雙鏈dna酶、其編碼核苷酸及該酶的制備方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一種堪察加擬石蟹來源的雙鏈DNA酶及其制備方法，包括表達質粒構建，表達菌株構建，蛋白表達和純化方法以及雙鏈DNA酶活性測定方法。編碼該雙鏈DNA酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明中公開的雙鏈DNA酶可用于RT?PCR技術中，特異性地去除雙鏈DNA模板，在生物技術領域具有重要的應用。
【專利說明】
雙鏈DNA酶、其編碼核苷酸及該酶的制備方法與應用
技術領域
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種雙鏈DNA酶、其編碼核苷酸及該酶的制備 方法與應用。
【背景技術】
[0002] 逆轉錄PCR或者稱為反轉錄PCR(reverse transcription-PCR，RT_PCR)，是聚合酶 鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再 以此為模板通過PCR進行DNA擴增。由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作"逆轉錄"，由 依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉錄酶)來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴 DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶Η降解，留下 互補DNA。
[0003] RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNAdRT-PCR廣泛 應用于遺傳病的診斷，檢測基因表達的方法，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。real-time PCR(實時熒光PCR)技術也被用來做定量分析，它們比普通PCR進行定量分析時靈敏度 更高，定量更精確。RT-PCR檢測的關鍵步驟是反轉錄后的cDNA模板中不應含有雙鏈DNA污 染，因此需要有一種特異性酶解雙鏈DNA的酶，此酶不降解單鏈cDNA。
【發明內容】
[0004] 為了解決RT-PCR檢測cDNA模板中有可能污染的基因組DNA的問題，本發明提供了 一種具有特異性的雙鏈DNA酶及其應用，具體通過以下技術方案實現：
[0005] 本發明提供了一種編碼雙鏈DNA酶的核苷酸，核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發明還提供了一種表達雙鏈DNA酶的重組質粒，該重組質粒包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
[0007] 進一步地，上述重組質粒的融合蛋白表達載體為pET28a-NusA-TEV。
[0008] 本發明還提供了一種重組表達轉化體，其特征在于，該轉化體包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
[0009] 本發明還提供了一種雙鏈DNA酶，該雙鏈DNA酶包含由如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列編碼的氨基酸序列。
[0010]本發明還提供了上述雙鏈DNA酶的制備方法，包括以下步驟：
[0011]步驟1、人工合成如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，并在該核苷酸序列的5'端和 3'端分別設置限制性內切酶位點，將得到的核苷酸序列克隆至融合蛋白表達載體，測序，得 到包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的質粒；
[0012] 步驟2、將步驟1中得到的所述質粒轉化入表達菌株，進行蛋白表達，并使用rTEV酶 酶解該蛋白，按照1U rTEV酶加入3ug NusA-dsDNase蛋白比例，在lXrTEV Buffer(50mM Tris，pH8.0,0.5mM EDTA，lmM DTT)中3(TC酶解lh。
[0013] 使用肝素柱和鎳柱純化酶解得到的蛋白。
[0014] 進一步地，上述步驟1中，設置在所述5'端的限制性內切酶位點為EcoR I，設置在 所述3 '端的限制性內切酶位點為Xho I。
[0015] 進一步地，上述步驟2中，表達菌株為大腸桿菌表達菌株Rosseta(DE3)。
[0016]優選地，該雙鏈DNase的制備方法包括以下步驟：
[0017] 步驟1、人工合成SEQ ID NO. 1序列，并在該序列的5'端和3'端分別設置限制性內 切酶位點EcoR I和Xho I，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體pET28a-NusA-TEV，測序， 得到包含該SEQ ID N0.1 序列的質粒pET28a-NusA-TEV-dsDNase;
