一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌及其生產的菌劑和應用
【專利摘要】本發明公開了一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌株M6，經鑒定為無色桿菌(Achromobacter dolens)，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2016年5月11日，保藏編號為CCTCC NO:M 2016257；本發明還公開了降解菌株M6在生產苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌劑中的應用，該降解菌劑能降解氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲等多種苯甲酰脲類殺蟲劑，可在短時間內使土壤或水體環境中殘留的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率達90％以上；本發明的降解菌劑可以用發酵工業通用發酵設備進行生產，具有生產成本低，使用方便，去除效果好的優點。CCTCC NO: M 201625720160511
【專利說明】
一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌及其生產的菌劑和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及環境污染微生物修復，具體涉及一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌及其生 產的菌劑和應用。
【背景技術】
[0002] 苯甲酰脲類殺蟲劑，包括氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲等，為幾丁質殺蟲抑制劑，通過抑 制幾丁質合成致使昆蟲死亡。苯甲酰脲類殺蟲劑對變態昆蟲，特別是鱗翅目幼蟲表現出很 好的殺蟲活性，用于防治多種害蟲，如粘蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、毒蛾、菜青蟲、松毛蟲、小 菜蛾、稻縱卷葉螟、梨小食心蟲等，并對有機磷、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯產生抗性的害蟲 具有良好效果，還可與阿維菌素等共同施用防治椰心葉甲，廣泛施用于水稻、小白菜、油菜、 荔枝、龍眼、茶等作物。2014年全球苯甲酰脲類殺蟲劑銷售額為7.19億美元，且呈持續增長 趨勢。
[0003] 苯甲酰脲類殺蟲劑藥效速度較慢，殘效期較長，主要品種除蟲脲在不同類型農田 土壤中的分解半衰期為8~16周。此類農藥主要環境行為有淋溶、水解、光解、微生物降解。 殘留農藥主要集中于表層土壤中，由于淋溶作用而緩慢向深層迀移;土壤中的苯甲酰脲類 殺蟲劑隨徑流迀移到鄰近的河流、湖泊中，由于太陽光的照射而發生光解，大氣中的農藥也 會由于顆粒物的沉降而進入水體，使水體成為該類農藥存在的又一個重要場所;在水體及 土壤中皆可發生水解和微生物降解，而微生物在苯甲酰脲類殺蟲劑降解中起主導作用。
[0004] 苯甲酰脲類殺蟲劑施用后，在強光、高溫、高濃度的情況下將引起藥害;此類農藥 在土壤中殘效期較長，分解產物也具有較大毒性，在蔬菜上的殘留混合物導致小鼠 DNA雙鏈 的斷裂，產生致癌、致畸效應或者其他嚴重的疾病;且其及其分解產物會從土壤迀移進入地 下水，造成生產生活水源污染;對家蠶、蜜蜂以及水生甲殼類和節肢類動物，尤其對其幼體 的毒害較大，具有遺傳毒性。
[0005] 國內外對苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌報道較少，目前降解菌種類僅有青霉菌、芽枝 霉菌、曲霉菌、木霉菌、紅球菌、副球菌，降解效率67 %~89%不等。但到目前為止，還未見能 降解氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲等多種苯甲酰脲類殺蟲劑生物修復技術專利的研究和應用報 道。
【發明內容】
[0006] 發明目的:針對現有技術存在的問題，本發明提供一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌， 用于降解土壤或水體環境中殘留的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲苯甲酰脲類殺蟲劑;本發明的另 一目的是提供該苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌生產的菌劑;該菌株制備的降解菌劑能降解氟 鈴脲、除蟲脲、滅幼脲等多種苯甲酰脲類殺蟲劑，本菌劑可在短時間內使土壤或水體環境中 殘留的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率達90%以上;本發明的降解菌劑可以用發酵工業通 用發酵設備進行生產，具有生產成本低，使用方便，去除效果好的優點。
