多肽，分離的其多核苷酸，以及包含多肽的添加劑、其用途及方法

多肽，分離的其多核苷酸，以及包含多肽的添加劑、其用途及方法
【專利摘要】以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其是具有選自SEQ ID No.1?15的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40％；以及包含所述多肽的添加劑；以及編碼所述多肽的分離的多核苷酸；以及用于用所述多肽來以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方法。
【專利說明】多肽，分離的其多核苷酸，以及包含多肽的添加劑、其用途及 方法
[00011 本申請是申請日為2014年8月27日、申請號為201480055221.7、發明名稱為"用于 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，分離的其多核苷酸，以及 包含多肽的添加劑、其用途及方法"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生 物的多肽，編碼此類多肽的分離的多核苷酸，以及包含此類多肽的添加劑，還涉及此類多肽 的用途，以及涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物 的方法。
[0003] 真菌毒素是絲狀真菌產生的次生代謝物。其一個重要的代表是世界范圍傳播的玉 米赤霉烯酮(ZEN)(以前稱為F-2毒素），其由許多鐮孢菌真菌產生。這些真菌尤其侵染栽培 植物，例如各種各樣的谷類，其中真菌侵染通常出現在收獲之前，其中真菌生長或真菌毒素 產生可以在收獲之前發生，或者在不適當的貯藏的情況下也可以在收獲之后發生。FA0估 計，在世界范圍內25%的農產品被真菌毒素污染，這導致巨大的經濟損失。在一項最近在世 界范圍內進行的研究中，從2009年1月至2011年12月分析了總共23，781個樣品，其中81 %經 測試為對于至少一種真菌毒素來說陽性和45%對于ZEN來說陽性。可以在世界的所有地區 中，同樣地在所有經測試的谷物類別和飼料類別，例如玉米、大豆粉、小麥、麥麩、DDGS(干酒 糟）中，以及在預制飼料混合物中，以直至100%的頻率發現ZEN。
[0004] ZEN是一種非甾類的、雌激素的、大環的、通過聚酮化合物物質代謝途徑合成的內 酯，其具有下述結構式：
[0005]
[0006] 和IUPAC命名名稱"(2E，llS)-15，17-二羥基-ll-甲基-12-氧雜雙環[12·4·0]十八 碳-1(18)，2,14,16-四烯-7,13-二酮"。
[0007] 然而，在自然界中還存在有許多ZEN衍生物，其通過ZEN的酶促或化學修飾而形成。 關于此的例子為糖苷式的或含硫酸酯的ZEN綴合物，其由真菌、植物或哺乳動物代謝來形 成；以及ZEN代謝物，其尤其在人或動物機體中形成。在下文中，ZEN衍生物是指在自然界中 存在的或者通過化學或生物化學合成而制備的ZEN綴合物或ZEN代謝物，但特別地是指α-玉 米赤霉烯醇(α-ZEL ;(2E，7R，llS)-7，15，17-三羥基-ll-甲基-12-氧雜雙環[12·4·0]十八 碳-l(18)，2，14，16-四烯-13-酮）、β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL ;(2E，7S，llS)-7，15，17-三羥基-ll-甲基-12-氧雜雙環[12.4.0]十八碳-l(18)，2，14，16-四烯-13-酮）、a-玉米赤霉醇( a-2八1^(71?，113)-7，15，17-三羥基-11-甲基-12-氧雜雙環[12.4.0]十八碳-1(18)，14，16-三 烯-13-酮）、β-玉米赤霉醇（0-241^(73，113)-7，15，17-三羥基-11-甲基-12-氧雜雙環 [12.4.0]十八碳-l(14)，15，17-三烯-13-酮）、玉米赤霉烯酮-14-硫酸酯(Z14S;[(2E，llS)- 15-羥基-11-甲基-7,13-二氧代-12-氧雜雙環[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-17-基]硫酸氫酯）、玉米赤霉烯酮-14-糖苷(Z14G;(2E，11S)-15-羥基-11-甲基-17-[(3R，4S， 53,610-3,4,5-三羥基-6-(羥甲基）四氫吡喃-2-基]氧基-12-氧雜雙環[12.4.0]十八碳-1 (18)，2，14，16-四烯-7，13-二酮）以及玉米赤霉酮(2厶1(113)-15，17-二羥基-11-甲基-12_ 氧雜雙環[12.4.0]十八碳-1(18)，14,16-三烯-7,13-二酮）。
[0008] ZEN，同樣地還有ZEN衍生物，尤其是α-ZEL、β-ZEL、Z14S、α-ZAL、β-ZAL、Z14G和ZAN， 由于其高的化學和物理穩定性而還可以在經加工的食品或飼料例如面包或啤酒中檢測到。
[0009] ZEN與雌激素受體結合并且可以引起激素紊亂，其中它在經口攝取后立即被吸收， 并且被哺乳動物轉變為兩個立體異構的代謝物，分別為a-ZEL和β-ZEL。在此，例如a-ZEL，還 有a-ZAL或ZAN具有比ZEN強得多的動情效應。經綴合的ZEN衍生物有時具有比ZEN低的雌激 素活性，然而如果情況可能，ZEN可以從這些ZEN衍生物中重新被釋放到消化道中。
[0010]雖然ZEN具有相對低的急性毒性并且具有直至20，000mg/kg體重的口服LD50值，但 是在較長期攝入的情況下在動物或人中出現亞急性和/或亞慢性的毒性效應，例如致畸形 的、致癌的、動情的和免疫抑制的效應。被ZEN污染的飼料導致哺乳動物中的發育障礙，其中 豬，特別是幼豬對于ZEN是極其敏感的。超過0.5ppm的在飼料中的ZEN濃度導致發育障礙，其 中例如超過1.5ppm的濃度可以導致豬中的超雌激素活性，和12ppm ZEN的濃度被認為對牛 中的流產負責。由于玉米赤霉烯酮通過粘膜，特別是通過胃粘膜，但也通過口腔粘膜被迅速 吸收，因此立即的和尤其是定量的鈍化是必要的。在ZEN的口服給藥后30分鐘已經可以在血 液中檢測到它們。在這種情況下，使用經分離的針對微生物的酶具有優點，例如更高的比活 性或更快的作用。由于ZEN的有害效應，因而在歐盟存在有在食品中的強制性的ZEN上限以 及對于在飼料中的ZEN上限的推薦(EC N0:1881/2006)。
[0011] 為了減少食品或飼料的ZEN污染的最初策略是限制真菌生長，例如通過遵循"良好 的農業實踐經驗"。這尤其包括，種子沒有害蟲和真菌侵染，或者及時從田地中移除農業廢 料。此外，還可以通過使用殺真菌劑來減少田地上的真菌生長。在收獲之后，應當將收獲物 儲藏在低于15%的殘留水分含量和低的溫度下，以阻止真菌生長。同樣地，應當在再加工之 前去除由于真菌侵染而被污染的物料。盡管有著這一系列措施，但I .Rodriges和K.Naehrer (2012)仍然報道了，即使在具有最高農業標準的地區，例如USA和中歐，在2009年至2011年 中，分別有29 %和39 %的經測試的玉米樣品被ZEN污染。
[0012] 用于從飼料或食品中去除ZEN的其他可能性為真菌毒素的吸附或轉化。為此所必 需的是，真菌毒素與吸附劑的結合在寬的pH范圍內是強的且特異的，并且在胃腸區域內的 整個消化過程中保持穩定。雖然對于黃曲霉毒素可以有效地使用幾種非生物吸附劑，例如 活性炭、硅酸鹽或合成的聚合物，例如消膽胺，但是它們用于其他真菌毒素則受到限制。吸 附劑的主要缺點是其他有時候對于營養供給來說必需的分子的非特異性結合。在文獻中 同樣也描述了生物吸附劑，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附劑像非生物吸附劑一樣 也具有類似的限制。
[0013] 通過物理和化學處理來對ZEN進行解毒也受到限制。通過熱處理，不能有效地使 ZEN鈍化，但是可以通過擠出和用氧化劑進行處理，例如在80 °C下用10 %的過氧化氫溶液處 理16小時，來使ZEN含量降低83.9%。在飼料和食品的制備中擠出方法和氧化劑例如臭氧或 過氧化氫的使用，由于高的成本、品質損失、有時候低的效率和低的特異性而受限。
[0014] 借助于微生物例如·真菌毒素絲抱酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)、粉 紅粘帚霉(Gliocladium roseum)或枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)菌株或者從其中分 離出的酶例如水解酶或過氧化物酶來進行ZEN的生物轉化也例如在E.Vekiru等人， Appl.and Environ.Microb.，2010,76,7,2353-2359中進行了描述。
[0015] 從EP 0 938 575 B1中知曉了紅球菌屬（Rhodococcus)和諾卡氏菌屬(Nocardia) 的細菌，特別是球狀紅球菌(R. globerulus)、紅串紅球菌(R. erythropolis)和球形諾卡氏 菌(N · g 1 ob eru 1 a)的ZEN降解特性。
[0016] 從W0 02/076205中可獲知從粉紅粘帚霉中分離出的酶的ZEN降解作用，所述酶尤 其為α/β_水解酶、玉米赤霉烯酮水解酶1(ZHD1)，其借助于催化三元體來催化ZEN的降解。 [0017] 從W0 2012/113827中獲知重組Zonase，即ZEN降解酶，其在胃腸道中保持穩定，特 別地在其中描述了微生物例如褐色雙歧嗜熱菌（Thermobifidia fusca)、脫葉鏈霉菌 (Streptomyces exfoliatus)、德氏食酸菌（Acidovorans delaf ieldii)和鏈霉菌屬物種 (Streptomyces sp.)〇
[0018] 能夠水解ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的多肽或酶也可以稱為Zonase。
[0019] 下面所使用的術語取自專業用語并且總是以傳統的意義進行使用，除非另外指 出。因此，術語"多核苷酸"涉及具有所有長度和序列的每一種類型的遺傳物質，例如單鏈 和雙鏈DNA和RNA分子，包括調控元件、結構元件、基因群、質粒、全基因組及其片段。名稱"多 肽"包括蛋白質，例如酶、抗體，以及具有直至500個氨基酸的多肽，例如肽抑制劑，蛋白質的 結構域，還有具有小的序列長度例如少于10個氨基酸的短多肽，例如受體、配體、肽激素、標 簽等。名稱"在多核苷酸或多肽中的'位置'"涉及在所述多核苷酸或多肽的序列中單個特定 的堿基或氨基酸。
[0020] 現在，本發明旨在提供這樣的多肽以供使用，用所述多肽可成功實現將ZEN和/或 至少一種ZEN衍生物快速地且可靠地轉化為經水解的ZEN和/或經水解的ZEN衍生物。為了解 決該任務，本發明的特征主要在于，所述多肽是具有選自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或 其功能性變體的水解酶，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同 一 1性為至少40%。
