一種鱗翅目幼蟲基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發明提供了一種提取鱗翅目幼蟲基因組DNA的有效方法，鱗翅目幼蟲細胞內含有大量的蛋白質，這是影響DNA純度的主要原因，本發明以鱗翅目幼蟲斜紋夜蛾為例，利用1％CTAB提取液以及飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液去除組織蛋白，其去除組織蛋白效果相對于單純用氯仿、異戊醇混合液去除組織蛋白的效果要好很多，因為在低溫條件下飽和苯酚與組織蛋白的結合使其變性的能力遠高于氯仿/異戊醇；為了確保DNA的完整性和活性在操作過程中要求十分謹慎(搖晃樣品時不能太劇烈)，以及異丙醇高效沉淀DNA，最終較徹底去除雜質，得到高純度的基因組DNA。
【專利說明】
一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法。
【背景技術】
[0002] 基因組DNA的提取是分子生物學實驗很重要的一個環節，基因組DNA的質量和產 量，直接影響分子生物實驗中與DNA有關的后續實驗的進行。
[0003] 鱗翅目包括蛾、蝶兩類昆蟲，屬有翅亞綱、全變態類。全世界已知約20萬種，中國已 知約8000余種，該目為昆蟲綱中僅次于鞘翅目的第2個大目，分布范圍極廣，以熱帶種類最 為豐富，絕大多數種類的幼蟲為害各類栽培植物，體形較大者常食盡葉片或鉆蛀枝干，體形 較小者往往卷葉、綴葉、結鞘、吐絲結網或鉆入植物組織取食為害，成蟲多以花蜜等作為補 充營養，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。
[0004] 針對鱗翅目昆蟲的研究在防治植物蟲害方面具有重要意義，但目前還沒有一種關 于提取鱗翅目幼蟲基因組DNA有效方法的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的旨在提供一種提取鱗翅目幼蟲基因組DNA的有效方法。
[0006] 本發明的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟①:將鱗翅目幼蟲放入無菌研缽中，然后添加液氮將鱗翅目幼蟲研成粉末；
[0008] 步驟②:將所述步驟①中的粉末轉移到無菌離心管中，并倒入提取液，混勻，之后 加入β-巰基乙醇，60~70°C水浴30~45分鐘，混勻，得到混合液I;
[0009] 步驟③:給所述步驟②中混合液I加入飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液，震蕩搖勻， 靜置，離心后取上清液到一支新的離心管中，然后加入核糖核酸酶，使濃度達50ug/ml，然后 30~40 °C水浴20~40分鐘，得到混合液Π ;
[0010] 步驟④:將所述步驟③中混合液Π 離心后取上清液到新的離心管內，加入飽和苯 酚、氯仿、異戊醇混合液，混勻，再次離心后取上清液至新的離心管，加入預冷異丙醇，混勻， 離心后棄上清液，得到混合液m;
[0011] 步驟⑤:將所述步驟④中的混合液m洗滌脫鹽，離心后棄上清液，得到鱗翅目幼蟲 基因組DNA，最后加無菌水溶解，保存。
[0012] 所述步驟②中提取液提取液為100ml，其是由以下物質制成的：CTAB lg，NaCl 28ml，EDTA(0 · 5mo 1/L，PH 8 · 0)4ml，Tris-HCl (lmo 1 /L，PH 8 · 0) 10ml，β-巰基乙醇 lml，最后 加水定容至l〇〇ml。
[0013] 所述步驟②中加入提取液的比例為粉末:提取液=1:8(w/v)，所述步驟②中加入 β-巰基乙醇的量為36ul，水浴時溫度為65°C。
[0014] 所述步驟③和步驟④中加入苯酚、氯仿、異戊醇混合液時等體積加入苯酚:氯仿： 異戊醇= 25:24: l(v/v)的混合液。
[0015] 所述步驟③中靜置時間為10~15分鐘，所述步驟③、步驟④和步驟⑤中離心操作 為12000r/min離心10分鐘。
[0016]所述步驟③中水浴時溫度為37°C，水浴時間為30分鐘。
[0017]所述步驟⑤中洗滌脫鹽時用70 %乙醇。
[0018] 本發明具有以下優點和積極效果：
[0019] 1、本發明提供的鱗翅目幼蟲基因組DNA提取方法試驗成本低、操作簡單。