[0007] 技術方案:為了實現上述目的，如發明所述的一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌株M6， 經鑒定為無色桿菌(Achromobacter dolens)，已保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱 CCTCC)，保藏地址：中國.武漢.武漢大學，郵編:430072，保藏時間為2016年5月11日，保藏編 號為CCTCC N0:M 2016257。該菌株是發明人從海南海口市海南潤禾農藥有限公司農藥廢水 生化處理池的活性污泥中分離到的。降解菌株M6主要生物學特性為:G'在固體培養基上生 長3d后，菌落微凸，半透明，無色素，經過負染，在透射電子顯微鏡下該菌呈桿狀，有鞭毛，無 莢膜，不形成芽孢，大小為0.4-0.7 XI. 4-2.8μηι，好氧生長，硝酸鹽反應為陽性，可利用葡萄 糖、葡萄糖酸、己二酸、檸檬酸，具有堿性磷酸酶活性，亞硝酸鹽、吲哚產生、明膠液化反應陰 性。
[0008]本發明所述的降解菌株Μ6在降解苯甲酰脲類殺蟲劑中的應用。
[0009]進一步地，所述的降解菌株Μ6在降解土壤或水體環境中苯甲酰脲類殺蟲劑中的應 用。
[0010] 進一步地，所述的苯甲酰脲類殺蟲劑為氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲中的一種或多種。 本發明中的苯甲酰脲類殺蟲劑氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲均購買于阿拉丁試劑上海晶純生化 股份有限公司。
[0011] 本發明所述降解菌株Μ6在生產苯甲酰脲類殺蟲劑農藥殘留降解菌劑中的應用。
[0012] 本發明還提供一種利用所述菌株Μ6生產的降解菌劑。
[0013] 進一步地，所述降解菌劑，通過以下步驟所制成：
[0014] 1)將降解菌株Μ6培養好的試管液按1-1.5%體積比的接種量接種于發酵培養基 中，振蕩培養至對數期，制得發酵菌種；
[0015] 2)將上述培養好的發酵菌種按8-10 %體積比的接種量接種入種子罐的培養基中， 培養至對數生長期，制得種子液；
[0016] 3)將種子液按8-10 %體積比的接種量接入生產罐的培養基中培養；
[0017] 4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1: (0.8-1.0)，攪拌速度 為170-230rpm，培養溫度為28-32°C，全流程培養時間為36-48小時，發酵結束后菌體數量達 到10億個/mL以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
[0018] 進一步地，所述的降解菌劑，其中所述發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培 養基配方相同，均為葡萄糖〇 . lwt %、NaCl 1. Owt %、蛋白胨0.5wt %、酵母膏0.25wt %， ρΗ7·2-7·5〇
[0019] 本發明所述的降解菌劑在降解苯甲酰脲類殺蟲劑中的應用。
[0020] 進一步地，所述的降解菌劑在降解土壤或水體環境中苯甲酰脲類殺蟲劑中的應 用。
[0021] 進一步地，所述的苯甲酰脲類殺蟲劑為氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲中的一種或多種。
[0022] 有益效果：由現有技術相比較，本發明經分離篩選獲得一株無色桿菌 Achromobacter dolens Μ6,用于降解土壤或水體環境中殘留的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲苯 甲酰脲類殺蟲劑;該菌株制備的降解菌劑能降解氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲等多種苯甲酰脲類 殺蟲劑，本菌劑可在短時間內使土壤或水體環境中殘留的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率 達90%以上，消除農產品中氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲殘留，解決氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲對土 壤水體環境、農作物和人體健康的危害問題。
[0023] 本發明的降解菌劑可以用發酵工業通用發酵設備進行生產，具有生產成本低，使 用方便，去除效果好的優點，適合治理土壤和水體環境中苯甲酰脲類殺蟲劑造成的污染;本 發明對于保護生態環境，降低殺蟲劑對農作物藥害，保護人民的身體健康，提高農產品的附 加值具有重要的意義。
【附圖說明】
[0024] 圖1為菌株M6菌落照片；
[0025] 圖2為菌株M6電鏡照片；
[0026]圖3為菌株M6降解氟鈴脲的HPLC分析圖譜(A:ck;B:處理）；
[0027]圖4為菌株M6降解除蟲脲的HPLC分析圖譜(A:ck;B:處理）；
[0028]圖5為菌株M6降解滅幼脲的HPLC分析圖譜(A: ck;B:處理）。
【具體實施方式】
[0029]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0030] 實施例1
[0031] 菌株M6的分離和鑒定：
[0032] 用來富集苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌株的富集基質取自海南海口市海南潤禾農藥 有限公司農藥廢水生化處理池的活性污泥，取活性污泥5.0g加入基礎鹽培養基中，加入 50mg · Γ1的滅幼脲，30°C，180rpm培養7d，以5%的接種量轉接到相同的培養基中，連續轉接 3次，梯度稀釋富集液，取1〇_ 4~1〇_7稀釋度的富集液各O.lmL涂布于加有100mg · Γ1滅幼脲 的固體培養基平板上，30°C培養4d后，挑取長出的單菌落接種于含100mg · Γ1各種苯甲酰脲 類殺蟲劑(氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲）的培養基中，30°C，180rpm培養5d，驗證其降解效果。基 礎鹽培養基配方（1L)為：5 · 0g葡萄糖、1 · 0gNH4N03、1 · OgNaCl、1 · 5gK2HP〇4、0 · 5gKH2P〇4、 0.2gMgS〇4 · 7Η20·ρΗ 7.0.固體培養基加15.0g瓊脂。