[0018] 步驟2、將步驟1中得到的質粒pET28a-NusA-TEV-dsDNase轉化入大腸桿菌表達菌 株R〇SSeta(DE3)，進行蛋白表達，并使用rTEV酶酶解該蛋白，使用肝素柱和鎳柱純化蛋白。
[0019] 本發明還提供了一種特異性酶解雙鏈DNA的試劑盒，該試劑盒包括上述雙鏈DNA酶 和酶解反應緩沖液。
[0020] 最后，本發明還提供了上述試劑盒在PCR技術中的應用以下將結合附圖對本發明 作進一步說明，以充分說明本發明的目的、技術特征和技術效果。
【附圖說明】
[0021] 圖1示出了本發明一個較佳實施例中制備的雙鏈DNA酶的活性檢測實驗結果，其 中：
[0022] l-2ug pUC19質粒DNA加入5U雙鏈DNA酶37°C酶解30min
[0023] 2_2ug pUC19質粒DNA
[0024] 3-0.5呢〇)(174單鏈0嫩加入51]雙鏈0嫩酶37°(：酶解301^11
[0025] 4-〇.5ug〇X174 單鏈 DNA
[0026] 5-lug 293總RNA加入5U雙鏈DNA酶37°C酶解30min
[0027] 6-lug 293總RNA。
【具體實施方式】
[0028] 以下通過具體的實施例對本發明的技術方案做進一步的描述。以下的實施例是對 本發明的進一步說明，而不是限制本發明的范圍。
[0029] 1、雙鏈DNA酶人工基因合成
[0030] 雙鏈DNA酶具體的DNA序列如下（SEQ ID N0.1):
[0031] ATGGCCAACATGGAGTCCAAGCAAGGAATAATGGTTTTGGGATTCTTAATTGTCCTCCTCTTCGTGTCT GTCAATGGCCAGGACTGTGTGTGGGACAAGGACACGGACTTTCCCGAGGACCCGCCACTCATTTTCGATTCAAACTT GGAGCTCATCAGACCCGTCTTGGAAAATGGCAAAAGGATCGTCAGTGTCCCCAGTGGCAGCAGCTTAACCTTGGCCT GCTCTGGGTCTGAACTGATCAACCTGGGCATGGAGGCGGTGGAAGCCAAGTGTGCTGGGGGAGTCATGCTTGCCATA GAAGGAACGGAGTGGGAGATCTGGAGCCTGGGGTGCAGCAACCACGTGAAGGAGACCATCCGCCGCAACCTTGGAAC ATGTGGGGAAGCGGACCAGGGGGATAGGCACAGTATTGGCTTCGAGTACTACGGTGGCTCCATCTATTATGAACTGA TCAGCGTGTGTTTCGGGCCCGTGTCCGAAACAACCTTGCGCACCGAGCATGTCCTCCACGGCGCCAACATTGCCGCC AAGGACATCGAGACCTCCCGCCCCTCCTTCAAGACCTCCACCGGGTTCTTCAGCGTCTCCATGTCCACCGTCTACAG CCAGGCGTCACAGCTGCAGTTAATGACAGACATATTGGGAGATTCGGATCTAGCCAACAACATCATCGACCCCTCCC AACAGTTGTACTTCGCCAAAGGTCACATGTCTCCTGACGCAGACTTTGTGACGGTGGCAGAACAGGACGCCACCTAC TACTTCATCAACGCCCTACCGCAGTGGCAGGCCTTCAATAATGGCAACTGGAAGTACCTAGAATACGCGACCCGAGA CCTGGCCGAATCCCACGGTAGCGACCTGCGAGTGTATAGCGGAGGGTGGAGCCTGCTGCAGCTAGATGATATTAACG GCAACCCCGTGGACATCCTGCTGGGACTGTCTGAGGGCAAGGAGGTCGTGCCCGTTCCATCCCTCACTTGGAAGGTG GTTTACGAAGAGAGCAGCAGCAAAGCGGCCGCGATCGTCGGTATCAACAACCCTCACATCACCACCGCCCCCTCCCC CTTGTGTTCCGACCTGTGCTCCTCCTTGACCTGGATAGACTTCAACCTGGACGACCTGGCTCACGGGTACACCTACT GTTGTGCCGTAGATGACCTCCGGCAGGCCATACCCTATATCCCGGACCTGGGCAATGTCGGACTCCTCACTAAC
[0032] 將編碼上述雙鏈DNA酶的核苷酸序列通過人工基因合成的方法合成，并在此核苷 酸序列5 '端加上E c 〇 R I限制性內切酶位點G A A T T C，3 '端加上Xh ο I限制性內切酶位點 CTCGAG，通過EcoR I和Xho I雙酶切、割膠回收、T4連接酶連接克隆至蛋白表達載體pET28a-NusA-TEV。雙鏈DNA酶完整編碼區為1221bp，共含有407個氨基酸，表達蛋白的理論分子量為 44539Da.