[0020] 2、使用本發明的方法提取的鱗翅目幼蟲基因組DNA基因完整性好，純度高。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為不同方法提取基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0022] 圖2為不同方法提取斜紋夜蛾DNA得率平均值柱狀圖；
[0023] 圖3為A260/A280平均值柱狀圖；
[0024] 圖4為A260/A230平均值柱狀圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖和實施例對本發明的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法做詳細 說明。
[0026] 實施例1:
[0027] 一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0028]①:將低溫處理過的鱗翅目幼蟲放入5ml無菌研缽中，然后添加液氮將鱗翅目幼蟲 研成粉末；
[0029]②:將步驟①中的粉末轉移到無菌離心管中，并按l:8(w/v)的比例倒入1%CTAB提 取液，充分混勻，之后加入36ιι1β-巰基乙醇，放入65°C水浴40分鐘，期間不時將離心管顛倒 混勻，得到混合液I;
[0030]③:給步驟②中混合液I按等體積加入飽和苯酸:氯仿：異戊醇=25:24:1 (v/v)的 混合液，震蕩搖勻，靜置10~15分鐘；12000r/min離心10分鐘后取上清液到一支新的離心管 中，然后加入核糖核酸酶，使濃度達50ug/ml，然后37°C水浴30分鐘，得到混合液Π ;
[0031] ④:將步驟③中混合液Π 12000r/min離心10分鐘后取上清液到新的離心管內，按 等體積加入飽和苯酸:氯仿：異戊醇=25:24:1 (v/v)的混合液，充分混勾，再次12000r/min 離心10分鐘后取上清液至新的離心管，加入2/3體積的預冷異丙醇，混勻，12000r/min離心5 分鐘后棄上清液，得到混合液m;
[0032] ⑤:將步驟④中的混合液m用70%乙醇洗滌脫鹽，離心后棄上清液，得到鱗翅目幼 蟲基因組DNA，最后加適量無菌水溶解，-20 °C保存。
[0033] 本發明中 1%CTAB提取液的組成為：CTAB lg，NaCl 28ml，EDTA(0.5mol/L，PH 8.0) 4ml，Tris_HCl(lmol/L，PH 8.0)10ml，β-疏基乙醇lml，水定容至 100ml〇
[0034] 實施例2:
[0035] 四種基因組DNA提取方法的對比試驗：
[0036]本實驗以三齡的斜紋夜蛾為試驗材料，提取液濃度分別為1 % CTAB、2 % CTAB、1 % SDS和2%SDS;通過比較幾種DNA提取方法，總結出一種適用于大量提取鱗翅目幼蟲基因組 DNA的新方法，檢測結果表明，改良1%CTAB法完全適用于鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取，與 其他方法相比，具有實驗成本低，基因完整性好，純度高、操作簡單等優點，為今后的基因文 庫構建、基因克隆重組等分子生物學下游的研究實驗提供技術參考。
[0037] -、供試材料與試劑
[0038]供試材料:三齡的斜紋夜蛾幼蟲。
[0039]提取試劑:苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1);異丙醇；聚乙烯吡咯烷酮(PVP);無水乙 醇；Tris堿;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，上海國藥集團化學試劑有限公司生產）；十二烷 基磺酸(SDS);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA);以上試劑均為分析純。
[0040] 1 %和2 % SDS提取液(100mL)的配制成分表
[0041]
[0042] 1%和2%CTAB提取液（100mL)的配制成分表
[0043]
[0045]二、試驗方法
[0046] a)基因組DNA的提取方法 [0047] SDS 提取法：
