復合穩定劑及添加該復合穩定劑的nmn轉移酶的酶活測定方法
【專利摘要】本發明提供了一種復合穩定劑及添加該復合穩定劑的NMN轉移酶的酶活測定方法，具有這樣的特征，該方法包括以下步驟：步驟一，制備粗酶液；步驟二，將制備得到的粗酶液分裝于多個離心管中，向其中一部分離心管中加入保護劑，向另一部分離心管中加入雙蒸水；步驟三，向兩部分離心管中分別加入緩沖溶液、底物以及金屬離子，混勻后置于水浴鍋中反應，加入EDTA反應后，離心，去除沉淀，取上清液；步驟四，取上清液并測定反應產物的吸光值；步驟五，以未加保護劑的粗酶液為對照，得到相對酶活力。本發明復合穩定劑由常見的組分組成，成分簡單、成本低廉，能有效提高NMN轉移酶的穩定性，并且應用前景廣闊；NMN轉移酶的酶活測定方法簡單實用，效果直觀。
【專利說明】
復合穩定劑及添加該復合穩定劑的NMN轉移酶的酶活測定方法
技術領域
[0001]本發明涉及微生物工程領域，具體涉及一種復合穩定劑及添加該復合穩定劑的NMN轉移酶的酶活測定方法。
【背景技術】
[0002]NMN轉移酶(Nmnat)在生物體生命活動中起著十分重要的作用，是一類有助于多種蛋白復合裝配、蛋白折疊以及蛋白損傷后再折疊的蛋白質，可以在蛋白折疊過程中與三磷酸腺苷(ATP)相耦聯，利用煙酰胺單核苷酸(NMN)生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和NAAD，維持體內NAD的平衡;也是一種指示蛋白和應激反應蛋白，可作為生物藥劑的靶標和調控目的基因的轉錄合成。大量研究表明，NMN轉移酶在自然界中來源極為廣泛，主要是植物、動物、微生物，如此豐富的資源，以及人類對NMN轉移酶研究的不斷深入，使得NMN轉移酶在醫藥、生物、工業生產等領域得到了廣泛應用。
[0003]匪N轉移酶作為一種同源性蛋白，在生產、加工和貯存過程，由于外界因素，如溫度、有機溶劑、PH、金屬離子、酶修飾、降解等影響，均易導致酶穩定性降低，甚至失活。酶制劑容易失活，已成為限制其工業生產和應用的重要因素，因此提高NMN轉移酶的熱穩定性、減少失活率和延長貯存期是當前研究重點。
[0004]目前提高酶穩定性的方法主要有化學修飾、固定化和添加保護劑等。然而，化學修飾主要對酶蛋白肽鏈上某些殘基進行共價修飾，會引起酶活性的改變;盡管酶的固定化處理后穩定性增加，易從反應中分離，能反復多次使用，便于運輸和貯存，利于自動化生產，但是酶的活性降低，使用范圍減小。因此，目前酶的穩定化方法最常用的是添加保護劑，但對NMN轉移酶添加保護劑，尚未有人進行過。
【發明內容】
[0005]本發明是為了解決上述問題而進行的，目的在于提供一種復合穩定劑作為保護劑來提高NMN轉移酶的穩定性。
[0006]本發明采用的技術方案如下:
[0007]本發明提供了一種復合穩定劑，用于提高NMN轉移酶的穩定性，其特征在于，包含:濃度為0.5?1.5g/L的山梨醇，濃度為0.5?1.5g/L的海藻酸鈉，體積分數為0.5?1.5%的二甲基亞砜。
[0008]進一步的，本發明還提供了一種NMN轉移酶的酶活測定方法，采用上述的復合穩定劑作為保護劑，其特征在于，包括以下步驟:步驟一，制備NMN轉移酶的粗酶液;步驟二，將制備得到的NMN轉移酶的粗酶液分裝于多個I?2mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入預定量的保護劑，向另一部分離心管中加入與保護劑相同的量的雙蒸水;步驟三，向兩部分離心管中分別加入等量的緩沖溶液、底物以及金屬離子，分別混勻后置于30?40°C的水浴鍋中反應I?2h，加入乙二胺四乙酸(EDTA)反應5?1min后，在轉速為4000?8000r/min條件下離心I?5min，去除沉淀，取上清液;步驟四，取上清液并在340nm處測定反應產物的吸光值0D34q，吸光值ODmq代表NMN轉移酶酶活力的大小；步驟五，以未加保護劑的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0009]在本發明提供的匪N轉移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟一中，NMN轉移酶的粗酶液的制備方法包括以下子步驟:子步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養基上，在35?40 °C的條件下培養12?18h，得到含有大腸桿菌的固體培養基；子步驟二，取一定量的LB培養基溶于雙蒸水中，調節其pH值為6.0?8.0，在121°C條件下滅菌15?30min，得到濃度為20?30g/L的活化液;子步驟三，在無菌環境下從固體培養基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為20?40yg/ml的硫酸卡那霉素，在35?40°C條件下培養過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;子步驟四，將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分數為I?5%的接種量接入經過滅菌的發酵培養基中，在溫度為35?400C，搖床轉速為180?200r/min的條件下，發酵培養至OD6qq為0.5?0.7時，加入終濃度為5?lOmmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為20?30°C，搖床轉速為150?200r/min條件下，誘導培養8?12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發酵液;子步驟五，將發酵液放置于離心管中，在8000?12000r/min條件下離心攪拌5?lOmin，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的菌體沉淀。子步驟六，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;子步驟七，破壁后的菌體在轉速為8000?12000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心15?30min，收集上清液，上清液為NMN轉移酶的粗酶液。