[0033] 2、雙鏈DNA酶蛋白的表達與純化
[0034]將測序正確的雙鏈DNA酶質粒轉化入大腸桿菌表達菌株R〇SSeta(DE3)，挑取單菌 落接種至50ml LB液體培養基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選， 37°C，200rpm培養過夜。第二天按照2:100比例轉接至250ml LB液體培養基，加入卡那霉素 終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選，共轉接4瓶，37°C，200rpm培養至菌液0D600檢 測數值為〇. 8時加入誘導劑異丙基-β-D硫代半乳糖苷使其終濃度為0.1-0.5mM，誘導培養4h 后，4°C7000rpm離心收集菌體。將此菌體按照每克加入40ml的比例懸浮于20mM Tris. Cl， pH8.0，300mM NaCl，10 %Glycero 1裂解緩沖液，超聲前加入終濃度ImM苯甲基磺酰氟，超聲 波破碎儀進行菌體破碎。超聲裂解條件為超聲3秒間隔5秒，30 %超聲功率，超聲15min。當菌 液變得清亮時離心收集上清液，取樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并采用鎳柱純化雙鏈 DNA酶蛋白，用rTEV酶酶解純化的雙鏈DNA酶蛋白，按照1U rTEV酶加入3ug NusA-dsDNase蛋 白比例，在lXrTEV Buffer(50mM Tris，pH8.0,0.5mM EDTA，lmM DTT)中30°C酶解lh。再用 肝素柱進行純化，具體純化操作步驟參照肝素柱和Ni NTA Beads 6FF說明書進行，獲得純 度約95 %的雙鏈DNA酶蛋白。
[0035] 3、雙鏈DNA酶活性測定
[0036] 將純化后的雙鏈DNA酶分別與雙鏈DNA(pUC 19質粒DNA)、單鏈DNA( Φ X174單鏈 DNA)、RNA(293總RNA)在20mM Tris.Cl，pH8.0,5mM MgCl2反應體系中進行酶切反應，37°C溫 育30min。結果顯示雙鏈DNA酶能夠很好酶解雙鏈DNA，對單鏈DNA和RNA沒有酶解，如附圖1所 不。
[0037]以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種編碼雙鏈DNA酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -種表達雙鏈DNA酶的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒包含如SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列。3. 根據權利要求2所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的融合蛋白表達載體為 pET28a-NusA-TEV。4. 一種重組表達轉化體，其特征在于，所述重組表達轉化體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。5. -種雙鏈DNA酶，其特征在于，所述雙鏈DNA酶包含由如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列編碼的氨基酸序列。6. 根據權利要求5所述的雙鏈DNA酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下 步驟： 步驟1、人工合成如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并在所述核苷酸序列的5'端和3' 端分別設置限制性內切酶位點，將得到的核苷酸序列克隆至融合蛋白表達載體，測序，得到 包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的質粒； 步驟2、將步驟1中得到的所述質粒轉化入表達菌株，進行蛋白表達，并使用rTEV酶酶解 所述蛋白，所述rTEV酶酶解去除N端融合蛋白，釋放出可溶性雙鏈DNA酶，使用肝素柱和鎳柱 純化酶解得到的蛋白。7. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中，設置在所述5'端的限制 性內切酶位點為EcoR I，設置在所述3'端的限制性內切酶位點為Xho I。8. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2中，所述表達菌株為大腸桿 菌表達菌株R〇sseta(DE3)。9. 一種特異性酶解雙鏈DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括根據權利要求5所 述的雙鏈DNA酶和酶解反應緩沖液。10. 根據權利要求9所述的試劑盒在PCR技術中的應用。
【文檔編號】C12N9/22GK106085986SQ201610411175
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日 公開號201610411175.0, CN 106085986 A, CN 106085986A, CN 201610411175, CN-A-106085986, CN106085986 A, CN106085986A, CN201610411175, CN201610411175.0
【發明人】曹平生
【申請人】翌圣生物科技（上海）有限公司