。
[0004] 對石斛品種的鑒別主要依據表觀特征，但由于許多形態性狀鑒定的周期長、受環 境影響大，并且品種數量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀以來，一些基于PCR 的分子標記技術如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repea，簡單序列重復區間擴增多態性）和SRAP( sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態性) 相繼用于石斛的種質資源遺傳 多樣性、遺傳距離研究，但對于分子標記與石斛性狀的連鎖、石斛品種間的分子鑒別研究很 少，況且這些分子標記所采用的或為通用隨機引物或為成套設計引物的隨機組合，其PCR擴 增圖譜不僅復雜、重復性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒定。SCAR(Se qUenCe Characterized Ampl if ied Region，特征性片段擴增區域）標記是1993年由Paran和 Michelmore在RAPD基礎上提出的，它基于對特異RAH)片段的測序，根據兩端序列設計一對 18~24堿基的引物，在較高的退火溫度下進行特異擴增實現的，其專一性引物的采用排除 了隨機引物結合位點之間的競爭，因而它是一種十分穩定的分子標記，在應用上具有迅速、 簡便、低成本的特點，迄今為止，尚未有SCAR標記應用于石斛品種鑒別的研究報道。 (三)
【發明內容】
[0005] 本發明目的提供紫苑石斛(Dendrobium transparens)的分子特異性標記引物，以 及一種能對紫苑石斛進行快速鑒定的方法。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 紫苑石斛的分子特異性標記引物，所述引物序列如下：
[0008] 上游引物：5' -AGCGGCCGCGCCTTCC-3'
[0009] 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。
[0010] 該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試驗，獲得紫苑石斛的特異性DNA片段，將 該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎，所設計的特異性引物，以該引物對紫苑石斛進 行PCR擴增，可獲得lOOObp多大小的特異性片段。
[0011] 本發明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對紫苑石斛進行快速鑒定的 方法，所述方法為:提取待測石斛品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記 引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果僅出現約lOOObp 大小的特異DNA條帶，則待測石斛品種為紫苑石斛，反之則否;所述分子特異性標記引物序 列為：
[0012] 上游引物：57 -AGCGGCCGCGCCTTCC-3'
[0013] 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。
[0014] 所述方法關鍵在于擴增引物的選擇，DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定，以及 電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
[0015] 本發明所述PCR反應體系組成如下：
[0016] Master Mix PCR Buffer 終濃度為IX
[0017] 上、下游引物 各0.4μΜ
[0018] 模板 DNA 60ng
[0019] 余量為 ddH20;
[0020] Master Mix PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應體系中的 濃度與1XPCR Buffer相同，通常選用體積為反應體系體積1/2的2XMaster Mix PCR BufferjXMaster Mix PCR Buffer試劑選用Biotekecorporation(PR1702)。
[0021] 所述PCR擴增條件如下：95°C預變性4min; 95°C變性lmin，60 °C退火30s，72 °C延伸 lmin，共35個循環;最后于72°C補平5min，終止溫度為4°C。
[0022] 具體的，所述方法如下：
[0023] (1)取待測石斛葉片，加液氮徹底磨碎，以SDS-CTAB法提取待測石斛葉片的基因組 DNA；
[0024] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引 物，進行PCR擴增：
[0025] PCR反應體系每25μ1組成如下：
[0026] 2XMaster Mix PCR Buffer 12.5μ1
[0027] 10μΜ上、下游引物 各ΙμL
[0028] 20ngAU 模板 DNA 3μ1
[0029] ddH20 補足至 25μ1;
[0030] PCR反應條件如下：
[0031] 95°C預變性4min;95°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環；最后 于72°C補平5min，終止溫度為4°C ;
[0032] (3)取步驟(2)擴增產物5μ1，與ΙμL 0.25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1.5 %的瓊 脂糖凝膠上，于1 X TAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，EB染色通常在含 0.5μg/mlEB的水溶液中染色30分鐘后，于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結果出現 1 OOObp的DNA條帶，則待測樣品為紫苑石斛。
[0033] 本發明有益效果主要體現在:本發明分子特異性標記引物可對紫苑石斛進行快速 的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別石斛品種所不能替代的分子手段。 (四）
【附圖說明】
[0034]圖1為對石斛品種進行PCR擴增的結果;Μ為DNA分子量標準;箭頭所指為從編號為 16的石斛品種擴增出的分子量為lOOObp多大小的特殊DNA條帶;其余編號為其它的石斛品 種。 (五)
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0036] 實施例1:
[0037] (1)石斛品種基因組DNA的提取：取待測石斛品種幼嫩葉片O.Olg，加液氮徹底磨 碎，基因組DNA的提取采用SDS-CTAB法，經多次抽提，來提取獲得石斛的基因組DNA粗提物。 DNA粗提物再經Magabio核酸純化試劑盒進行純化(博日Bioer，杭州，中國）后，通過1.5%的 瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光光度計(GeneQuant Pro，GE Healthcare)來檢測完整 性、純度及濃度。0D26Q/0D28Q>1.8的DNA樣品用于后續PCR擴增。DNA提取物于-20 °C冰箱貯藏 備用。