[0010]在本發明提供的匪N轉移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟二中，預定量為100yL。
[0011]在本發明提供的匪N轉移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟三中，緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液，底物為煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)，金屬離子為Mn2
+
O
[0012]在本發明提供的匪N轉移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在步驟三中，乙二胺四乙酸的質量濃度為0.155moI/L，加入的體積為10yL。
[0013]在本發明提供的匪N轉移酶的酶活測定方法中，還可以具有這樣的特征，其中，在子步驟一中，固體培養基的制備方法為:將濃度為25g/L的LB培養基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調節pH為7.0，在121°C條件下高壓滅菌20min，得到固體培養基。
[0014]發明的作用與效果
[0015]本發明提供了一種復合穩定劑及添加該復合穩定劑的匪N轉移酶的酶活測定方法，該復合穩定劑包含山梨醇、海藻酸鈉以及二甲基亞砜這些常見組分，成分簡單、成本低廉，能有效提高NMN轉移酶的穩定性，并且應用前景廣闊。另外，本發明的NMN轉移酶的酶活測定方法采用對照實驗比較穩定劑對NMN轉移酶的穩定性作用，方法簡單實用，效果直觀。
【具體實施方式】
[0016]以下結合實施例進一步闡述本發明，對于實施例中所用到的具體方法或材料，本領域技術人員可以在本發明技術思路的基礎上，根據已有的技術進行常規的替換選擇，而不僅限于本發明實施例的具體記載。
[0017]實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均視為常規方法;所使用的材料、試劑等，如無特別說明，均可從商業途徑得到。
[0018]固體培養基:將濃度為25g/L的LB培養基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500mI的錐形瓶中，加入NaOH調節pH為7.0，在12 TC條件下高壓滅菌20miη，得到固體培養基。
[0019]發酵培養基成分:濃度為24g/L的酵母粉，濃度為12g/L的胰蛋白胨，濃度為4ml/L的甘油，濃度為2.31g/L KH2PO4以及濃度為12.54g/L的K2HPO^
[0020]實施例一
[0021]1、復合穩定劑
[0022]本實施例的復合穩定劑包含:濃度為1.5g/L的山梨醇，濃度為1.0g/L的海藻酸鈉，體積分數為0.5 %的二甲基亞砜。
[0023]2、酶活測定方法
[0024]采用上述成分含量的復合穩定劑作為保護劑來提高NMN轉移酶的穩定性，NMN轉移酶的酶活測定方法包括以下步驟:
[0025]步驟一，制備NMN轉移酶的粗酶液:將大腸桿菌劃線接種到固體培養基上，在37V的條件下培養12h，得到含有大腸桿菌的固體培養基;取一定量的LB培養基溶于雙蒸水中，調節其PH值為7.0，在121°C條件下滅菌20min，得到濃度為25g/L的活化液;在無菌環境下從固體培養基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為30yg/ml的硫酸卡那霉素，在37°C條件下培養過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分數為I %的接種量接入經過滅菌的發酵培養基中，在溫度為37°C，搖床轉速為200r/min的條件下，發酵培養至0D6QQ為0.6時，加入終濃度為8mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為25°C，搖床轉速為180r/min條件下，誘導培養8h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發酵液;將發酵液放置于離心管中，在溫度為4°C、轉速為8000r/min條件下離心攪拌6min，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的菌體沉淀，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;破壁后的菌體在轉速為12000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心20min，收集上清液，上清液即為NMN轉移酶的粗酶液。
[0026]步驟二，將制備得到的匪N轉移酶的粗酶液分裝于多個ImL的離心管中，向其中一部分離心管中加入10yL的保護劑，向另一部分離心管中加入10yL的雙蒸水；
[0027]步驟三，向兩部分離心管中分別加入lmol/L PH7.5的Tris-HCl緩沖液、煙酰胺單核苷酸腺苷(匪N)、Mn2+，分別混勻后置于37°C的水浴鍋中反應2h，加入10yL質量濃度為
0.155mol/L為乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反應5min后，在轉速為8000r/min條件下離心lmin，去除沉淀，取上清液；
[0028]步驟四，取上清液并在340nm處測定反應產物的吸光值ODmq，吸光值ODmq代表NMN轉移酶酶活力的大小；
[0029]步驟五，以未加保護劑的NMN轉移酶的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0030]實施例一作用與效果