[0048] (1)稱取lg斜紋夜蛾放入遇冷的研磨中加液氮研碎，轉入5ml離心管中，分別入2ml 預熱的SDS提取液（SDS(1.4mol/L NaCl(W/V)，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1% PVP-40(W/V)))，同時加入1%B-巰乙醇，充分震蕩混勻，65°C水浴40~45min，不時輕輕震 蕩；
[0049] (2)取出離心管自然冷卻至室溫，按等體積加入苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1)， 10000r/min，40C離心10min，取上清至另一離心管中；
[0050] (3)加入預冷(-20 °C )的1 · 5倍體積無水乙醇，置-20°C 30~60min，可見絮狀DNA沉 淀；
[0051 ] (4)挑出沉淀至1.5ml離心管中，70%乙醇洗滌2~3次，每次5min;再用無水乙醇洗 滌1~2次；
[0052] (5)自然干燥DNA，溶解于500ulTE(10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH8·0)中 ；
[0053] (6)加入濃度為lOmg/mlRNaseA 2uL降解RNA，37°C消化lh;
[0054] (7)重復步驟(2)1 次，加入 1/10體積5mol/L CH3C00NH4;
[0055] (8)重復步驟(3)和(4)1次；
[0056] (9)待DNA自然干燥后，溶解于100-300uLTE中，-20°C長期保存。
[0057] (10)干燥DNA，加適量無菌水溶解，-20°C保存備用。采用DU800核酸分析儀和1%的 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量和片段大小，每個處理4次重復。
[0058] CTAB 提取法：
[0059] (1)將低溫處理過的斜紋夜蛾放入5ml的無菌研缽中，適當添加液氮用力將斜紋夜 蛾研成粉末；
[0060] (2)迅速將研成粉末的斜紋夜蛾轉移到無菌離心管中，并按l:8(w/v)的比例倒入 CTAB提取液，充分顛倒混勻；
[0061 ] (3)加入36ιι1β-巰基乙醇，迅速放入65°C水浴30min~45min，期間不時將離心管顛 倒混勻；
[0062] (4)按等體積加入飽和苯酚:氯仿：異戊醇=25:24:1 (v/v)混合液震蕩搖勻，靜置 10~15min，12000r/min 離心 10 分鐘；
[0063] (5)將上清液轉移到一支新的離心管中，加入處理過的Rnse，使終濃度達50ug/ml， 37°C 水浴 30min;
[0064] (6)12000r/min離心10分鐘后把上清液倒入新的離心管內，之后，按等體積加入飽 和苯酸:氯仿:異戊醇= 25:24: l(v/v)混合液，充分混勾，12000r/min離心10分鐘；
[0065] (7)將上清液移至一新的離心管，加入2/3體積的預冷異丙醇，顛倒數次，12000r/ min離心5分鐘，棄上清液；
[0066] (8)用70 %乙醇洗滌脫鹽，離心棄上清液；
[0067] (9)干燥DNA加適量無菌水溶解，-20 °C保存備用。采用DU800核酸分析儀和1 %的瓊 脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量和片段大小，每個處理4次重復。
[0068] b)RAPD反應檢測
[0069]用隨機引物S66和S98對所提取得斜紋夜蛾基因組DNA進行RAPD反應。反應體系為 (25μ1)：2.5μ1 10Xbuffer,2.Ommol · L,MgCl,160ymol · L dNTPs,0.74ymol · L primer, 20ng的基因組DNA，1.5U的Taq酶。反應擴增程序為:94 °C預變性5min，35個循環，每個循環包 括:94°C變性30s，36°C退火45s，72°C延伸2min，最后72°C終延伸lOmin。采用1%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測擴增效果，每個處理4次重復。
[0070]三、試驗結果
