一種空間甲基桿菌lct?s10?2的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株“神舟九號”飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿菌LCT?S10?2，為好氧細菌，短桿狀的革蘭氏染色可變菌種（圖1），化能異養菌，兼性甲基營養菌和罕有兼性甲烷營養菌，菌株生長緩慢。對該菌進行16S rRNA測序，鑒定其為甲基桿菌屬成員。進行了全基因組測序分析，其基因組大小為4.57Mbp，GC含量為66.84%，預測基因數4946個，LCT?S10?2的蛋白被分類注釋為20類COG家族。LCT?S10?2菌在環氧樹脂、硫化天然橡膠表面能生長，有腐蝕生物膜生成；在酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、聚乙烯醇縮甲醛表面不能生長，無腐蝕生物膜生成。對研究密閉飛行器內微生物種類分布、耐腐蝕材料的選擇等提供了一定幫助。CGMCC 1257620160601
【專利說明】
一種空間甲基桿菌LCT-S10-2
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域;更具體地，本發明涉及空間甲基桿菌LCT-S10-2及其生 物學特性、全基因組學測序。
【背景技術】
[0002] 隨著航天技術的發展，人類的外太空探索活動越來越頻繁。在地面上微生物幾乎 無處不在，大多數存在于人類皮膚、口腔、鼻咽部和胃腸道。盡管載人飛船及內部物品等經 過嚴格的真空消毒，載人航天器密閉環境條件下仍然容易滋生細菌和真菌等微生物，這些 微生物能在密閉艙室內的金屬、高分子復合材料等表面形成生物膜，它們的生長繁殖和代 謝會對材料產生腐蝕，嚴重威脅空間站的長期在軌運行安全，縮短空間站的服役時間。研究 密閉航天器內的微生物種類對于航天器內微生物的安全防護具有重要的意義。
[0003] 早期人們對許多環境微生物的認識僅來自于對16S rRNA的研究，一些重要的遺傳 信息很難獲得。現在越來越多的新的培養和分子生物學方法，例如基因組學、蛋白質組學、 宏基因組學等，被用來研究新獲得微生物的潛在特征和功能等。
[0004] 隨著人類基因組計劃的實施和進行，生物體基因組研究已經成為生命科學研究的 前沿領域，而與之相對應的微生物基因組研究正在廣泛開展。細菌是微生物的一種，其基因 組小、操作簡單且實驗周期短，其研究的工作可為人類基因組研究提供有益的參考；同時隨 著測序技術的更新換代和高通量測序技術的出現，細菌基因組的測序成本和所需時間已大 幅度降低。初步研究了該菌的表型及生理生化特征，對研究密閉飛行器內微生物種類分布、 材料的微生物腐蝕等提供了幫助。
【發明內容】
[0005] 本發明的菌株LCT-S10-2為"神舟九號"飛船的返回艙內冷凝水分離得到。
[0006] 本發明提供的該菌株，其保藏號為CGMCC No. 12576。
[0007] 菌株LCT-S10-2為好氧細菌，短桿狀的革蘭氏染色可變菌種（圖1)，化能異養菌，兼 性甲基營養菌和罕有兼性甲烷營養菌，菌株生長緩慢。菌體呈桿狀，表面沒有鞭毛、菌毛等 結構。LCT-S10-2菌在環氧樹脂、硫化、硫化天然橡膠表面能生長，有腐蝕生物膜生成;在酯 類聚氨酯、醚類聚氨酯、聚乙烯醇縮甲醛表面不能生長，無腐蝕生物膜生成。
[0008] 所述的菌株LCT-S10-2菌株，進行全基因組測序，并進行分析，其基因組大小為 4.57Mbp，GC含量為66.84%，預測基因數4946個(表1)，310-2的蛋白被分類注釋為20類〇?家 族(圖2)。
[0009] 表1 Methylobacterium sp. LCT-S10-2菌株核苷酸含量和基因水平的基因組
說明：Gene Number預測結果的基因個數;Gene Length (bp)預測得到的基因總長 度；GC Content in Gene Region (%)預測基因的GC含量；Gene Length / Genome (%):基 因占組裝序列的比例;Gene Average Length (bp):預測基因的平均長度。
【附圖說明】
[0010] 圖1 LCT-S10-2的革蘭氏染色結果。
[0011] 圖2 LCT-S10-2基因組20個C0G分類的基因數統計。
[0012] 圖3環氧樹脂為唯一碳源培養條件下LCT-S10-2的增長曲線。
[0013] 圖4 LCT-S10-2對環氧樹脂腐蝕的SEM觀察。
[0014] 圖5酯類聚氨酯為唯一碳源培養下LCT-S10-2的增長曲線。