[0031]根據本實施例的NMN轉移酶的酶活測定方法，其中添加了本實施例成分含量的復合穩定劑作為保護劑的相對酶活為114.23%，未添加保護劑的酶活為15.8%。
[0032]實施例二
[0033]1、復合穩定劑
[0034]該復合穩定劑包含:濃度為1.0g/L的山梨醇，濃度為0.5g/L的海藻酸鈉，體積分數為1.5%的二甲基亞砜。
[0035]2、酶活測定方法
[0036]采用上述成分含量的復合穩定劑作為保護劑來提高NMN轉移酶的穩定性，NMN轉移酶的酶活測定方法包括以下步驟:
[0037]步驟一，制備NMN轉移酶的粗酶液:將大腸桿菌劃線接種到固體培養基上，在35°C的條件下培養16h，得到含有大腸桿菌的固體培養基;取一定量的LB培養基溶于雙蒸水中，調節其PH值為6.0，在121°C條件下滅菌15min，得到濃度為20g/L的活化液;在無菌環境下從固體培養基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為20yg/ml的硫酸卡那霉素，在35°C條件下培養過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分數為3%的接種量接入經過滅菌的發酵培養基中，在溫度為35°C，搖床轉速為180r/min的條件下，發酵培養至0D6QQ為0.5時，加入終濃度為5mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為20°C，搖床轉速為150r/min條件下，誘導培養10h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發酵液;將發酵液放置于離心管中，在溫度為4°C、轉速為10000r/min條件下離心攪拌5min，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的菌體沉淀，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;破壁后的菌體在轉速為10000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心15min，收集上清液，上清液即為NMN轉移酶的粗酶液。
[0038]步驟二，將制備得到的匪N轉移酶的粗酶液分裝于多個2mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入10yL的保護劑，向另一部分離心管中加入10yL的雙蒸水；
[0039]步驟三，向兩部分離心管中分別加入lmol/L PH7.5的Tris-HCl緩沖液、煙酰胺單核苷酸腺苷(匪幻1112+，分別混勻后置于30°(:的水浴鍋中反應111，加入10(^1質量濃度為0.155mol/L為乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反應8min后，在轉速為6000r/min條件下離心3min，去除沉淀，取上清液；
[0040]步驟四，取上清液并在340nm處測定反應產物的吸光值ODmq，吸光值ODmq代表NMN轉移酶酶活力的大小；
[0041 ] 步驟五，以未加保護劑的NMN轉移酶的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0042]實施例二作用與效果
[0043]根據本實施例的NMN轉移酶的酶活測定方法，其中添加了本實施例成分含量的復合穩定劑作為保護劑的相對酶活為102.90%，未添加保護劑的酶活為15.8%。
[0044]實施例三
[0045]1、復合穩定劑
[0046]該復合穩定劑包含:濃度為0.5g/L的山梨醇，濃度為1.5g/L的海藻酸鈉，體積分數為1.0%的二甲基亞砜。
[0047]2、酶活測定方法
[0048]采用上述成分含量的復合穩定劑作為保護劑來提高NMN轉移酶的穩定性，NMN轉移酶的酶活測定方法包括以下步驟:
[0049]步驟一，制備NMN轉移酶的粗酶液:將大腸桿菌劃線接種到固體培養基上，在40°C的條件下培養18h，得到含有大腸桿菌的固體培養基;取一定量的LB培養基溶于雙蒸水中，調節其PH值為8.0，在121°C條件下滅菌30min，得到濃度為30g/L的活化液;在無菌環境下從固體培養基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為30yg/ml的硫酸卡那霉素，在40°C條件下培養過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分數為5%的接種量接入經過滅菌的發酵培養基中，在溫度為40°C，搖床轉速為190r/min的條件下，發酵培養至OD6qq為0.7時，加入終濃度為10mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為30°C，搖床轉速為200r/min條件下，誘導培養12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發酵液;將發酵液放置于離心管中，在溫度為4°C、轉速為12000r/min條件下離心攪拌lOmin，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的菌體沉淀，向菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數次使菌體均勻懸浮，再用超聲波破碎菌體;破壁后的菌體在轉速為8000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心30min，收集上清液，上清液即為NMN轉移酶的粗酶液。
[0050]步驟二，將制備得到的NMN轉移酶的粗酶液分裝于多個1.5mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入10yL的保護劑，向另一部分離心管中加入10yL的雙蒸水；
[0051 ] 步驟三，向兩部分離心管中分別加入lmol/L PH7.5的Tris-HCl緩沖液、煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)、Mn2+，分別混勻后置于40 V的水浴鍋中反應1.5h，加入10yL質量濃度為