[0071 ] a)不同提取方法對斜紋夜蛾基因組DNA提取質量的影響 [0072] (1)電泳檢測斜紋夜蛾DNA
[0073] 采用電泳檢測對不同方法提取的斜紋夜蛾基因組DNA進行提取質量比較，可知采 用1 % CTAB法、2 % CTAB法、1 % SDS法、2 % SDS法四種方法均能提取斜紋夜蛾DNA，如圖1所示， 泳道從左到右依次為 1 % CTAB、1 % CTAB、1 % CTAB、1 % CTAB、2 % CTAB、2 % CTAB、2 % CTAB、2 % CTAB、l%SDS、l%SDS、l%SDS、l%SDS、2%SDS、2%SDS、2%SDS、2%SDS，23kb 處都有主帶。
[0074] (2)紫外分光光度計檢測斜紋夜蛾DNA的曲線圖
[0075] 如圖2所示，從不同方法提取D N A的得率來看，1 % S D S法的D N A得率最高 (252.775即/111)，其次是1%0^法的0嫩得率（179.751^/111)，0嫩得率第三的是2%303法 (165 · 5ng/ul)，得率最低的是2 % CTAB法。
[0076] 如表1所列數據，用分光光度計檢測DNA的純度，較高純度DNA的A260/280比值范圍 應在1.8-2.0之間。在A260比A280的值〈1.8時，DNA樣品中可能存在蛋白質污染；當A260/ A280>2.0時，DNA樣品中可能存在RNA污染。
[0077] 如圖3所示，四種提取方法的A260/A280的比值存在較大差異，1%CTAB法提取的 DNA，A260/A280的值等于1.8015，在1.8到2.0之間，在正常范圍之內；2%0^法提取的0嫩， A260/A280的值是2.03725，大于2.0，說明2 % CTAB法提取的DNA中存在RNA污染；1 % SDS法提 取的DNA，A260/A280的值是1.909，在較高純度0嫩的六260/280比值范圍之內；2%303法提取 得到的DNA，A260/A280的值是2.007，大于2.0，說明2 % CTAB法提取的DNA中存在RNA污染。 [0078] 表1不同提取方法基因組DNA測試結果
[0079]
[0080] 如圖4所示，A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，可對核酸樣品的純度進 行評估，純的DNA的A260/A230比值為2.5，如果A260/A230比值小于2.0則說明核酸樣品被碳 水化合物、鹽類污染。由圖4可知，四種DNA提取方法中，A260/A230比值都大于2.0，說明核酸 樣品中未受到碳水化合物及鹽類的污染。
[0081 ] b)斜紋夜蛾DNA的RAro擴增結果
[0082] 從隨機引物S66和S98對所提取得斜紋夜蛾基因組DNA進行PCR擴增后得到的結果 可知，用引物S66對四種提取方法提取的斜紋夜蛾基因組DNA進行擴增，發現只有1%CTAB 法、2 % CTAB和2 % SDS法所提出的DNA能被擴增出來，而1 % SDS所提取出的DNA未能被擴增出 來，由于PCR擴增對模板NDA的質量要求較高，未能擴增出來的NDA說明其質量不夠好，從而 說明1 %SDS法提取的斜紋夜蛾幼蟲DNA質量不好；用S98引物對所四種提取方法提取的斜紋 夜蛾基因組DNA進行擴增，發現只有CTAB法所提出的DNA能被擴增出來，說明CTAB法所提取 出來的斜紋夜蛾NDA完整性比SDS法更好。CTAB法提取的斜紋夜蛾幼蟲基因組DNA作為模板 可較好地用于PCR擴增進行RAH)分子標記的分析。
[0083]四、試驗總結
[0084] 從不同方法提取DNA的得率來看，雖然1 % SDS法提取的DNA得率在四種提取方法中 最高，A260/A280的值是1.909在1.8-2.0，也在正常范圍之內，但由于1 % SDS法提取的DNA不 能用于PCR擴增，所以1 %SDS法不是最適宜提取斜紋夜蛾幼蟲DNA的方法。2%SDS法提取的 DNA得率在四種方法中居第三，雖然2 % SDS提取出的斜紋夜蛾幼蟲基因組DNA能用于PCR擴 增，但該方法的A260/A280的值是2.007>2.0，不在正常范圍之內，說明2%SDS法提取的DNA 中存在RNA污染，所以此方法不能用來提取斜紋夜蛾幼蟲DNA。1 % CTAB法和2 %CTAB法所提 取出的斜紋夜蛾幼蟲DNA均能用于PCR擴增，但2 % CTAB法所提取出的斜紋夜蛾幼蟲DNA的 A260/A280的值是2.03725>2.0，說明2 % CTAB法提取的DNA中也存在RNA污染，此方法不能用 來提取斜紋夜蛾幼蟲DNA。綜上所述，1 %CTAB法是最適宜提取斜紋夜蛾幼蟲DNA的方法。