[0021] 根據本發明，名稱"序列同一性"涉及序列同一性百分比。對于氨基酸序列和核苷 酸序列，序列同一性可以目視測定，但是優選地用計算機程序來計算出來。還在序列區段內 進行序列比較，其中參考序列的連續序列被理解為區段，并且優選地包含該序列的保守區 域。
[0022] 在當前的情況下，序列同一性借助于程序NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)來進行測定，特別地對于多肽，用BLASTP，和對于多核苷酸，用BLASTN，其提供 在 "National Center for Biotechnology Information" 的主頁（NCBI ; http :// www·ncbi ·nlm.nih.gov/)上以供使用。因此，可能的是，根據Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. ,25:3389-3402)的算法，將兩個或更多個序列互相進行比較。為了本發明的目 的，使用2013年5月15日的那個版本的程序。作為程序設置，考慮基本設置，但是特別地，對 于氨基酸序列比較："最大革G序列（max target sequence)" = 100 ; "期望閾值（expected threshold)" = 10; "字長(word size)" = 3; "矩陣（matrix)" = BL0S0M62; "缺口成本（gap costs)" = "存在（Existence) :11;延伸（Extention):l" ； "計算調整（computational adjustment)" = "條件式組成得分矩陣調整（Conditional compositional score matrix adjustment)" ；以及對于核苷酸序列比較:字長：11;期望值(Expect value): 10;缺口成本： 存在=5,延伸=2;過濾器(Filter)=低復雜度激活的（low complexity activated);匹 配/錯配得分(Match/Mismatch Scores) :2，_3;過濾器字符串（Filter String) :L;m。
[0023]術語"功能性多肽變體"或"功能性變體" 一方面涉及多肽的"等位基因變體"和多 肽的"功能性片段"，另一方面涉及多肽的"修飾"，其中酶促功能基本上未改變。名稱"等位 基因變體"涉及這樣的多肽，所述多肽通過在自然界中隨機發生的核苷酸序列突變而產生 并且引起氨基酸序列的改變，其中其酶促功能未受影響。"修飾"可以例如是與多肽的C-末 端或N-末端融合物或者經突變的多肽，其中突變可以通過至少一個氨基酸的置換、插入或 缺失來獲得，這特別地通過位點特異性誘變或隨機誘變、重組和/或任何其他蛋白質工程方 法來進行。術語"置換"、"插入"和"缺失"以在基因技術中通常的和專業人員熟悉的含義來 進行使用。術語"功能性片段"涉及多肽的部分或部分序列或者其功能性變體的部分或部分 序列，其中酶促功能基本上得到保留。當酶促反應機制保持不變，即在相同的位置處水解該 真菌毒素，并且"功能性變體"相對于原始多肽而言的比殘余活性為至少5%，優選地至少 10%，特別地至少50%時，那么基本上保留了酶促功能。具有有著SEQ ID No. 1-15的氨基酸 序列的多肽是另一個或者同一個酶的功能性等位基因變體，其中所述序列各自來源于不同 的微生物。這從下列中可清楚地看出來:借助于序列同一性百分比而測量出的接近的相互 親緣關系，以及這樣的事實，即所有多肽通過相同的降解機制作用于ZEN和ZEN衍生物。 [0024]由于具有SEQ ID No.1-15的多肽的氨基酸序列相互間的相似性，因而可能的是， 這些多肽之一的功能性變體與多于一個所要求保護的具有SEQ ID No. 1-15的多肽具有至 少40 %的序列同一性。
[0025]通過選擇此類氨基酸序列或其功能性變體，查明了令人驚訝地快速且完全的ZEN 和/或至少一種ZEN衍生物的水解。
[0026]如相應于本發明的一個優選的進一步發展方案那樣，所述多肽具有這樣的氨基酸 序列，其包含至少一個保守氨基酸序列區段或其功能性變體，其中所述氨基酸序列區段的 功能性變體具有至少70%，優選地至少84%，更優選地至少92%，和最優選地至少98%的序 列同一性，并且所述至少一個保守氨基酸序列區段選自具有SEQ ID No. 1的序列的氨基酸 序列+24 至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+145、+ 150至+171、+ 177至+193、+223至+228、+ 230 至+237、+239 至+247、+249 至+255、+257 至+261、+263至+270、+272至+279、+297至+301、+ 303至+313、+24至328、+1至+328。通過至少一個此類保守氨基酸序列區段的存在，可成功提 供這樣的多肽以供使用，所述多肽除了 ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的快速且完全的水解 外，還具有相比于迄今已知的ZEN降解多肽而言特別高的活性值。
[0027]當如相應于本發明的一個進一步改造方案那樣，所述功能性變體具有至少一個選 自一個或多個氨基酸的置換、缺失和插入的氨基酸修飾時，依然可以取得良好的結果。 [0028] 通過如此地進一步改造本發明，即使得所述多肽具有至少0.01U/mg，優選地至少 0.1U/mg，特別地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，優選地最高3.5μΜ，特別地最 高0.5μΜ的以水解方式裂解ΖΕΝ的Km值，和/或具有至少0.058+ 1，優選地至少0.，特別地 至少的以水解方式裂解ZEN的1^*值，和/或具有至少Ο.ΟΟΟΟΙμΜ^ΕΓ 1，優選地至少 0.0001μΜ-1，特別地至少〇. 〇〇1μΜ-1的以水解方式裂解ΖΕΝ的vmax值，ΖΕΝ和/或ΖΕΝ衍生 物可以被特別快速且完全地水解，特別是解毒。
[0029] 如相應于本發明的一個優選的進一步發展方案那樣，所述多肽包含選自SEQ ID No. 2、5-7、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH穩定性為至少 15%，優選地50%，和特別優選地至少90%。通過這樣的進一步發展方案可以確保，所述多 肽在酸性介質中，因此例如在哺乳動物的胃中的情況下，也將玉米赤霉烯酮和/或至少一種 玉米赤霉烯酮衍生物裂解或解毒。在此，將多肽的pH穩定性定義為所述多肽在pH 5.0下的 殘余活性百分比，相對于在各自最佳pH下的活性而言。
[0030] 如相應于本發明的一個優選的進一步發展方案那樣，所述多肽包含選自SEQ ID No.l、2、5-7、9、ll和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30 °C和75°C之間，優選地38°C 和55°C之間，特別優選地38°C和52 °C之間的溫度范圍內具有最高的酶促活性。通過這樣的 本發明的進一步發展方案確保了，玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物在中 溫溫度下，特別是在人和有用動物的體溫下，也被所述多肽水解或解毒。將所述多肽具有最 高酶促活性時所處的溫度定義為所述多肽的最佳溫度。
[0031 ]如相應于本發明的一個優選的進一步發展方案那樣，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、5、6、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是溫度穩定的，直至90°C，優選地 75°C，和特別優選地60°C的溫度。由此確保了，所述多肽和其酶促功能即使在提高的溫度負 荷下(例如這可以是在容器中進行運輸期間或在飼料粒化期間的情況)也基本上保持完整。 多肽的溫度穩定性被定義為這樣的溫度，在該溫度下所述多肽在15分鐘的預溫育后具有 50 %的殘余活性，相比于在各自最佳溫度下的活性而言。
[0032]因此，所述多肽可以如此地來進行選擇，從而它是對于不依賴于氧和無輔因子地 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或ZEN衍生物的酯基團來說合適的α/β-水解酶，其具有催 化所述水解式裂解的氨基酸三元體，該三元體由絲氨酸，一種選自谷氨酸和天冬氨酸的酸 性氨基酸，特別是天冬氨酸，以及組氨酸組成，并且該催化三元體為例如S128、D264和Η303， 其中描述了相對于SEQ ID No. 1的定位。
[0033]用SEQ ID No. 1-15的多肽中的每一個可成功按照下述反應機制在玉米赤霉稀酮 或其衍生物的酯基團處實現ZEN和ZEN衍生物的水解：
[0034]
[0035] ZEN至無毒的經水解的玉米赤霉烯酮(HZEN)或經水解的ZEN衍生物的水解通過根 據本發明的多肽，特別是所述α/β_水解酶來進行。HZEN至經脫羧的經水解的ZEN (DHZEN)或 經脫羧的經水解的ΖΕΝ衍生物的進一步的脫羧通常自發地進行。
[0036]特別地，借助于上面提及的催化三元體，可成功實現完全水解ΖΕΝ和ΖΕΝ衍生物，其 中該降解反應具有良好的pH穩定性，特別是在酸性范圍內的pH值下。
[0037] 令人驚訝地已證實，用在由上面提及的催化三元體的絲氨酸之前的3個氨基酸和 之后的3個氨基酸組成的序列區段中包含至少一個選自Y、Q、N、T、K、R、E、D的極性氨基酸和 至少一個選自？、1丄、1、￥^、6、？的非極性氨基酸的多肽，可成功取得依然良好的結果并且 此外還改善至少一個酶動力學參數。
[0038] 在本發明的一個優選的進一步改造方案中，所述多肽在至少一個下列位置處具有 關于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個突變：22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、 43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、 146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、 198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、 233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、 281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、 323、325和326。這些位置得自具有SEQ ID No.l的多肽和與該序列具有高的同一性程度和 特別地有活性的具有SEQ ID No.2-6的多肽之間的序列差異。通過在這些位置中的至少一 個處如此地改變具有SEQ ID No.l的多肽，即在該位置處采用SEQ ID No.2-6的氨基酸變 體，可成功顯示，這些位置對于所述多肽的酶動力學參數具有顯著的影響，并且此外，SEQ ID No.l與具有高的序列同一性程度的SEQ ID No.2-6的組合導致更高的活性。
