一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌的制作方法

一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚高效降解菌。所述方法是以從石化廠、蚊香廠、農田地等地方采集的含有八氯二丙醚的污泥或土壤為樣本，通過微生物菌種的培養、分離、純化、馴化、篩選，選擇出八氯二丙醚降解菌。本發明首次從土壤和污泥中提取出對八氯二丙醚具有高降解性的產氣腸桿菌菌株M2016517，于2016年5月17日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCC No：60041。該菌株對八氯二丙醚的降解率高達95%。而且本發明的篩選方法可同時達到對菌種篩選和馴化的目的，明顯縮短馴化周期；而且簡單、方便、高效，篩選得到的降解菌對八氯二丙醚具有很高的降解率。GDMCC No：6004120160517
【專利說明】
一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌
技術領域
[0001]本發明屬于微生物技術領域。更具體地，涉及一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法及八氯二丙醚降解菌。
【背景技術】
[0002]八氯二丙醚(簡稱S421)，分子式C6H6Cl8O13八氯二丙醚是一種農藥增效劑，對多種擬除蟲菊酯類農藥有活化增效作用；其為淡黃色液體。有香味，大量用于農藥噴霧劑、蚊香等。
[0003]但是，八氯二丙醚是一種環境行為與滴滴涕類似的有機氯化合物，其性能穩定，在環境中滯留時間長，屬于類持久性有機污染物。而且，八氯二丙醚在生物鏈中會發生生物富集作用，導致在人體和其他生物體中殘留，屬于持久性污染物。因八氯二丙醚具有潛在的三致(致畸、致癌、致突變)效應，我國于2008年I月I日起已全面禁止銷售含八氯二丙醚的農藥。有研究表明，八氯二丙醚吸入染毒可引起小鼠外周血細胞及肝、脾、肺細胞DNA細胞的損傷，提示肺細胞可能是其主要靶細胞;程百里等曾報道，無錫市某廠采用一步法直接合成八氯二丙醚，生產工人肺癌發生率及死亡率都較高Jiyazaki等在對日本婦女的乳汁中的有機氯農藥殘留監測中，在1.5%0V_17+1.95%QFj色譜柱上緊隨著β-六六六出峰后有一個不明色譜峰出現，其相對保留時間為0.85(以狄氏劑的保留時間為1.00)。而且，ECO檢測器對這種化合物更加靈敏。Miyazaki研究報道了人乳中八氯二丙醚的殘留量。2001年歐盟對中國出口茶葉的安全衛士檢測項目中就添加了八氯二丙醚殘留量的檢測，其最大允許殘留量(MRL)為0.01mg/kg。
[0004]盡管八氯二丙醚已被禁用，但是因其在我國使用時間長，且性質穩定，不易被分解，在環境中能長期存在，并通過生物富集作用危害人類健康，因此，探索環保、簡潔、有效的降解八氯二丙醚的方法，具有很重要的必要性和現實意義。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種從土壤或污泥中分離、篩選、馴化能夠降解八氯二丙醚的微生物，以及利用所得該微生物降解八氯二丙醚的方法。
[0006]本發明的目的是提供一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法。
[0007]本發明另一目的是提供一株能夠降解八氯二丙醚的產氣腸桿菌(j5>3iero/7aciera es)菌株M2016 517 ο
[0008]本發明的再一目的是提供一種利用所述產氣腸桿菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法。
[0009]本發明上述目的通過以下技術方案實現: 一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法，是以含有八氯二丙醚的污泥或土壤為樣本，通過微生物菌種的培養、分離、純化、馴化、篩選，選擇出對八氯二丙醚具有良好降解性的降解菌。
[0010]優選地，所述含有八氯二丙醚的污泥或土壤為從長期使用農藥的農田地、石化廠、蚊香生產廠等地采集的土樣或污泥。
[0011]進一步地，利用得到的降解菌進行八氯二丙醚降解實驗:配制40?60ppm八氯二丙醚降解液，接入權利要求1得到的降解菌，在20?32 0C、125?175r/min條件下好氧培養5?8天;然后通過正己烷反復萃取，接著旋蒸干，最后定容成空白理論濃度為5ppm的上機液，進行氣相色譜定量檢測，找出降解率高的菌種，即得到能夠高效降解八氯二丙醚的微生物。
[0012]其中，優選地，所述八氯二丙醚降解液的濃度為40ppm。
[0013]優選地，所述好氧培養是在30°C、175r/min條件下好氧培養7天。
[0014]更優選地，是進一步利用得到的降解菌進行八氯二丙醚降解實驗:配制50ppm八氯二丙醚降解液，接入上述方法篩選得到的降解菌，在30°C、175r/min條件下好氧培養7天;然后通過正己烷反復萃取，接著旋蒸干，用10毫升容量瓶定容成空白理論濃度為5ppm的上機液，于Agi lent6890氣相色譜儀上機定量檢測，找出降解率高的菌種。