[0033] 降解效果的驗證方法:在培養液中加入等體積的二氯甲烷進行全量提取，劇烈振 蕩后靜置分層，然后取lmL下層二氯甲烷揮發完全后，加入lmL甲醇溶解（色譜純），用濾膜 (孔徑0.22μπι)過濾。采用紫外和高效液相色譜測定提取液中苯甲酰脲類殺蟲劑的含量，液 相色譜條件:流動相為甲醇:水(80:20，￥/'\〇,2〇1^1〇218 003 3口116代1反相柱(5以111，4.6111111 X 250mm，Agi lent，USA)，柱溫為室溫，PDA檢測器，測定波長254nm，進樣量10yL，流速為 1 .OmL · min-、外標法按峰面積定量。
[0034]從富集液中，分離到1株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌，命名為M6,該菌在3d內對 200mg · I/1的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率均達到90%以上。菌株M6在固體培養基上生 長3d后，菌落微凸，半透明，無色素，如圖1所示；經過負染，在透射電子顯微鏡下該菌呈桿 狀，有鞭毛，無莢膜，不形成芽孢如圖2所示。菌株M6為0-，大小為0.4-0.7 X 1.4-2.8μηι，好氧 生長，硝酸鹽反應為陽性，可利用葡萄糖、葡萄糖酸、己二酸、檸檬酸，具有堿性磷酸酶活性， 亞硝酸鹽、吲哚產生、明膠液化反應陰性。菌株Μ6的形態和生理生化特征和Bergey's manual of systematic bacteriology上對無色桿菌屬的描述是一致的。
[0035]以菌株M6的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因序列通用引物進行PCR擴增， 得到長度為1392bp的16S rDNA基因序列，如SEQ ID No:l所示，（Genbank登錄號為 KX348283)。在RDP數據庫(https: //rdp · cme .msu · edu/)中進行Blast，結果表明菌株M6與無 色桿菌屬(Achromobacter sp.)菌株的同源性最近，與模式菌株Achromobacter dolens LMG 26840同源性大于99%，建立系統發育樹，結合形態和生理生化特征，將菌株M6初步鑒 定為無色桿菌(Achromobacter dolens)。將該菌株M6送交位于中國武漢，武漢大學的中國 典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC N0:M 2016257,保藏日期為2016 年5月11日。
[0036] 實施例2
[0037] 培養基中菌株M6對苯甲酰脲類殺蟲劑的生物降解試驗：
[0038]分別在基礎鹽培養基（同實施例1)中加入終濃度為100mg · Γ1的氟鈴脲、除蟲脲、 滅幼脲，按1 %體積比的接種量接入菌株M6菌液，同時分別在基礎鹽培養基（同實施例1)中 加入終濃度為l〇〇mg · Γ1的氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲，按1%體積比的接種量接種滅活的菌株 M6設為對照1、對照2、對照3,30°C恒溫搖床中培養，定時取樣，采用實施例1中降解效果的驗 證方法通過高效液相色譜檢測菌株對氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解情況，降解結果的HPLC 分析圖譜如圖3-圖5所示，降解率見表1。
[0039] 表1菌株M6在培養基中對氟鈴脲、除蟲脲和滅幼脲的降解效果
[0040]
[0041] 菌株M6在1天內對氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率分別達到45.1 %、43.7%和 49.8 %，2天內對氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率分別達到92.6 %、91.4%和96.1 %，所有 對照的降解率為0。
[0042] 實施例3
[0043]降解菌劑的制備方法
[0044] 1)將菌株M6培養好的試管液按1 %體積比的接種量接種于發酵培養基中，振蕩培 養至對數期，制得發酵菌種；
[0045] 2)將上述培養好的發酵菌種按8% (v/v，以培養基體積為基準）的接種量接種入裝 液量為70%(以發酵罐體積為基準，下同）的500升種子罐的培養基中培養，培養至對數生長 期，制得種子液；
[0046] 3)將種子液按8% (v/v，以培養基體積為基準，下同）的接種量接入裝液量為70% 的生產罐的培養基中培養。
[0047] 4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8,攪拌速度為 170rpm，培養溫度為28°C，整個工藝流程培養時間為48小時，發酵結束后菌體數量達到10 億/mL以上。發酵完成后培養液出罐直接用包裝瓶分裝成液體劑。
[0048] 其中，所述發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培養基配方相同，均為葡萄糖 0· lwt%、NaCll ·Owt%、蛋白胨0· 5wt%、酵母膏0· 25wt%，pH7· 2。