[0039]根據本發明的一個進一步改造方案，所述多肽在關于SEQ ID No.l的氨基酸序列 中具有至少一個選自下列的突變:D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、R31A、 F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、 P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、 A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、 A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、 V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、 L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、 G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、 S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、 E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、 I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、 A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。用這樣的多 肽，可成功實現在短的時間內完全水解ZEN，特別是使其解毒，其中所述多肽的比活性為至 少6.00U/mg，優選地至少7.00U/mg，特別地至少8.00U/mg。單位"U"或者"Uni t"是絕對催化 活性的量度，并且通過在32°C下在50mMTris-HCl緩沖液(pH8.2)中水解lμMOlZEN/分鐘 來定義，其中"催化活性"是指在確定的反應條件下底物的酶促轉化，和"比活性"是指催化 活性與多肽質量濃度(質量/體積單位)之比。
[0040] 通過如此地產生所述多肽，即包含至少一個具有SEQ ID No. 32-50的下列氨基酸 基序，可成功提供這樣的多肽以供使用，該多肽具有至少7.00U/mg，優選地至少8.00U/mg的 比活性。令人驚訝地已顯示，當包含至少一個具有有著SEQ ID No.51-58的序列的下列氨基 酸基序時，所述多肽的酶促活性更進一步增加，例如相對于包含7個氨基酸的基序而言。當 包含至少一個具有有著SEQ ID No.59-69的序列的下列氨基酸基序時，達到更加高的比活 性。
[0041] 根據本發明的一個進一步改造方案，所述多肽在至少一個位置處包含至少一個保 守氨基酸置換，其中所述保守氨基酸置換選自：G至A;或A至G、S;或V至1、1^^、1\3 ;或1至￥、 L、M;或L至I、M、V;或 Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或F至Y、W、H;或Y至F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、 E、D;或K至R、E、D;或H至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q ;或E至Q、D、K、R、N;或S至T、A;或T至S、V、A; 或C至S、T、A;或N至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置換。其中名稱"保守氨基酸置換"涉及氨基 酸由被專業人員視為保守的（即具有類似的特殊特性的)其他氨基酸來進行的置換。此類特 殊特性為例如氨基酸的大小、極性、疏水性、電荷或PK值。保守突變是指例如將一個酸性氨 基酸置換成另一個酸性氨基酸，將一個堿性氨基酸置換成另一個堿性氨基酸，或者將一個 極性氨基酸置換成另一個極性氨基酸。
[0042] 用這樣的保守氨基酸置換，可成功制備出功能性多肽變體，其比活性相比于親本 多肽而言大約一樣強，然而優選地增加了至少0.1U/mg。
[0043] 此外，本發明還旨在，提供分離的多核苷酸以供使用，用所述多核苷酸可成功制備 出用于快速且可靠地以水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN-衍生物的多肽。
[0044] 為了解決該任務，本發明的特征在于，所述分離的多核苷酸具有編碼多肽的核苷 酸序列，其中所述多肽具有水解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的特性； 并且所述核苷酸序列編碼至少一種根據權利要求1至11之一的多肽;和/或所述核苷酸序列 與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所選擇的核苷 酸序列為至少40%;和/或所述核苷酸序列在中等嚴緊條件下與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列雜交，和/或與具有至少200個核苷酸，特別是至少100個核苷酸的其 部分序列雜交，和/或與上述核苷酸序列或其部分序列的互補鏈雜交。
[0045] 待表達的核苷酸序列，特別是其三聯體(密碼子），通常隨著宿主細胞而變化，從而 密碼子偏倚性隨著宿主細胞而優化。這導致，具有遠低于80 %，還有低于70%或低于60 %的 序列同一性程度的多核苷酸也可以編碼同一種多肽。用于確定序列同一性程度的序列比較 還必須在序列區段內進行，其中區段是指參考序列的連續序列。對于核苷酸序列，序列區段 的長度通常為15至600。
[0046] 借助于現有的分離的核苷酸序列或序列區段，可成功產生具有通常至少15、30或 40個核苷酸的長度的核酸探針。借助于此類探針(其通常另外還例如用咕、 3￥、358、生物素或 抗生物素蛋白進行標記)可以通過使用標準方法來鑒定編碼具有降解ZEN和/或ZEN衍生物 的作用的多肽的核苷酸序列。作為用于鑒定此類序列的起始材料，可以考慮例如單個微生 物的DNA、RNA或cDNA，基因組DNA文庫，或者cDNA文庫。
[0047] 對于具有至少100個核苷酸的長度的核苷酸序列或核苷酸探針，中等嚴緊條件被 定義為在42°C下在包含0.3 %十二烷基硫酸鈉（SDS)、200μg/ml經剪切和變性的鮭精DNA和 35% 甲酰胺的配備有5XNaCl的Na-EDTA緩沖液（SSPE，0.9M NaCl，60mM NaH2P〇4,6mM EDTA) 中的預雜交和雜交，隨后為標準Southern印跡條件，其中最后將載體材料用2 X的氯化鈉-檸檬酸鹽緩沖液(SSC，300mM NaCl和30mM檸檬酸三鈉，0.2%SDS)在55°C下洗滌15分鐘，進 行二次。
[0048] 對于具有15個核苷酸至100個核苷酸的長度的核苷酸序列或核苷酸探針，中等嚴 緊條件被定義為在由0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH = 7.6、6mM EDTA、0.5%NP-40、1X Denhardt溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、Ο. ImM ATP和0.2mg/ml酵母RNA組成的緩沖液 中的預雜交和雜交，其中在比計算出的解鏈溫度(Tm)低5°C至10°C的溫度下進行預雜交和 雜交，其中Tm通過按照Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,48:1390)進行的計算來確定。隨后，該試驗在標準Southern印跡條件下 繼續進行（J · Sambrook，E.F.Fritsch 和 T. Man iati s ,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor,New York)。最后，將載體材料用包含 0.1 % SDS的6 X SCC緩沖液洗滌15分鐘，進行一次;和在各自處于比計算出的Tm低5°C至10°C 的溫度下用6 X SSC緩沖液洗滌15分鐘，進行兩次。
[0049] 此外，本發明還旨在，提供添加劑以供使用，用所述添加劑可成功實現在確定的或 復雜的基質中，例如在飼料或食品中，快速且可靠地以水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN 衍生物。
[0050] 為了解決該任務，提供了以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉 烯酮衍生物的添加劑以供使用，其中所述添加劑包含至少一種具有選自SEQ ID No. 1-15的 氨基酸序列或其功能性變體的多肽，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之 間的序列同一性為至少40% ;并且任選地包含助劑。
[00511用這樣的添加劑，可成功實現ZEN和/或至少一種ZEN衍生物向經水解的ZEN和/或 經水解的ZEN衍生物的生物化學轉化。例如對于在工業過程中ZEN和/或ZEN衍生物的立體選 擇性水解，也可以考慮該添加劑。
[0052]在本發明的一個優選的進一步改造方案中，如此地產生所述添加劑，即所述助劑 選自至少一種惰性載體，以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質和/或酶和/或其 他用于使真菌毒素解毒的組分。通過使用這樣的添加劑，可以例如在飼料或食品中確保，所 任選地包含的ZEN和/或ZEN衍生物的量安全可靠地被水解特別是解毒至如此程度，從而對 于攝取這些飼料或食品的受試者的機體沒有有害效應。
[0053] 在這種情況下，根據本發明的多肽也可以存在于酶制劑中，所述酶制劑除了包含 至少一種根據本發明的多肽外，還包含至少一種酶，所述酶例如參與蛋白質的降解，例如蛋 白酶，或者所述酶參與淀粉或纖維或脂肪或糖原的代謝，例如淀粉酶、纖維素酶或葡聚糖 酶，以及例如水解酶、脂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、植酸酶、木聚糖酶和/或其 組合。
[0054] 本發明的其他使用范圍為酶制劑，其除了包含至少一種根據本發明的多肽外，還 包含至少一種用于使真菌毒素解毒的組分，例如真菌毒素降解酶，例如黃曲霉毒素氧化酶、 麥角胺水解酶、麥角胺酰胺酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮內酯酶、赭曲毒素酰胺酶、 串珠鐮孢菌素羧酸酯酶、串珠鐮孢菌素氨基轉移酶、氨基多元醇氨基氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌 醇環氧化物水解酶;和/或至少一種降解真菌毒素的微生物，例如枯草芽孢桿菌;和/或至少 一種結合真菌毒素的組分，例如微生物細胞壁或無機材料例如膨潤土。
[0055] 根據本發明的一個特別優選的進一步改造方案，在所述添加劑中，所述多肽以最 高10，000U/g，優選地最高1，000U/g，更優選地最高100U/g，和最優選地最高10U/g的濃度包 含在其中，由此可成功實現將ZEN和/或ZEN衍生物快速地，和特別地在其由消耗了被污染的 飼料或食品的受試者(特別是哺乳動物）的身體吸收之前，已經轉變為無毒或低毒的代謝 物，特別是HZEN和DHZEN。