[0015] 圖6 LCT-S10-2對酯類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0016] 圖7醚類聚氨酯為唯一碳源培養下LCT-S10-2的增長曲線。
[0017] 圖8 LCT-S10-2對醚類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0018] 圖9硫化天然橡膠為唯一碳源培養下LCT-S10-2的增長曲線。
[0019] 圖10 LCT-S10-2對硫化天然橡膠腐蝕的SEM觀察。
[0020]圖11聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源培養下LCT-S10-2的增長曲線。
[0021] 圖12 LCT-S10-2對聚乙烯醇縮甲醛腐蝕SEM觀察。
【具體實施方式】
[0022] 下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0023] 下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0024] 實施實例一:菌株LCT-S10-2培養。
[0025]菌株LCT-S10-2為"神舟九號"飛船的返回艙內冷凝水分離得到。菌株分別于 37°C培養箱或搖床中進行靜置或振蕩培養，液體培養基為腦心浸出液培養基 (BHI，0xi〇d)，配方為37 g/L BHI;固體培養基為MH平板。
[0026] 實施實例二:菌株LCT-S10-2菌種鑒定。
[0027] 菌株LCT-S10-2接種至BHI液體培養基，37°C，180 rpm過夜培養，6000 rpm離 心5 min收集菌體，棄上清。利用Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒（Code No . 51304，詳細步驟見產品說明書）提取收集的菌體的基因組DNA。以LCT-S10-2的基因組 DNA為模板，利用細菌16s rRNA通用測序引物27F(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R (5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增其 16s rRNA片段并測序，得到其堿 基序列。
[0028] 實施實例三:菌株LCT-S10-2的革蘭氏染色。
[0029] 采用革蘭氏染色試劑盒(Code No. G1060，Solarbio)對LCT-S10-2菌體進行染 色。
[0030] BHI液體培養基過夜培養菌體，將菌液滴于載玻片中央，在酒精燈上略加溫，使之 迅速干燥。結晶紫、沙黃染色液對干燥菌體一次染色脫色，詳細步驟見產品說明書。染色完 成并晾干后，置于光學顯微鏡下觀察染色情況。
[0031]實施實例四：菌株LCT-S10-2的電子顯微鏡觀察。
[0032] 分別在透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡（SEM)下觀察菌體形態。1ml培養 至穩定前期的菌液，6000 rpm離心5 min收集菌體，棄上清;PBS緩沖液洗滌一次后將菌體懸 浮至合適濃度。菌懸液等體積與4%多聚甲醛+0.5%戊二醛溶液混合，滴在有支持膜的銅網 上，15 min后用濾紙吸取未吸附樣品；吸取磷鎢酸染液小心滴在銅網上，染色1 min后用濾 紙吸取未吸附的樣品；樣品干燥后在Philips EM 400T型透射電子顯微鏡(TEM)下觀察菌體 形態。首先用2.5%戊二醛、PBS緩沖液以及1%鋨酸清洗菌體，乙醇梯度脫水并乙酸異戊酯置 換，樣品干燥后做噴金處理(4)，處理好的樣品置于FEI Quanta 200型掃描電鏡下觀察。 [0033]實施實例五:菌株LCT-S10-2對5種高分子材料腐蝕實驗觀察。
[0034]對照組：向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機鹽基礎培養基，每個培養瓶中加 入10個試樣，透氣膜封口，放入32°C，相對濕度為75%的恒溫培養箱中。每株菌和每個材料準 備3個平行樣品。設置4個時間點：1、3、6、10周取樣。
[0035]實驗組：向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機鹽基礎培養基，每個培養瓶中加 入10個試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32°C，相對濕度為75%的恒溫培養箱中。每 株菌和每個材料準備3個平行樣品。設置4個時間點：1、3、6、10周取樣。