[0015]另外，具體優選地，上述從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法，包括如下步驟:
51.采樣:從長期使用農藥的田地、石化廠或蚊香生產廠采集土樣或污泥；
52.細菌的培養:用滅菌水溶解土樣或污泥，震蕩培養后，靜置，取上層清液，并分別稀釋為不同濃度梯度的菌液，再經過涂布平板培養、劃線分離培養；
53.降解菌的初步分離:將步驟S2劃線分離的菌種接種至一系列八氯二丙醚濃度梯度的選擇培養基上進行培養，挑選出可耐八氯二丙醚的菌種；
54.降解菌分離:將步驟S3得到的菌種劃平板培養，選擇降解效果較好的單菌落進行LB液體培養基培養，收集菌體制成菌懸液，然后取菌懸液加入含有八氯二丙醚的降解液中進行培養，分離出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。
[0016]更具體地，作為一種優選的可實施方案，上述從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法，包括如下步驟:
51.采樣:從長期使用農藥的田地、石化廠或蚊香生產廠等地采集土樣或污泥，并編號；
52.細菌的培養:
521.取土樣或污泥于滅菌的容器(如三角瓶)中，加入滅菌水，錫紙封口，于搖床28?30°C，120?150rpm培養20?24h(優選為30°C，120?150rpm培養24h)后，靜置，取上層清液;所述底泥:滅菌水=0.5?1.5g:8?1mL(優選為所述底泥:滅菌水=Ig:9mL)；
522.稀釋濃度:在無菌操作條件下，吸取上層清液置于無菌水中，分別稀釋為不同濃度梯度的菌液；
523.涂布:將不同濃度梯度的菌液分別涂布于LB平板上，30°C恒溫倒置培養24h?36h;觀察不同稀釋濃度的平板的生長情況，選擇生長狀況較好的進行接種；
524.劃線接種分尚:將燒過的接種環冷卻后伸入培養皿中，挑取平板上長出的各種單菌落，分別轉移至新的平板上進行平板劃線，封口，28?30°C恒溫倒置培養20?24h(優選為30°C恒溫倒置培養24h);(注意:培養皿壁需在火焰上微燒一周，且劃線時不能劃破培養基);
53.降解菌的初步分離:將步驟S2中劃線分離的菌種接種至一系列八氯二丙醚濃度梯度的選擇培養基上，培養3?5天，挑選出可耐高濃度八氯二丙醚的菌種，進行編號，冷凍保存；
54.降解菌分離:
541.將步驟S3得到的菌種劃LB平板，培養20?24h(優選為培養24h)，再用滅菌的接種環挑取分離降解效果較好的單菌落至LB液體培養基中，采用好氧振蕩培養法進行培養，SP用無菌透氣封口膜封口后在30°C、150r/min的搖床中培養24h，得到富集液；
542.富集液4000r/min離心1min，傾去上清液，加入磷酸鹽緩沖液，繼續離心，依次重復離心3次，最后加入磷酸鹽緩沖液，制成菌懸液，然后取菌懸液于含有八氯二丙醚的降解液中，置于搖床30°C、150r/min培養6?7天；
543.降解菌分離:將步驟S42培養到時間的降解殘液進行預處理，通過萃取、旋蒸、稀釋，最后用正己烷制成上機樣品，進行氣相色譜定量檢測，分離出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。
[0017]另外，其中，優選地，所述滅菌水的制備方法:蒸餾水裝入容器中，錫紙封口濕熱滅菌，于121°C 0.15MPa濕熱高壓滅菌20min。
[0018]優選地，所述LB固體培養基配方:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、瓊脂18g、IL H2O，pH7.2?7.4;配好后倒入三角瓶，拿錫紙封口后，同無菌水放入高壓滅菌鍋滅菌(濕熱滅菌)。
[0019]優選地，步驟S23所述涂布的方式為吸取100?200μ1上層清液于平板上，用三角刮刀在平板上以“J”字形旋轉涂布均勻。
[0020]優選地，步驟S3所述選擇培養基為無機鹽固體選擇培養基，其配方為:Na2HPO4.12H20 7g、KH2P04 2g^ (NH4)2SO4 0.5g^MgSO4.7H20 0.2g、ZnSO4.7H20 0.005g,NaMoO4.2H20 0.0025g、Ca(H2P04)2 0.014g、FeS04.7H20 0.00013g、蒸餾水 1000ml，瓊脂 18g，pH7.00o
[0021]在上述方法中，在篩選降解菌時，用一系列的無機鹽固體選擇培養基，可同時達到馴化作用，周期短。
[0022]優選地，步驟S42所述降解液為八氯二丙醚濃度為40ppm的無機鹽液體無菌降解液，需經過高壓滅菌。
[0023]因此，通過上述方法篩選獲得的八氯二丙醚高降解菌也在本發明的保護范圍之內。
[0024]一株能夠降解八氯二丙醚的產氣腸桿菌(i?/3iero/7acier aeroge/jes)菌株M2016517，該菌株于2016年5月17日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCCNo:60041，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