[0056]根據本發明的一個進一步改造方案，所述多肽以經包囊或經包衣的形式存在，其 中對于所述包囊或包衣過程，可以考慮標準方法，例如在W0 92/12645中所描述的那些。通 過所述包囊或包衣過程，可成功實現將所述多肽運輸至其使用位點，而沒有改變，特別是沒 有降解或損害，從而在保護殼溶解(例如在動物的消化道中）之后，所述多肽才開始起作用， 由此在酸性的、富含蛋白酶的和缺氧的介質中也可以達到ZEN和/或ZEN衍生物的更加有針 對性的、快速的和完全的降解。此外，通過所述包囊或包衣過程，還可成功提高在所述添加 劑中所述多肽的溫度穩定性。
[0057]此外，本發明還旨在，所述添加劑用于以水解方式裂解在飼料（其特別地用于豬、 家禽和水產養殖）中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮 衍生物的用途。通過根據本發明來使用所述添加劑，可成功實現將在食物或飼料中或者在 干酒糟中所包含的ZEN和/或ZEN衍生物水解或解毒，其中在大約lU/g被污染的飼料或食物 的多肽濃度的情況下已經成功實現了這樣的解毒。
[0058]此外，本發明還旨在，提供這樣的方法以供使用，用所述方法使得ZEN和/或至少一 種ZEN衍生物的快速且可靠的水解式裂解成為可能。
[0059] 為了解決該任務，如此地來施行所述方法，從而玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米 赤霉烯酮衍生物被具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其 中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0060] 根據本發明的一個進一步改造方案，如此地來施行所述方法，從而其中在相應于 本發明的添加劑中使用所述多肽。
[0061] 根據一個優選的進一步發展方案，如此地來施行所述方法，從而其中將所述多肽 或添加劑與被玉米赤霉烯酮和/或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻 混，使所述被污染的飼料或食物與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染 的飼料或食物中所包含的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。在濕潤的飼 料或食物例如麥芽漿或糊漿的情況下，玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物 的水解在經口攝取之前在該濕潤的飼料或食物中發生。通過該方法可以確保，最大程度地 消除玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮衍生物對于人和動物的有害效應。在此，濕氣是指水或 含水液體的存在，其中例如唾液或其他在消化道中存在的液體也屬于該范疇。消化道被定 義為口腔、咽（咽喉）、食管和胃腸道或者其等價物，其中在動物中可以存在不同的名稱或者 個別成分可以不存在于動物的消化道中。
[0062] 本發明的方法還可以如此地來施行，從而將所述飼料或食物在經口攝取之前進行 粒化。
[0063]根據本發明的一個進一步改造方案，如此地來施行所述方法，從而至少70%，優選 地至少80 %，特別優選地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生 物被水解。由此可以預防在動物或人中的亞急性和/或亞慢性的毒性效應，例如致畸形的、 致癌的、動情的和免疫抑制的效應。
[0064]下面將依據實施例以及附圖更詳細地闡明本發明。其中：
[0065]圖1顯示了通過具有SEQ ID No.1的多肽來進行的ZEN的隨時間的降解以及代謝物 HZEN和DHZEN的增加，其中在圖1A中，所述多肽未加標簽，在圖1B中，所述多肽具有C-末端6 XHis標簽，和在圖1C中，所述多肽具有N-末端6XHis標簽。
[0066] 圖2顯示了具有SEQ ID No. 1的多肽的米-曼(Michaelis-Menten)動力學。
[0067] 圖3顯示了通過經純化的具有SEQ ID No.l(圖3A)、SEQ ID No.2(圖3B)、SEQ ID Νο·5(圖3C)、SEQ ID Νο·6(圖3D)、SEQ ID Νο·7(圖3E)、SEQ ID Νο·9(圖3F)、SEQ ID No.ll (圖3G)、SEQ ID No.12(圖3H)和SEQ ID No.15(圖31)的多肽來進行的ZEN的隨時間的降解 以及代謝物HZEN和DHZEN的增加，其中所有序列均具有C-末端6 X Hi s標簽。
[0068]實施例1:編碼能夠以水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的多肽的多核苷 酸的修飾、克隆和表達
[0069] 按照說明書，使用"Quick-change Site-directed Mutagenesis Kits" (Stratagene)，借助于PCR，通過核苷酸序列的突變來進行氨基酸置換、插入或缺失。備選 地，為此還購進了完整的核苷酸序列(GeneArt)。借助于PCR誘變而產生的或從GeneArt購進 的核苷酸序列在氨基酸水平上可選地另外還包含C-末端或N-末端6 X His標簽，并且借助 于標準方法將其整合到用于在大腸桿菌(E. col i)或巴斯德畢赤酵母(P. pastor is)中進行 表達的表達載體之中，轉化到大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母中，以及在大腸桿菌或巴斯德畢 赤酵母中進行表達（J.M.Cregg，Pichia Protocols,第二版，ISBN-10:1588294293、2007; J · Sambrook等人，2012，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor)，其中也可以為該任務考慮任何其他合適的宿主細胞。
[0070] 名稱"表達載體"涉及能夠在體內或在體外表達基因的DNA構建體。特別地，該名稱 涵蓋這樣的DNA構建體，其適合于將編碼所述多肽的核苷酸序列轉移到宿主細胞中，以便在 那里整合到基因組中或者游離地存在于染色體外空間中，并且在細胞內表達編碼所述多肽 的核苷酸序列和任選地從細胞中提取出所述多肽。
[0071] 名稱"宿主細胞"涉及所有這樣的細胞，其要么包含待表達的核苷酸序列，要么包 含表達載體，并且能夠制備根據本發明的多肽。特別地，該名稱涵蓋原核細胞和/或真核細 胞，優選地巴斯德畢赤酵母，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鏈霉菌屬(Streptomyces)，漢遜酵母 屬（Hansenula)，木霉屬（Trichoderma)，乳桿菌屬（Lactobacillus)，曲霉屬 (Aspergillus)，植物細胞，和/或芽孢桿菌屬(Bacillus)、木霉屬或曲霉屬的孢子。
[0072] 為了測定多肽的催化特性，在大腸桿菌的情況下考慮可溶的細胞裂解物，或者在 巴斯德畢赤酵母的情況下考慮培養物上清液。為了測定Km值、v max UP比活性，借助于標 準方法以色譜法方式通過鎳-Sepharose柱選擇性地富集所述多肽。蛋白質濃度的測定借助 于標準方法來進行，要么采用BCA方法(Pierce BCA Protein Assay KitProd#23225)，然而 優選地采用用關于各自蛋白質的比消光系數來實施的光度法，所述比消光系數用在 http: //web · expasy · org/protparam上在線可用的程序 "ProtParam" 來計算（Gasteiger E · 等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server,John M. Walker(編輯）：The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press,2005,第571-607 頁)。
[0073] 實施例2:序列同一性以及保守氨基酸序列區段的確定
[0074]在具有有著SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列的多肽的總多肽長度上的相互之間的 序列同一性百分比（表1)的確定可以借助于程序BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，特別是用可以在"國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)" 的主頁(NCBI;http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)上使用的BLASTP來進行。因 此，可能的是，根據Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. (1997)25:3389-3402)的算 法，將兩個或更多個序列互相進行比較。作為程序設置，考慮基本設置，但是特別地："最大 靶序列" =100; "期望閾值" =10; "字長" =3; "矩陣" =BLOSOM62; "缺□成本"="存在：11; 延伸：Γ ; "計算調整"="條件式組成得分矩陣調整"。
[0075] 為了確定保守氨基酸序列區段，借助于軟件⑶BALT(J. S.Papadopoulos和 R.Agarwala,2007,COBALT:constraint-based alignment tool for multiple protein sequences ,Bioinformatics23:1073-79)來調節對準相互之間具有至少70%的序列同一性 的具有SEQ ID No. 1 -6的多肽，其中考慮標準參數，特別是下列參數（"缺口罰分" ：-11，-1; "末端缺口罰分"：-5，-l;"使用RPSBLAST(UseRPSBLAST)" ：on;"BlastE-值"：0·003;"發 現保守列和重新計算（Find Conserved columns and Recompute)" ：on; "使用查詢聚族 (use query clusters)''：on; "字長"：4;"可能聚族距離''（may cluster distance) :0·8; "字母表"：常規；"同源性保守設置(Homology conversation setting) :3bits)。該分析的 結果描繪出了保守氨基酸。保守氨基酸序列區段被定義為具有至少5個連續的保守氨基酸 的下列區域：即關于具有SEQ ID No. 1的序列，位置+24至位置+50的區段A、位置+52至位置 +77的區段B、位置+79至位置+87的區段C、位置+89至位置+145的區段D、位置+150至位置+ 171的區段E、位置+177至位置+193的區段F、位置+223至位置+228的區段G、位置+230至位置 +237的區段H、位置+239至位置+247的區段I、位置+249至位置+255的區段J、位置+257至位 置+261的區段K、位置+263至位置+270的區段L、位置+272至位置+279的區段M、位置+297至 位置+301的區段N和位置+303至位置+313的區段0。
