一種利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法。該方法首先在光敏材料表面實現細胞體外培養，體外培養結束后通過施加光場，材料表面發生光電轉變，實現細胞脫附，避免了傳統酶解法對細胞功能造成的損傷。本發明所利用的光敏材料為具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜。該方法利用可見光獲得的細胞片層保留了重要的細胞外基質蛋白，如離子通道、連接蛋白等，細胞間可以更好地進行信號傳遞，保持功能的協調一致。大大提高了細胞的利用率和轉移細胞的活性。所述實驗方法流程簡單，實驗條件溫和，成本低，具有良好的可操作性，且便于推廣實施。
【專利說明】
一種利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法
技術領域
[0001]本發明屬于組織工程領域，具體涉及一種利用可見光照射獲取體外培養的細胞/ 細胞薄層的方法。【背景技術】
[0002]近年來，由于現有組織工程方法的局限，細胞片層組織工程技術在組織修復及重建過程中，作為一種新的可構建的類組織及類器官結構表現出巨大潛力。細胞片層最大的優勢在于可以保存組織所必須的細胞表面蛋白、細胞外基質環境及細胞間連接的完整。目前，細胞片層技術被用于治療食管癌，心臟、角膜、肝臟、牙周及泌尿系統疾病等，并表現出光明的前景。因此，如何以溫和的非侵入式的方法獲得完整的細胞片層對于細胞片層組織工程來說是關鍵問題。目前，大多數的細胞片層獲取都是采用溫敏系統，即通過降低溫度改變材料表面的親疏水性進而獲得細胞片層。但長時間的低溫在一定程度上會損傷細胞功能。近年來，一些其他的細胞收割方法也相繼被報道，包括電致、磁致、pH改變及紫外光致細胞脫附等。事實上，在這些脫附過程中，也伴隨著細胞質蛋白分子的調節而影響細胞功能。 因此，更有效的及更易操縱的細胞收割方法對細胞片層技術的發展非常關鍵。
[0003]洪逸等采用光敏半導體二氧化鈦通過紫外光照改變材料表面的親疏水性成功獲得細胞片層(Yi Hong，Mengfei Yu，Wenjian Weng，et al.Light-1nduced cell detachment for cell sheet technology,B1materials,34(2013)11-18)。但是，紫外光對細胞存在一定的毒性并可能造成基因突變，故這種方法也存在一定缺陷。因此，利用可見光實現細胞脫附受到關注。
[0004]太陽能是人類取之不盡的清潔能源，傳統的太陽能電池材料即對可見光敏感，并可將其轉化為電能。選取對可見光響應的帶有p/n結的太陽能電池基板作為細胞培養表面， 通過可見光的強弱、p/n結的深度、表面粗糙度及細胞的種類等來調控光敏材料對可見光的響應及光電效應，研究可見光下材料與細胞或細胞與細胞之間的相互作用，對于細胞片層脫附、組織工程、細胞治療等的發展都有重要的意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，該方法利用具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜作為細胞培養表面，可以在可見光照射下高效溫和的獲取低損傷的完整細胞片層。
[0006]本發明利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，包括以下步驟:
[0007]a.將具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；
[0008]b.將上述具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜作為體外細胞培養表面，在其表面以3 X 104?1 X 106個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養基，并放入37攝氏度恒溫及5% 二氧化碳的細胞培養箱中培養1?1 〇天；
[0009]C.將經上述培養后的培養表面移入PBS中，以波長為400?800納米、強度30?200mW/cm2的可見光照射上述光敏半導體片材或其薄膜1?20分鐘，即可使培養后的細胞或細胞薄層脫附。
[0010]上述技術方案中，所述的具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜，其中光敏半導體為P型或n型的單晶硅、多晶硅或者非晶硅，在其表面通過施主元素(磷或銻元素)擴散或受主元素(硼或銦元素)擴散形成有p/n結。所述p/n結的結深為0.3?2wii。
[0011]所述的具有P/n結的光敏半導體片材或其薄膜的表面通常為絨面，即具有金字塔結構的粗糙表面。
[0012]所說的光敏半導體片材的厚度通常為100微米?1000微米。
[0013]所說的光敏半導體薄膜的厚度通常為300納米?20微米。
[0014]所述的光敏半導體片材表面的粗糙度為1?10微米。
[0015]所說的光敏半導體薄膜表面的粗糙度為100?500納米。
[0016]所述的細胞為在體外模擬生理環境下培養的貼壁細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內皮細胞及干細胞。
[0017]本發明方法選擇在可見光照射下表面可發生光電轉變的含有p/n結的光敏半導體材料，在細胞培養過程中將其作為細胞培養表面，所培養的細胞在經可見光照射后，培養表面發生光電轉變，細胞自發從培養器具表面脫離，實現細胞/細胞薄層的脫附。
[0018]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0019]本發明方法避免了傳統酶解法對細胞功能造成的損傷，保留了重要的細胞外基質蛋白，如離子通道、連接蛋白等，細胞間可以更好地進行信號傳遞，保持功能的協調一致，且大大提高了細胞的利用率和轉移細胞的活性。本發明具有高效的、低損傷、操作簡便并適用細胞范圍廣等特點，具有很強的實用性。本發明細胞培養表面所需的光敏材料成本低，易于實現，便于推廣應用。對于散在的細胞，本發明方法可使90%以上的細胞脫附；對于細胞薄層，則可使細胞薄層完整脫附。【附圖說明】