[0085] 本實驗通過4種不同的DNA提取方法的比較可知：改進的1 % CTAB法最適合斜紋夜 蛾幼蟲DNA的提取。斜紋夜蛾細胞內含有大量的蛋白質，這是影響DNA純度的主要原因，1 % CTAB法利用1%CTAB提取液以及飽和苯酚:氯仿:異戊醇= 25:24:1混合液去除組織蛋白，其 去除組織蛋白效果相對于單純用氯仿：異戊醇= 24:1混合液去除組織蛋白的效果要好很 多，因為在低溫條件下飽和苯酚與組織蛋白的結合使其變性的能力遠高于氯仿/異戊醇;為 了確保DNA的完整性和活性在操作過程中要求十分謹慎，搖晃樣品時不能太劇烈，以及異丙 醇高效沉淀DNA，最終較徹底去除雜質，得到高純度的基因組DNA，而且通過重復實驗，得到 的DNA條帶電泳檢測結果以及PCR擴增都較好，說明此方法較可靠、穩定，綜上說明1%CTAB 法是一種適宜鱗翅目幼蟲基因組DNA提取的方法。
[0086] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟①:將鱗翅目幼蟲放入無菌研缽中，然后添加液氮將鱗翅目幼蟲研成粉末； 步驟②:將所述步驟①中的粉末轉移到無菌離心管中，并倒入提取液，混勻，之后加入 β-巰基乙醇，60~70°C水浴30~45分鐘，混勻，得到混合液I; 步驟③:給所述步驟②中混合液I加入飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液，震蕩搖勻，靜置， 離心后取上清液到一支新的離心管中，然后加入核糖核酸酶，使濃度達50ug/ml，然后30~ 40 °C水浴20~40分鐘，得到混合液Π ; 步驟④:將所述步驟③中混合液Π 離心后取上清液到新的離心管內，加入飽和苯酚、氯 仿、異戊醇混合液，混勻，再次離心后取上清液至新的離心管，加入預冷異丙醇，混勻，離心 后棄上清液，得到混合液m; 步驟⑤:將所述步驟④中的混合液m洗滌脫鹽，離心后棄上清液，得到鱗翅目幼蟲基因 組DNA，最后加無菌水溶解，保存。2. 如權利要求1所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟 ②中提取液提取液為1 〇〇ml，其是由以下物質制成的：CTAB 1 g，NaCl 28ml，EDTA(0.5mo 1/L， PH 8.0)4ml，Tris_HCl(lmol/L，PH 8.0)10ml，β-疏基乙醇lml，最后加水定容至 100ml。3. 如權利要求2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟 ② 中加入提取液的比例為粉末:提取液=1:8 (w/v )，所述步驟②中加入β-巰基乙醇的量為 36ul，水浴時溫度為65°C。4. 如權利要求3所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟 ③ 和步驟④中加入苯酚，氯仿，異戊醇混合液時等體積加入苯酚:氯仿：異戊醇=25 : 24:1 (v/v)的混合液。5. 如權利要求1或2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步 驟③中靜置時間為10~15分鐘，所述步驟③、步驟④和步驟⑤中離心操作為12000r/min離 心10分鐘。6. 如權利要求1或2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步 驟③中水浴時溫度為37 °C，水浴時間為30分鐘。7. 如權利要求1或2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步 驟⑤中洗滌脫鹽時用70 %乙醇。
【文檔編號】C12N15/10GK106086004SQ201610565959
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月18日
【發明人】劉佳妮, 余磊, 張瑜瑜, 徐勝光, 陳澤斌, 華金珠, 姚麗媛
【申請人】昆明學院