[0076]如上面所描述的那樣，進行多肽相互之間的以及獨個多肽的保守氨基酸序列區段 相對于具有SEQ ID No. 1的序列的保守氨基酸序列區段而言的序列同一性百分比的測定。 結果呈現在表1和2中。
[0077]表1:多肽相互之間的序列同一性百分比。
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]表2:保守氨基酸序列區段A至0的序列同一性百分比。
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087] 實施例3:通過在細胞裂解物中的多肽來水解ZEN
[0088] 為了測定其將ZEN降解為非毒性或低毒性的代謝物HZEN和DHZEN的能力，如在實 施例1中所描述的那樣，在大腸桿菌中制備由具有SEQ ID No. 17的核苷酸序列所編碼的具 有SEQ ID No.l的多肽，所述多肽就這樣地和以具有C-末端或N-末端6XHis標簽的方式來 進行制備。將有著由具有SEQ ID No. 18-31的核苷酸序列所編碼的具有SEQ ID No.2-15的 氨基酸序列的多肽僅在C-末端標記上6 X His。各將100ml的具有2.0-2.5的光密度 (0D600nm)的大腸桿菌培養物通過在4°C下離心來進行收獲，并且重懸浮在20ml Brunner礦 質培養基(DSMZ微生物培養基編號462,2012)中。通過用弗氏壓碎器在20,000psi下處理3次 來將細胞懸浮液裂解。將如此獲得的細胞裂解物以1: 1〇、1:100或1:1，〇〇〇的稀釋物進行使 用，所述稀釋物在包含〇. lmg/ml BSA(牛血清白蛋白）的Brunner礦質培養基中制備。對于 ZEN降解試驗，使用9.9ml的包含0. lmg/ml BSA的Brunner礦質培養基、0. lml的經稀釋的細 胞裂解物和31μ1的ZEN底物儲液。總之，因此將細胞裂解物以1:1，000、1:10,000或1:100， 〇〇〇進行了稀釋。2.08mM ΖΕΝ溶液(40體積％的ACN+60體積％的出0)用作ΖΕΝ底物儲液。為了 制備該溶液，相應地稱量以晶體形式的ZEN(Romer Labs的生物純標準品，商品編號001109， 純度為至少98%)并裝瓶，并且將其溶解。每個降解批次在25ml玻璃小瓶中進行，并且在25 °C下在以lOOrprn進行搖動的情況下溫育總共120小時。在時間點0、0.5、1、2、5、24、47、72和 120小時，各取lml的樣品，將多肽在99°C下加熱失活10分鐘并貯存于-20°C。在樣品解凍后， 通過離心分離開不溶性成分。借助于LC/MS/MS來分析ZEN、HZEN和DHZEN。為此，借助于尺寸 為250mmX 3mm和顆粒大小為5μηι的Phenomenex Luna C18(2)柱通過色譜法來將代謝物分 開。具有lml/Ι的甲酸濃度的乙腈-水混合物用作流動相。在270nm下記錄UV-信號。電噴霧離 子化(ESI)用作離子化源。借助于QTrap/LC/MS/MS(三重四極，Applied Biosystems)以"增 強模式"來對ZEN、HZEN和DHZEN進行定量。在最遲24小時后，在批料中不再檢測到重大量的 ZEN。大部分(超過80 % )的ZEN被轉變成HZEN或DHZEN。
[0089] 在圖1中看到，示例性地關于經1:10,000稀釋的細胞裂解物溶液，對于未加標簽的 (圖1A)以及對于加有C-末端6 X His標簽的（圖1B)和加有N-末端6 X His標簽的（圖1C)具有 SEQ ID No. 1的多肽，ZEN的隨時間的降解和HZEN及DHZEN的隨時間的增加。從中清楚地顯而 易見的是：1.ZEN的轉化立即且完全地進行，這是因為在于試驗開始后立即抽取的第一個樣 品（0小時）中，就已經幾乎不再能夠檢測到ZEN;和2.通過附加 C-末端或N-末端的標簽，未出 現值得注意的活性損失。
[0090] 實施例4:通過在細胞裂解物中的多肽來水解ZEN衍生物
[0091]為了測定多肽將除了 ZEN外還有ZEN衍生物轉化為非毒性或低毒性的代謝物的能 力，如在實施例3中所描述的那樣，以具有C-末端His標簽的方式制備具有SEQ ID No. 1-15 的多肽，并且作為在"降解15"中的細胞裂解物，考慮各自的具有有著SEQ ID No. 17-31的序 列的合成核苷酸序列。
[0092]降解試驗如在實施例3中所描述的那樣來進行，其中每種多肽用選自α-ZEL、β-ZEL、a-ZAL、0-ZAL、Z14G、Z14S和ZAN的每種ZEN衍生物來進行測試。以1:10，000的總稀釋度 來使用細胞裂解物。作為底物儲液，使用等摩爾的（即2.08mM的）ZEN衍生物溶液，以代替 2 · 08mM ZEN溶液（40體積 ％ 的ACN+60體積 ％ 的出0)。a-ZEL、β-ZEL、a-ZAL、β-ZAL和ZAN從 Sigma購進并且作為關于該分析的標準品來進行使用。按照諸如在P.Krenn等人，2007 (Mykotoxin Research，23，4，180-184)和Μ· Sulyok等人，2007(Anal · Bioanal · Chem. 289， 1505-1523)中所描述的方法，以至少90%的純度來制備Z14G和Z14S，并且將其作為關于該 分析的標準品來進行使用。與實施例3的另一個差別是，僅取一個樣品，即在24小時后。在降 解試驗期間ZEN衍生物濃度的降低借助于LC/MS/MS來進行定量。a-ZEL、f3-ZEL、Z14G和Z14S 按照Μ·Sulyok等人（2010,Food Chemistry，119,408-416)的方法來進行測量;a-ZAL、P_ZAL 和ZAN按照P.Songsermaskul等人（2011，J.of Animal Physiol .and Animal Nutr. ,97， 155-161)的方法來進行測量。令人驚訝地表明，在所有降解試驗中，在24小時的溫育后，僅 僅存在ZEN衍生物的起始量的0%至最大13%。
[0093]實施例5:多肽以及其變體的比活性以及酶動力學參數
[0094]多肽以及其變體的比活性的測定通過光度法來進行，其中所有所使用的多肽具有 C-末端6 XHis標簽。多肽或其變體的制備、富集和純化如在實施例1中所描述的那樣來進 行。ZEN至HZEN的降解通過在315nm的波長下吸光度的下降來測量。ZEN和HZEN的摩爾消光系 數[ε ]通過實驗來測定，并且為0.00788951^111014011-1和0.0 OSOSSTLymorVm-1。消光系數是 強烈地pH依賴性的，并因此必須總是在精確相同的pH值下，優選地甚至在相同的基質中進 行活性測量。在32°C下，在UV-VIS光度計(Hitachi U-2001)中，在200至2500nm的波長范圍 內，在石英比色皿中，在50mM Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液中進行測量。
[0095] 2.08mM ZEN溶液(40體積％的厶0糾60體積％的出0)用作ZEN底物儲液。為了制備該 溶液，相應地稱量以晶體形式的ZEN(Romer Labs的生物純標準品，商品編號001109，純度為 至少98%)并裝瓶，并且將其溶解。用50mM Tris-HCl(pH=8.2)來制備ZEN底物稀釋物(0.79 μΜ、1·57μΜ、2·36μΜ、3·14μΜ、4·71μΜ、6·28μΜ、7·85μΜ、9·42μΜ、10·99μΜ、12·56μ 厘、14.134厘、15.714厘、17.284厘、18.85以厘）。將多肽溶液用5〇111]\11^8-!1(：1緩沖液(口!1 = 8.2)稀釋至大約70ng/ml的終濃度。將ZEN底物稀釋物在水浴中預熱至32 °C。
[0096]給100μΙ的各個ZEN底物稀釋物摻入0.2μ1的多肽溶液，并且測量吸光度5分鐘，其 中測量每個"多肽溶液-ΖΕΝ底物稀釋物"組合至少兩次。
[0097]通過考慮ΖΕΝ和ΗΖΕΝ的消光系數，經由隨時間進程的吸光度的斜率，計算出關于每 個底物濃度的反應速率。
[0098]名稱"Km值"或"米-曼常數"涉及用于描述酶親和力的參數，其具有單位[μΜ]或 [mM]，并且按照H.Bisswang(2002,Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-Χ,第 19頁）借助于 線性Hane s標繪圖來計算，其中為此優選地使用程序S i gmaP 1 〇 t 12.0的函數"酶動力學，單 一底物"。名稱"酶反應的催化常數"或"krat值"涉及用于描述多肽或酶的轉化速度的參數， 其以[sr 1給出，并且優選地借助于程序SigmaPlot 12.0的函數"酶動力學，單一底物"來計 算。"最大酶速率"或"vmax值"以單位[μΜ/s]或[mM/s]給出，并且類似于Km值，借助于線性 Hanes標繪圖來測算，其中為此優選地使用程序SigmaPlotl 2.0的函數"酶動力學，單一底 物"。
[0099] 借助于Vmax和所使用的酶濃度，根據下述公式來計算比活性，
[0100]
[0101] 其中一個單位被定義為在32°C下在50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)中每分鐘 水解 1μπι〇1 ZEN。
[0102] 下面，示例性地對于具有SEQ ID Ν0:1的多肽，列舉出關于酶參數KM、vmax、kcat以及 比活性的測定的原始數據。表3顯示了在各個ZEN底物濃度下的反應速率，圖2顯示了各自所 屬的米-曼圖，和在表4中給出了相應的酶動力學參數。所使用的酶溶液具有68ng/l的濃度。
[0103] 表3:在不同的ZEN濃度下，具有SEQ ID NO: 1的多肽的反應速率。
[0104]
[0105] 表4:具有SEQ ID No. 1的多肽的酶動力學參數。
[0106]
[0107] 所研究的多肽的比活性為：8·25U/mg，對于SEQIDNo·l;10·56U/mg，對于SEQID No.2;8.36U/mg，對于SEQ ID No.3;8.33U/mg，對于SEQ ID No.4;8.56U/mg，對于SEQ ID No.5;9.95U/mg，對于SEQ ID No.6;3.83U/mg，對于SEQ ID No.7;2.57U/mg，對于SEQ ID No.8;4.87U/mg，對于SEQ ID No.9;5.12U/mg，對于SEQ ID No.lO;3.88U/mg，對于SEQ ID No·ll;2·78U/mg，對于SEQIDNo·12;6·43U/mg，對于SEQIDNo·13 ;3·33U/mg，對于SEQID No·14;和7·76U/mg，對于SEQIDNo·15。
[0108]所研究的多肽變體的比活性在表5和表6中列出。
[0109]表5:具有SEQ ID No. 1的多肽的功能性變體的比活性；突變所位于的保守氨基酸 序列區段;和功能性變體相對于具有SEQ ID No.1的親本序列而言的序列同一性。相對于具 有SEQ ID No. 1的氨基酸序列而言給出了突變的位置。如在實施例2中所描述的那樣，借助 于BLAST來測算序列同一性。
[0110]
[0116]
[0117]表6:具有SEQ ID No.2的多肽的功能性變體的比活性。突變的位置是相對于具有 SEQ ID No.2的氨基酸序列而言的。如在實施例2中所描述的那樣，借助于BLAST來測算序列 同一性。