[0020]圖1為實施例1中培養細胞在可見光光照前的激光共聚焦圖。
[0021]圖2為實施例1中培養細胞在可見光光照后的激光共聚焦圖。[〇〇22]圖3為細胞脫附流程圖。
[0023]圖4為熒光顯微鏡獲得的細胞片層再迀移熒光圖片。【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例和附圖來詳細說明本發明，但本發明并不僅限于此。
[0025]購買p型或n型的單晶、多晶及非晶硅片，經過磷、硼、銦及銻元素擴散后，獲得含有結深為0.3?2WI1的p/n結，并以此片材或薄膜作為細胞培養表面，進行下列培養。片材的厚度為100微米?1000微米，粗糙度為1?10微米，薄膜的厚度為300納米?20微米，粗糙度為 100?500納米，片材或薄膜表面均呈絨面。
[0026]實施例1
[0027]在上述單晶硅基板表面(p/n結深0.3WH，磷擴散)，進行成骨細胞體外培養，接種密度為3X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養1天后，以波長為400?800納米、強度30mW/cm2的可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射20分鐘，即可使95 % 細胞從表面脫離。圖1和圖2分別為采用激光共聚焦顯微鏡所觀察到的實施例1中培養細胞在可見光照前、后的激光共聚焦顯微圖。對比圖1和圖2,可以看出經可見光照射后大量細胞脫離，說明可見光實現單細胞的脫附。[〇〇28] 實施例2
[0029]在上述多晶硅基板表面(p/n結深0.5wn，磷擴散)，進行成骨細胞體外培養，接種密度為IX 105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養培養5天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射10 分鐘，即可使細胞片層從表面脫離。圖3為采用Nikon相機所觀察到的實施例2中培養細胞片層在可見光照前、后的照片。可以看出經可見光照射后整個細胞片層實現完整脫附。
[0030]實施例3
[0031]在上述非晶硅基板表面(p/n結深0.9WH，磷擴散)，進行成骨細胞體外培養，接種密度為5X105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度70mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射8分鐘， 即可使細胞片層從表面脫離。圖4為采用熒光顯微鏡所觀察到的實施例3中培養細胞片層在可見光照后脫附再培養2天后的迀移熒光圖片。可以看出經可見光脫附后的細胞片層重新再培養后，能夠很好的爬出新的細胞，并保持良好的細胞形態及活力，說明可見光脫附的細胞片層保持了良好的再迀移性能，這在組織工程中細胞片層的再應用是很關鍵的。
[0032]實施例4
[0033]在上述單晶硅基板表面(p/n結深lwii，硼擴散)，進行成骨細胞體外培養，接種密度為1 X 106個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養1天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度40mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射15分鐘， 即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0034]實施例5
[0035]在上述非晶硅基板表面(p/n結深2WH，硼擴散)，進行成骨細胞體外培養，接種密度為5 X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養10天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射5分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0036]實施例6
[0037]在上述多晶硅基板表面(p/n結深2WH，硼擴散)，進行成骨細胞體外培養，接種密度為8X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養7天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度200mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射1分鐘， 即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0038]實施例7
[0039]在上述多晶硅基板表面(p/n結深lwii，銦擴散)，進行小鼠成纖維細胞體外培養，接種密度為IX 105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度30mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射6 分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0040]實施例8
[0041]在上述單晶硅基板表面(p/n結深2wii，銦擴散)，進行成肌細胞體外培養，接種密度為2X105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養5天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射12分鐘， 即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0042]實施例9