0.155mol/L為乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反應1min后，在轉速為4000r/min條件下離心5min，去除沉淀，取上清液；
[0052]步驟四，取上清液并在340nm處測定反應產物的吸光值ODmq，吸光值ODmq代表NMN轉移酶酶活力的大小；
[0053]步驟五，以未加保護劑的NMN轉移酶的粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。
[0054]實施例三作用與效果
[0055]根據本實施例的NMN轉移酶的酶活測定方法，其中添加了本實施例成分含量的復合穩定劑作為保護劑的相對酶活為91.62%，未添加保護劑的酶活為15.8%。
[0056]以上實施例僅為本發明構思下的基本說明，不對本發明進行限制。而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種復合穩定劑，用于提高NMN轉移酶的穩定性，其特征在于，包含: 濃度為0.5?1.5g/L的山梨醇，濃度為0.5?1.5g/L的海藻酸鈉，體積分數為0.5?1.5%的二甲基亞砜。2.—種匪N轉移酶的酶活測定方法，采用權利要求1所述的復合穩定劑作為保護劑，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，制備NMN轉移酶的粗酶液； 步驟二，將制備得到的所述粗酶液分裝于多個I?2mL的離心管中，向其中一部分離心管中加入預定量的所述保護劑，向另一部分離心管中加入與所述保護劑相同的量的雙蒸水； 步驟三，向兩部分離心管中分別加入等量的緩沖溶液、底物以及金屬離子，分別混勻后置于30?40 °C的水浴鍋中反應I?2h，加入乙二胺四乙酸(EDTA)反應5?1min后，在轉速為4000?8000r/min條件下離心I?5min，去除沉淀，取上清液； 步驟四，取所述上清液并在340nm處測定反應產物的吸光值OD34Q，所述吸光值OD34Q代表NMN轉移酶酶活力的大小； 步驟五，以未加所述保護劑的所述粗酶液為對照100%，得到相對酶活力。3.根據權利要求2所述NMN轉移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟一中，所述NMN轉移酶的粗酶液的制備方法包括以下子步驟: 子步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養基上，在35?40 0C的條件下培養12?18h，得到含有大腸桿菌的固體培養基； 子步驟二，取一定量的LB培養基溶于雙蒸水中，調節其pH值為6.0?8.0，在121°C條件下滅菌15?30min，得到濃度為20?30g/L的活化液； 子步驟三，在無菌環境下從所述固體培養基上挑取大腸桿菌接種到所述活化液中，并加入終濃度為20?40yg/ml的硫酸卡那霉素，在35?40°C條件下培養過夜，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體； 子步驟四，將所述含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分數為I?5%的接種量接入經過滅菌的發酵培養基中，在溫度為35?40 °C，搖床轉速為180?200r/min的條件下，發酵培養至0D6QQ為0.5?0.7時，加入終濃度為5?10mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為20?300C，搖床轉速為150?200r/min條件下，誘導培養8?12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發酵液； 子步驟五，將所述發酵液放置于離心管中，在8000?12000r/min條件下離心攪拌5?lOmin，收集含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的菌體沉淀。 子步驟六，向所述菌體沉淀中加入PH7.5的磷酸鹽緩沖溶液，用移液槍吹吸數次使菌體均勾懸浮，再用超聲波破碎所述菌體； 子步驟七，破壁后的所述菌體在轉速為8000?12000r/min，溫度4°C條件下，冷凍離心15?30min，收集上清液，所述上清液為所述NMN轉移酶的粗酶液。4.根據權利要求2所述NMN轉移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟二中，所述預定量為10yL。5.根據權利要求2所述NMN轉移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟三中，所述緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液，所述底物為煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)，所述金屬離子為Mn2+。6.根據權利要求2所述NMN轉移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在步驟三中，所述乙二胺四乙酸的質量濃度為0.155mol/L，加入的體積為lOOyL。7.根據權利要求3所述NMN轉移酶的酶活測定方法，其特征在于: 其中，在子步驟一中，所述固體培養基的制備方法為:將濃度為25g/L的LB培養基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調節pH為7.0，在121°C條件下高壓滅菌20min，得到所述固體培養基。
【文檔編號】C12N9/12GK106085996SQ201610435404
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】段琳琳, 李紅梅, 袁飛飛, 亢涵
【申請人】上海理工大學