[0118]
[0119]實施例6:在被污染的玉米中的ZEN和ZEN衍生物的降解
[0120]為了測定多肽在復雜基質中和在低pH值下降解天然存在的ZEN和ZEN衍生物的能 力，每次給被污染的玉米摻入不同濃度的具有SEQ ID No. 1-6的多肽中的一種，并且追蹤 ZEN和ZEN衍生物的降解。
[0121]碾磨被污染的玉米并且將其在降解試驗中使用，其中批料由lg經碾磨的被污染的 玉米、8.9ml 100mM乙酸鹽緩沖液(pH = 4.0)和0.1ml多肽溶液組成。如在實施例5中所描述 的那樣，制備經富集和經純化的多肽溶液，其中將其稀釋至10mU/ml、100mU/ml或l，000mU/ ml的濃度。因此，在批料中以絕對方式使用lmU( = lmU/克玉米）、10mU( = 10mU/克玉米)或 100mU( = 100mU/克玉米）。每個降解批料以25ml來實施制備，并且在37°C下在以lOOrpm進行 搖動的情況下進行溫育。在酶添加之前和在1小時的溫育后，分別取出lml的樣品，將多肽 在99°C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于-20°C。在樣品解凍后，通過離心分離開不溶 性成分。如在M. Sulyok等人(2007，Anal .Bioanal · Chem.，289，1505-1523)中所描述的那樣， 借助于LC/MS/MS來測量ZEN以及ZEN衍生物的濃度。在該玉米中ZEN和ZEN衍生物的含量為： 238ppb，對于ZEN; 15ppb，對于α-ZEL; 23ppb，對于β-ZEL; 32ppb，對于Z14G;和8lppb，對于 Z14S。在表7中呈現了在所述降解試驗中ZEN和ZEN衍生物含量下降的百分比。
[0122]表7:不同多肽和多肽量的降解試驗的相對于起始含量而言的以百分比表示的ZEN 和ZEN衍生物的減少。
[0123]
[0124] 實施例7:用于以水解方式裂解ZEN和/或ZEN衍生物的包含多肽的添加劑
[0125] 為了制備用于以水解方式裂解ZEN的添加劑，借助于微量過濾和超濾(排阻極限： 10kDa)在標準條件下純化經由巴斯德畢赤酵母表達的具有SEQ ID No. 1、2、6和13的多肽的 發酵上清液，并且將其濃縮至大約9重量％的干物質濃度。隨后，用噴霧干燥器（Bilchi的 Mini B290)同樣在標準條件下將該含多肽的溶液進一步加工成干粉末。將這四種粉末相繼 地命名為Z1、Z2、Z6和Z13。此外，將Z1、Z2、Z6或Z13與平均粒度為大約Ιμπι的膨潤土，以1重 量％的添加劑21、22、26或213和99重量％的膨潤土的比例，在向上式搖動器中進行混合。將 如此獲得的添加劑命名為添加劑21上、22.8、26上和213.8。此外，將21、22、26和213與膨潤 土和維生素-微量元素濃縮物，以0.1重量％的21、Ζ2、Ζ6或Ζ13，0.9重量％的維生素-微量元 素濃縮物，和99重量％的膨潤土的比例，在向上式搖動器中進行混合。將如此獲得的添加劑 命名為添加劑 21.8￥5、22.8￥5、26上￥5和213.8￥5。10(^的添加劑21.8￥5、22.8￥5、26.8￥5和 Ζ13 · BVS包含200mg硫酸鐵、50mg硫酸銅、130mg氧化鋅、130mg氧化猛、2 · 55mg碳酸|丐、160mg 維生素 E、6 · 5mg維生素 K3、6 · 5mg維生素 Bl、14mg維生素 B2、15mg維生素 B6、0 · 15mg維生素 B12、150mg煙酸、30mg泛酸和5 · 3mg葉酸。
[0126] 將所述添加劑在50mM Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)中抽提30分鐘，并且在同一緩沖 液中如此地進一步稀釋，從而使得多肽的終濃度位于大約70ng/ml。
[0127] 隨后，如在實施例5中所描述的那樣，測定這些溶液的降解玉米赤霉烯酮的效應。 相應的活性為:8 · 230U/g，對于Z1; 9 · 310U/g，對于Z2; 9 · 214U/g，對于Z6; 83U/g，對于Z1 · B; 92U/g，對于Z2 · B; 90U/g，對于Z2 · C; 57U/g，對于Z13 · B; 8U/g，對于Z1 · BVS; 9U/g，對于 Z2 · BVS; 9U/g，對于Z6 · BVS;和6U/g，對于Z13 · BVS。
[0128] 如在實施例4中所描述的那樣來施行添加劑Z1、Z2、Z6、Z13、Z1.B、Z2.B、Z6.B、 Z13 · B、Z1 · BVS、Z2 · BVS、Z6 · BVS和Z13 · BVS 降解 ZEN 衍生物α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL、Z14G、 Z14S和ZAN的能力，但是使用100μΙ的具有大約70ng/ml的多肽濃度的多肽溶液來代替100μΙ 的細胞裂解物。在6小時的溫育后，起始量的僅僅最大15 %作為未水解的ZEN衍生物存在。
[0129] 實施例8:最佳溫度
[0130] 為了測定具有SEQ ID N〇.l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽的最佳溫度，如在實施 例1中所描述的那樣，將它們以具有c-末端6 XHis標簽的方式進行克隆，在大腸桿菌中表 達，并純化。在初步試驗中，對于每種多肽，測算出那個濃度，在所述濃度下在試驗條件 (Teorell Stenhagen 緩沖液（Teorell 和 Stenhagen，Ein Universal puffer fiir den pH-Bereich 2.0bis 12.0.Biochem Ztschrft, 1938,299:第416-419頁），pH 7.5,具有O.lmg/ ml BSA，在30°C下）下在3小時的試驗持續時間后可以確保ZEN的完全轉化。以所測算出的濃 度在用于測定最佳溫度的降解批料中使用所述制備物。該試驗在PCR循環儀(Eppendorf) 中，通過使用溫度梯度函數，在20°C+/-10°C下，在40°C+/-10°C下，和如果需要，在60°C+/_ 10°C下(在各自范圍內10個溫度;預先確定的PCR循環儀的溫度)來進行。對于批料，在各自 最佳pH下給Teorell-Stenhagen緩沖液摻入相應的酶濃度以及0. lmg/ml BSA和5ppm ZEN。 具有0. lmg/ml BSA和5ppm ZEN而沒有酶添加的批料用作陰性對照。在0小時、0.5小時、1小 時、2小時和3小時的溫育時間后，對于每個溫育溫度各自抽取一個樣品，在99°C下加熱失活 10分鐘，并且貯存于_20°C。在解凍后，將樣品轉移到HPLC小瓶中。借助于HPLC-DAD來分析 ZEN、HZEN和DHZEN。為此，借助于尺寸為4.6mmX150mm和顆粒大小為5μm的ZorbaxSB-Aq C18柱通過色譜法來將代謝物分開。具有5mM乙酸銨的甲醇-水混合物用作流動相。在274nm 下記錄UV-信號。代謝物的定量通過包括所攜帶的標準品系列來進行。最佳溫度的測算通過 測算出的降解曲線的斜率來進行，其中將斜率為最大時所處的溫度定義為最佳溫度。最佳 溫度顯示在表8中。
[0131] 表8:多肽的最佳溫度。
[0132]
[0133] 實施例9:溫度穩定性
[0134] 為了測定具有SEQ ID No.l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽的溫度穩定性，如在實 施例1中所描述的那樣，將它們以具有c-末端6XHis標簽的方式進行克隆，在大腸桿菌中表 達，并純化。將它們在具有梯度函數的PCR循環儀中在各自的最佳溫度+/-HTC下進行溫育。 在0分鐘、15分鐘、30分鐘和60分鐘后，對于每個批料和每個溫度抽取一個樣品。隨后，在降 解試驗中，在具有〇· lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于各自最佳pH下的Teorell-Stenhagen緩 沖液中，在批料中使用這些經預溫育的樣品。在初步試驗中，對于每種多肽，測算出那個濃 度，在所述濃度下在試驗條件(Teorell Stenhagen緩沖液，pH 7.5,具有O.lmg/ml BSA，在 30°C下）下在3小時的試驗持續時間后可以確保ZEN的完全轉化。在批料中使用各自所測算 出的酶濃度。在30 °C下溫育所述降解批料。在0小時、0.5小時、1小時、2小時和3小時的溫育 時間后進行取樣。隨后，將多肽在99 °C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于_20°C。在解凍 后，將樣品轉移到HPLC小瓶中，并且如在實施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進行分 析。
[0135] 將溫度穩定性定義為這樣的溫度，在所述溫度下多肽在15分鐘的預溫育后具有 50%的殘余活性，相比于最佳溫度而言。作為對于活性的量度，考慮降解曲線的斜率。溫度 穩定性顯不在表9中。
[0136] 表9:多肽的溫度穩定性(在15分鐘的預溫育后50%的殘余活性）。
[0137]
[0138] 實施例10:最佳pH
[0139] 為了測定具有SEQ ID如.1、2、5、6、7、9、11、12和15的多肽的最佳?!1，如在實施例1 中所描述的那樣，將它們以具有C-末端6XHis標簽的方式進行克隆，在大腸桿菌中表達，并 純化。在初步試驗中，對于每種多肽，測算出那個濃度，在所述濃度下在試驗條件(Teorel 1 Stenhagen緩沖液，pH 7.5，具有0. lmg/ml BSA，在30°C下）下在3小時的試驗持續時間后可 以確保ZEN的完全轉化。在批料中使用各自的酶濃度。所述降解批料在處于3.0、4.0、5.0、 5·5、6·0、6·5、7·0、7·5、8·0、8·5、9·0、9·5、10·0、11·0和12.0 的pH 值下的Stenhagen 緩沖液 中實施制備。為了進行降解，將具有〇. lmg/ml BSA和5ppm ZEN的降解批料在30°C下進行溫 育。在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于pH 3·0、ρΗ 7.0和pH 12.0下的Teorell-Stenhagen緩沖液中的批料用作陰性對照。在0小時、0.5小時、1小時、2小時和3小時的溫育 時間后進行取樣。隨后，將多肽在99 °C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于_20°C。在解凍 后，將樣品轉移到HPLC小瓶中，并且如在實施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進行分 析。最佳pH的測算通過測算出的降解曲線的斜率來進行，其中將在斜率為最大時所處的pH 值定義為最佳pH。最佳pH顯示在表10中。
[0140] 表10:多肽的最佳pH。
[0141]
[0142] 實施例11:在pH 5.0下的pH穩定性