[0043]在上述非晶硅基板表面(p/n結深lwii，銦擴散)，進行小鼠上皮細胞體外培養，接種密度為2X105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射3分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0044]實施例10
[0045]在上述非晶硅基板表面(p/n結深2wn，銻擴散)，進行大鼠骨髓間充質干細胞體外培養，接種密度為3 X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養10 天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射10分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0046]實施例11
[0047]在上述單晶硅基板表面(p/n結深2WH，銻擴散)，進行小鼠成纖維細胞體外培養，接種密度為5X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養1天后，以波長為400?800納米、強度30mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射5分鐘，90 %細胞從基板表面脫離。
[0048]實施例12
[0049]在上述多晶硅基板表面(p/n結深2WH，銻擴散)，進行成肌細胞體外培養，接種密度為5X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養1天后，以波長為 400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射10分鐘，92 %的細胞從基板表面脫離。
[0050]實施例13
[0051]在上述單晶硅基板表面(p/n結深2WH，銦擴散)，進行小鼠上皮細胞體外培養，接種密度為5X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養箱中培養1天后，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射10分鐘，96%的細胞從基板表面脫離。
[0052]實施例14
[0053]在上述非晶硅基板表面(p/n結深2wn，銻擴散)，進行大鼠骨髓間充質干細胞體外培養，接種密度為6 X 104個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5 %二氧化碳的細胞培養箱中培養1天后，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射20分鐘， 91 %的細胞從基板表面脫離。
【主權項】
1.一種利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特征在于，包括以下 步驟:a.將具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；b.將上述具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜作為體外細胞培養表面，在其表面以3 X 104?1 X 106個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養基，并放入37攝氏度恒溫及5%二氧化 碳的細胞培養箱中培養1?10天；c.將經上述培養后的培養表面移入PBS中，以波長為400?800納米、強度30?200mW/cm2 的可見光照射上述光敏半導體片材或其薄膜1?20分鐘，即可使培養后的細胞或細胞薄層 脫附。2.根據權利要求1所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜，其中光敏半導體為p型或n型的單晶 娃、多晶娃或者非晶娃，在其表面通過施主元素擴散或受主元素擴散形成有p/n結。3.根據權利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述p/n結的結深為0 ? 3?2ym。4.根據權利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的具有p/n結的光敏半導體片材或其薄膜的表面為絨面。5.根據權利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所說的光敏半導體片材的厚度為100微米?1000微米。6.根據權利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所說的光敏半導體薄膜的厚度為300納米?20微米。7.根據權利要求5所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的光敏半導體片材表面的粗糙度為1?10微米。8.根據權利要求6所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的光敏半導體薄膜表面的粗糙度為100?500納米。9.如權利要求1所述的利用可見光照射獲取體外培養的細胞/細胞薄層的方法，其特征 在于，所述的細胞為成骨細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內皮細胞或干細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK106085948SQ201610429597
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發明人】程逵, 王小召, 翁文劍
【申請人】浙江大學