[0049] 實施例4
[0050] 降解菌劑的發酵：
[0051] 1)將菌株M6培養好的試管液按1.5%體積比的接種量接種于發酵培養基中，振蕩 培養至對數期，制得發酵菌種；
[0052] 2)將上述培養好的發酵菌種按10% (v/v，以培養基體積為基準）的接種量接種入 裝液量為70%(以發酵罐體積為基準，下同）的500升種子罐的培養基中培養，培養至對數生 長期，制得種子液；
[0053] 3)將種子液按10% (v/v，以培養基體積為基準，下同）的接種量接入裝液量為70% 的生產罐的培養基中培養。
[0054] 4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8,攪拌速度為230 轉/分，培養溫度為32°C，整個工藝流程培養時間為36小時，發酵結束后菌體數量達到10億/ mL以上。發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體劑。
[0055] 其中，所述發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培養基配方相同，均為葡萄糖 0· lwt%、NaCll ·Owt%、蛋白胨0· 5wt%、酵母膏0· 25wt%，pH7· 5。
[0056] 實施例5
[0057] 降解菌劑的制備方法
[0058] 實施例5降解菌劑的制備方法與實施例4基本相同，不同之處在于步驟4)中在種子 罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.9,攪拌速度為200rpm，培養溫度為30 °C，整個工藝流程培養時間為42小時。
[0059] 實施例6
[0060]菌株M6在土壤中對苯甲酰脲類殺蟲劑的降解試驗
[0061]采取菜園土作為供試土樣。將土樣過2mm篩，取一定量的氟鈴脲、除蟲脲和滅幼脲 乳油溶于丙酮中，將其均勻拌入l〇〇〇g土壤中，使土壤中氟鈴脲、除蟲脲和滅幼脲終濃度均 為10mg · kg<。新鮮的菌株M6降解菌劑，制備方法參見實施例5，5000rpm離心5min后，收集菌 體，用無菌去離子水洗滌3次后再用無菌水懸浮，調節菌體濃度約為1.0X10 9cfu ?mL'以 10%的接種量接入到上述土壤中，于30°C恒溫黑暗培養箱中培養，設不接菌的土壤作為對 照，期間土壤的持水量保持在60%，培養10天后，利用高效液相色譜測定殘留量。土壤中殘 留的氟鈴脲、除蟲脲和滅幼脲的檢測方法參照實施例1的降解效果的驗證方法。測定結果為 菌株M6在10天內對土壤中氟鈴脲、除蟲脲、滅幼脲的降解率分別達到91.5 %、90.2%、 92.1%〇
【主權項】
1. 一株苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌株M6,經鑒定為無色桿菌(Achromobacter dolens)， 已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2016年5月11日，保藏編號為CCTCC NO: Μ 2016257〇2. 權利要求1所述的菌株Μ6在降解苯甲酰脲類殺蟲劑中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，菌株Μ6在降解土壤或水體環境中苯甲酰脲 類殺蟲劑中的應用。4. 根據權利要求2或3所述的的應用，其特征在于，所述的苯甲酰脲類殺蟲劑為氟鈴脲、 除蟲脲、滅幼脲中的一種或多種。5. 權利要求1所述的菌株Μ6在生產苯甲酰脲類殺蟲劑降解菌劑中的應用。6. -種利用權利要求1所述菌株Μ6生產的降解菌劑。7. 根據權利要求6所述的降解菌劑，其特征在于，通過以下步驟所制成： 1) 將降解菌株Μ 6培養好的試管液按1 -1.5 %體積比的接種量接種于發酵培養基中，振 蕩培養至對數期，制得發酵菌種； 2) 將上述培養好的發酵菌種按8-10%體積比的接種量接種入種子罐的培養基中，培養 至對數生長期，制得種子液； 3) 將種子液按8-10%體積比的接種量接入生產罐的培養基中培養； 4) 在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1: (0.8-1.0)，攪拌速度為 170-230rpm，培養溫度為28-32°C，全流程培養時間為36-48小時，發酵完成后培養液出罐直 接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。8. 權利要求6所述的降解菌劑在降解苯甲酰脲類殺蟲劑中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，降解菌劑在降解土壤或水體環境中苯甲酰 脲類殺蟲劑中的應用。10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述的苯甲酰脲類殺蟲劑為氟鈴脲、 除蟲脲、滅幼脲中的一種或多種。
【文檔編號】A62D101/26GK106085899SQ201610396496
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日 公開號201610396496.8, CN 106085899 A, CN 106085899A, CN 201610396496, CN-A-106085899, CN106085899 A, CN106085899A, CN201610396496, CN201610396496.8
【發明人】李怡, 單穎, 李勤奮, 武春媛, 鄧曉
【申請人】中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所