[0143]為了測定pH穩定性，將來自實施例10的多肽在處于pH 5.0和各自最佳pH下的 Teroell-Stenhagen緩沖液中在25°C下溫育1小時。在降解試驗中，以與對于測定最佳pH所 使用的濃度相同的各自多肽的濃度，在具有〇.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于各自最佳pH下 的lOOmM Tris-HCl緩沖液中，在批料中使用這些經預溫育的樣品。在0小時、0.5小時、1小 時、2小時和3小時的溫育時間后進行取樣。隨后，將多肽在99°C下加熱失活10分鐘，并且將 樣品貯存于-20°C。在解凍后，將樣品轉移到HPLC小瓶中，并且如在實施例8中所描述的那樣 借助于HPLC-DAD來進行分析。將pH穩定性定義為在pH 5.0下多肽的殘余活性百分比，相對 于在各自最佳pH下的活性而言。對于pH 5.0的pH穩定性顯示在表11中。
[0144] 表11:在pH 5.0下多肽的pH穩定性。
[0145]
[0146] 實施例12: ZEN降解試驗
[0147] 示例性地對于具有SEQ ID No·l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽，進行ZEN至HZEN和 DHZEN的降解。所述降解批料在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的Teorell Stenhagen緩沖液 (pH 7.5)中實施制備。在30°C下溫育所述降解批料。在0小時、0.5小時、1小時、2小時和3小 時的溫育時間后進行取樣。隨后，將多肽在99°C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于-20 °C。在解凍后，將樣品轉移到HPLC小瓶中，并且如在實施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進行分析。如此地來選擇多肽濃度，從而在大約3小時后達到完全的降解。降解動力學 描繪在圖3中，其中y軸顯示了以微摩爾/升(μπιο 1 /1)表示的ZEN、HZEN和DHZEN的濃度，和X軸 顯示了以小時(h)表示的溫育時間。
[0148] *μ Μ表示微體積摩爾濃度，并且相應于單位μπι。1/1。
[0149] 本發明的一些實施方案如下：
[0150] 1.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其 特征在于，所述多肽是具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶， 其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0151] 2.根據實施方案1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一個保守氨基酸序列區 段或其功能性變體，其中所述氨基酸序列區段的功能性變體具有至少70%，優選地至少 84%，更優選地至少92%，和最優選地至少98%的序列同一性，并且所述至少一個保守氨基 酸序列區段選自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89 至+145、+150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257 至+261、+263至+270、+272至+279、+297至+301、+303至+313、+24至328、+1至+328。
[0152] 3.根據實施方案1或2的多肽，其特征在于，所述功能性變體具有選自下列的氨基 酸修飾:各自一個或多個氨基酸的置換、缺失和插入。
[0153] 4.根據實施方案1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有至少0.01U/mg，優 選地至少0.1U/mg，特別地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，優選地最高3.5μΜ， 特別地最高〇. 5μΜ的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的ΚΜ值，和/或具有至少0. Οδ?Γ1，優選地 至少Ο.θ?Γ1，特別地至少5(1的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的1^值，和/或具有至少 Ο.ΟΟΟΟΙμΜ^ΕΓ1，優選地至少〇.〇〇〇1μΜ?，特別地至少Ο.ΟΟΙμΜ^ΕΓ1的以水解方式裂解 玉米赤霉稀酮的v max值。
[0154] 5.根據實施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 2、 5、6、7、9、11和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所述氨基 酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH穩定性為至少15%，優 選地50 %，和特別優選地至少90 %。
[0155] 6.根據實施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、 2、5、6、7、9、11、15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所述氨 基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30°C和75°C之間，優選地38°C和55 °C之間，特別優選地38°C和52°C之間的溫度范圍內具有最高的酶促活性。
[0156] 7.根據實施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、 5、6、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所述氨 基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是溫度穩定的，直至90°C，優選地75 °C，和特別優選地60 °C的溫度。
[0157] 8.根據實施方案1至7之一的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個選自下列的 位置處具有關于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個突變:22、23、25、26、27、29、31、32、 35、37、42、43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、 132、141、146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、 196、197、198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、 229、231、233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、 277、280、281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、 319、321、323、325和326。
[0158] 9.根據實施方案8的多肽，其特征在于，所述多肽具有選自下列的關于SEQ ID 吣.1的氨基酸序列的至少一個突變:〇22厶、5230、5231^、呢^)、126￥、？27￥小27!1、529?、1?31八、 F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、 P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、 I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、 A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、 A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、 V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、 L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、 G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、 S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、 E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、 I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、 A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。
[0159] 10.根據實施方案1至8之一的多肽，其特征在于，包含至少一個選自SEQ ID No. 32-69的下列氨基酸基序。
[0160] 11.根據實施方案9的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個位置處包含至少一 個保守氨基酸置換，并且所述保守氨基酸置換選自：G至A;或A至G、S;或V至I、L、A、T、S;Sl 至V、L、M;或L至I、M、V;或Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或 F至Y、W、H;或Y 至 F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、E、D;或K至R、E、D;或Η至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q;或E至Q、D、K、R、N;或 S至T、A;或T至S、 V、A;或C至S、T、A;或 N 至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置換。
[0161] 12.分離的多核苷酸，其具有編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有水解玉米 赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的特性，其特征在于，所述核苷酸序列編碼至 少一種根據實施方案1至11之一的多肽；和/或所述核苷酸序列與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所選擇的核苷酸序列為至少40%;和/ 或所述核苷酸序列在中等嚴緊條件下與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列雜 交，和/或與具有至少200個核苷酸，特別是至少100個核苷酸的其部分序列雜交，和/或與上 述核苷酸序列或其部分序列的互補鏈雜交。