[0036]在各個時間點測定培養液600 nm波長下的吸光度，判斷細菌利用高分子材料作為 唯一碳源的生長情況。
[0037]表面微生物膜和腐蝕形態SEM觀察：在各個時間點，分別從對照組和實驗組的3個 平行樣中分別取出一塊試樣，在無菌操作臺中進行。生物膜固定:將樣品置于培養皿，沿壁 緩加固定液(0.1 M，pH 7.0的磷酸鹽緩沖的2.5%戊二醛），將樣品淹沒至少5 mm，固定4 h。 脫水:從固定液中取出樣品，蒸餾水清洗樣品膜3次，每次15 min。依次用30%、50%、70%、85% 和95%的乙醇溶液脫水，每級15~20 min，用100%的乙醇溶液脫水2次，每次15~20 min。 干燥:將試樣放入培養皿中，倒入5 mL六甲基二娃胺燒浸沒3min，通風處干燥。噴金:樣品做 SEM觀察時，樣品必須有良好的導電性，對于不導電樣品，要設法使其具有導電性。完成這個 過程就要在樣品表面噴鍍一層導電層。對朝上面噴金處理。然后利用SEM觀察。
[0038]實施實例六:菌株LCT-S10-2的基因組測序、組裝及注釋。
[0039] 基因組DNA樣品委托安諾優達有限公司進行全基因組序列測定、基因預測、基因功 能注釋、非編碼RNA預測等工作，序列分析工作委托安諾優達有限公司完成。
[0040] 基因組DNA提取后進行質量鑒定，在濃度和純度達到測序要求后進行全基因組測 序。利用Covaris進行基因組DNA片段化，構建插入片段約300-500 bp的基因組測序文庫， 通過橋式PCR擴增得至ijDNA簇，然后采用Illumina Hiseq2000測序技術完成該菌株的基因組 掃描測序，獲得約1 Gb的原始測序數據。Illumina HiSeq2000測序得到的原始圖像數據 經過Base Calling轉化為序列數據，結果以FASTQ文件格式來存儲，包含測序read的序 列信息以及測序質量信息；原始數據經過預處理去除接頭、引物及低質量數據后，利用 SOAPdenovo (http: //soap · genomics · org · cn/)拼接軟件對優化序列進行多個Kmer參數 的拼接，得到最優的組裝結果，并運用GapCloser軟件對組裝結果進行局部內洞填充和堿 基校正；分別利用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進行預 測；利用Glimmer 3 · 0(http: //www. cbcb · umd · edu/sof tware/glimmer/)軟件進行基因預 測;利用各種數據庫進行基因功能注釋和分類。
[0041] 關于保藏的LCT-S10-2菌株的說明 A. 菌種的保藏單位名稱和地址 名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所 B. 交機構保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏機構給予的保藏號 CGMCC No.12576 D. 分類命名 甲基桿菌 Methylobacterium sp.〇
【主權項】
1. 一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿菌LCT-S10-2,其保藏 號為 CGMCC 12576。2. 根據權利要求1所述的一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿 菌LCT-S10-2，為好氧細菌，短桿狀的革蘭氏染色可變菌種，化能異養菌，兼性甲基營養菌和 罕有兼性甲烷營養菌，菌株生長緩慢;對該菌進行16S rRNA測序，鑒定其為甲基桿菌屬成 員。3. 根據權利要求1所述的一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿 菌LCT-S10-2,進行全基因組測序并進行分析。4. 根據權利要求1所述的一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿 菌LCT-S10-2,進行高分子材料腐蝕特性試驗并分析。
【文檔編號】C12R1/01GK106085910SQ201610455941
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】劉長庭, 徐綢, 張學林, 周宏 , 方向群, 姜學革, 劉巖, 潘磊, 黃兵, 李佳, 余昳
【申請人】中國人民解放軍總醫院