[0038] (2)設計特異PCR擴增引物，引物對的序列為：57 -AGCGGCCGCGCCTTCC-3'和下游引 物5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'，由杭州擎科工程技術有限公司合成。
[0039] (3) SCAR分子標記的PCR擴增：
[0040] PCR反應體系每25μ1組成如下：
[0041 ] 2XMaster Mix PCR Buffer 12.5μ1
[0042] lOmM特異引物對各ΙμL
[0043] 20ngAU模板DNA 3μ1
[0044] ddH20 補足至 25μ1。
[0045] 擴增反應在TC-XP型擴增儀上進行。PCR擴增條件如下:95°C預變性4min;95°C變性 lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環;最后于72°C補平5min，終止溫度為4°C。
[0046] (4)電泳檢測:取步驟(3)PCR擴增產物5ul，與lul 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點樣 于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束后，在含0.5yg/ mlEB的水溶液中染色30分鐘，然后在培清JS-380A自動凝膠圖像分析儀上照相。
[0047] 按照上述方法，（編號1~19代表石斛品種依次為：1 :長蘇石斛（Dendrobium brymerianum Rchb · f ·); 2:翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb · f ·); 3 :鼓植石斛 (Dendrobium chrysotoxum Lindl ·) ;4:晶帽石角斗（Dendrobium crystal linum Rchb.f.)； 5:齒辦石斛；6:串珠石斛（Dendrobium devonianum Paxt ·); 7 :尖刀唇石斛（Dendrobium heterocarpum Lindl.);8:喇隊唇石斛（Dendrobium lituiflorum Lindl.);9:杓唇石斛 (Dendrobium moschatum(Buch.-Ham. )Sw.); 10:束花石角斗（Dendrobium chrysanthum Lindl.);ll:腫節石斛（Dendrobium pendulum Roxb · ) ; 12 :報春石斛（Dendrobium primulinum Lindl.);13:梳唇石角斗（Dendrobium strongylanthum Rchb.f.);14:球花石角斗 (Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f.); 15:長距石角斗（Dendrobium longicornu Lindl.)； 16:紫斃石斛(Dendrobium transparens); 17:假竹（購自云南德宏熱帶農業科學研究所）； 18:金欽石角斗(Dendrobium nobileLindl); 19:黑毛石角斗(Dendrobium williamsonii Day et Rchb.f.))進行檢測，電泳結果見圖1。
[0048]其中編號為16的紫苑石斛，擴增出了分子量為lOOObp多大小的特殊DNA條帶，其余 編號為其他石斛品種，未見有l〇〇〇bp多大小的特殊DNA條帶產生，可見本發明特異性引物特 異性好、靈敏度高，可用于快速鑒別紫苑石斛。
【主權項】
1. 紫苑石斛的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物:5' -AGCGGCCGCGCCTTCC-3' 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。2. -種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對紫苑石斛進行快速鑒定的方法， 所述方法為:提取待測石斛品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記引物作 為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現lOOObp的特異DNA條 帶，則待測石斛品種為紫苑石斛，反之則否;所述分子特異性標記引物序列為： 上游引物:5' -AGCGGCCGCGCCTTCC-3' 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下:95°C預變性4min; 95°C 變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環；最后于72°C補平5min，終止溫度為4 Γ。4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待測石斛葉片，加液氮徹底磨碎，以SDS-CTAB法提取待測石斛葉片的基因組DNA; (2) 以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進 行PCR擴增： PCR反應體系每25μ1組成如下： 2XMaster Mix PCR Buffer 12.5μ1 ΙΟμΜ上、下游引物 各ΙμL 20ngAU 模板 DNA 3μ1 ddH20 補足至 25μ1; PCR反應條件如下： 95°C預變性4min;95°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環；最后于72 °C補平5min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟(2)擴增產物5μ1，與ΙμL 0.25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1.5 %的瓊脂糖 凝膠上，于1 X ΤΑΕ緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后ΕΒ染色，ΕΒ染色通常在含0.5yg/ mlEB的水溶液中染色30分鐘后，于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結果出現lOOObp的 DNA條帶，則待測樣品為紫苑石斛。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086015SQ201610653876
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月10日 公開號201610653876.5, CN 106086015 A, CN 106086015A, CN 201610653876, CN-A-106086015, CN106086015 A, CN106086015A, CN201610653876, CN201610653876.5
【發明人】童曉青, 王麗玲, 秦川, 王衍彬, 劉本同, 黃旭波, 方茹, 錢華
【申請人】浙江省林業科學研究院