[0162] 13.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的添加劑， 其特征在于，所述添加劑包含至少一種具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性 變體的多肽，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少 40% ;并且任選地包含助劑。
[0163] 14.根據實施方案13的添加劑，其特征在于，包含至少一種根據實施方案1至11之 一的多肽。
[0164] 15.根據實施方案13或14之一的添加劑，其特征在于，所述助劑選自：至少一種惰 性載體，以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質和/或酶和/或其他用于使真菌毒 素解毒的組分。
[0165] 16.根據實施方案13、14或15之一的添加劑，其特征在于，在所述添加劑中，以最高 10，000U/g，優選地最高1，000U/g，更優選地最高100U/g，和最優選地最高10U/g的濃度包含 至少一種根據實施方案1至11之一的多肽。
[0166] 17.根據實施方案13至16之一的添加劑，其特征在于，所述添加劑以經包囊或經包 衣的形式存在。
[0167] 18.根據實施方案13至17之一的添加劑用于以水解方式裂解在飼料中、在食物中 或在中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的用途，所述飼料特別地為用 于豬、家禽和水產養殖的飼料。
[0168] 19.用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方 法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物被具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其中在所述功能性變體與至少一個所 述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0169] 20.根據實施方案19的方法，其特征在于，在根據實施方案14至17之一的添加劑中 使用所述多肽。
[0170] 21.根據實施方案20的方法，其特征在于，將所述多肽或添加劑與被玉米赤霉烯酮 和/或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻混，使所述被污染的飼料或 食物與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染的飼料或食物中所包含的玉 米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。
[0171] 22.根據實施方案19至21之一的方法，其特征在于，至少70 %，優選地至少80%，特 別優選地至少90%的所述玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物被水解。
【主權項】
1. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其特征 在于，所述多肽是具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶，其中在所述功 能性變體與所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少70%。2. 根據權利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一個保守氨基酸序列區段或 其功能性變體，其中所述氨基酸序列區段的功能性變體具有至少70%，優選地至少84%，更 優選地至少92%，和最優選地至少98%的序列同一性，并且所述至少一個保守氨基酸序列 區段選自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+ 145、 +150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257至+ 261、+263 至+270、+272 至+279、+297 至+301、+303 至+313、+24 至 328、+1 至+328。3. 根據權利要求1或2的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個選自下列的位置處具 有關于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個突變:22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、 43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、 146、 148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、 198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、 233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、 281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、 323、325和326。4. 根據權利要求1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有選自下列的關于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個突變：D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、 R31A、F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、 S69G、P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、 L132V、A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、 L170R、A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、 V197C、V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、 Q209R、L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、 K222Q、G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、 S248T、S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、 E269H、E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、 I285L、I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、 D309A、A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。5. 根據權利要求1至4之一的多肽，其特征在于，包含至少一個選自SEQ ID No.32-69的 下列氨基酸基序。6. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物從而產生用于 豬、家禽或水產養殖的飼料的添加劑，所述添加劑用于添加至食品或干酒糟，其特征在于， 所述添加劑包含至少一種具有SEQ ID No.l的氨基酸序列或其功能性變體的多肽，其中在 所述功能性變體與所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少70% ;并且任選地包含助劑。7. 根據權利要求6的添加劑，其特征在于，包含至少一種根據權利要求1至5之一的多 肽。8. 根據權利要求6或7之一的添加劑，其特征在于，所述助劑選自：至少一種惰性載體， 以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質和/或酶和/或其他用于使真菌毒素解毒的 組分。9. 根據權利要求6、7或8之一的添加劑，其特征在于，在所述添加劑中，以最高10，000U/ g，優選地最高1，〇〇〇U/g，更優選地最高100U/g，和最優選地最高10U/g的濃度包含至少一種 根據權利要求1至5之一的多肽。10. 根據權利要求6至9之一的添加劑，其特征在于，所述添加劑以經包囊或經包衣的形 式存在。11. 至少一種具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列或其功能性變體的多肽用于以水解方式 裂解在飼料中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生 物的用途，所述飼料特別地為用于豬、家禽和水產養殖的飼料，其中所述功能性變體與所述 氨基酸序列之間的序列同一性為至少70%。12. 用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方法，其 特征在于，所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生物被具有SEQ ID No. 1的氨 基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其中在所述功能性變體與所述氨基酸序列之間的序 列同一性為至少70 %。13. 根據權利要求12的方法，其特征在于，在根據權利要求6至10之一的添加劑中使用 所述多肽。14. 根據權利要求13的方法，其特征在于，將所述多肽或添加劑與被玉米赤霉烯酮和/ 或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻混，使所述被污染的飼料或食物 與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染的飼料或食物中所包含的玉米赤 霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。15. 根據權利要求12至14之一的方法，其特征在于，至少70%，優選地至少80%，特別優 選地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生物被水解。
【文檔編號】C12N15/55GK106085983SQ201610373145
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2014年8月27日
【發明人】S·弗魯豪夫, M·薩姆海塞爾, M·費菲爾, D·摩爾, G·沙特茲邁爾, E·M·賓德
【申請人】愛爾伯股份公司