[0025]所述的產氣腸桿菌(7? ie_ro/?ac ier aeroge/3es)菌株M2016517屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸產氣桿菌屬(Enterobacter)，是一種革蘭氏陰性菌;產氣腸桿菌菌株M2016517的 16S rDNA序列SEQ ID N0.1所示。
[0026]該菌株M2016517對八氯二丙醚具有良好的降解效果，其降解率高達95%。
[0027]因此，產氣腸桿菌菌株M2016517在降解八氯二丙醚方面的應用，以及在制備八氯二丙醚降解制劑方面的應用，也都在本發明的保護范圍之內。
[0028]一種利用產氣腸桿菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法，是按照I?8%的接種量，將產氣腸桿菌菌株M2016517接種于含有八氯二丙醚的待降解樣品，在轉速為125?175/min、pH為5?9、溫度為20?30°C條件下進行降解。
[0029]優選地。當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為八氯二丙醚降解液(液體)時，所述接種量為2%。
[0030]優選地，當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為八氯二丙醚降解液(液體)時，是在轉速為170?175r/min、pH為7、溫度為28?30°C條件下進行降解。
[0031]最優選地，當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為八氯二丙醚降解液(液體)時，是在轉速為175r/min、pH為7、溫度為30°C條件下進行降解。
[0032]即當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為八氯二丙醚降解液(液體)時，最佳的八氯二丙醚降解條件為:底物濃度為30ppm，接種量為2%，在轉速為175r/min、pH為7、溫度為30°(:條件下進行降解。最佳降解率可達95%。
[0033]另外，優選地，當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為含有八氯二丙醚的土壤時，土壤需要先經過滅菌，然后加入無菌水制成待降解污染土壤。
[0034]進一步優選地，所述待降解污染土壤的含水率為50?65%。
[0035]更優選地，所述待降解污染土壤的含水率為60%。
[0036]優選的，當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為含有八氯二丙醚的土壤時，所述接種量為5%。
[0037]優選的，當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為含有八氯二丙醚的土壤時，是在15(^/11^11、30°(:條件下富集培養2411。
[0038]本發明具有以下有益效果:
本發明首次從土壤和污泥中提取出對八氯二丙醚具有高降解性的微生物，產氣腸桿菌菌株M2016517，在轉速為175r/min、pH為7、溫度為30°C，接種量為2%時具有良好的降解效果，其降解率高達95%。
[0039]本發明篩選八氯二丙醚高效降解菌時，利用固體選擇培養基，可同時達到對菌種篩選和馴化的目的，明顯縮短馴化周期。
[0040]其次，本發明在做降解性試驗篩選過程中，用無菌透氣封口膜代替紗布，在保證微生物生命活動需要的氧氣外，還可以很好的防止灰塵雜質等進去培養瓶中。
[0041 ]另外，在上機前預處理時，改進傳統的有機物提取方法，省去過柱步驟，通過三次萃取后直接旋蒸，然后定容稀釋，也可以避免因步驟繁瑣而損失提取物，加標回收率達84%，空白降解率為3.5%。
【具體實施方式】
[0042]以下結合具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
[0043]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0044]實施例1八氯二丙醚降解菌的提取
1、一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法，包括以下步驟: S1.從長期使用農藥的田地和蚊香生產廠采集土樣或污泥，并編號。
[0045]S2.制備稀釋水:取一個250mL的錐形瓶裝90mL蒸餾水，錫紙封口濕熱滅菌；另取10支18mm X 180mm的試管分別裝9mL蒸饋水，塞上膠塞，錫紙包住并用橡皮筋扎好后于121°C
0.15MPa濕熱高壓滅菌20min。滅菌后置于無菌操作臺上，打開操作臺紫外燈，冷卻至室溫備用。
[0046]S3.LB固體培養基配制:
配方:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂18g、lL H20，pH7.2?7.4。
[0047]配好后倒入三角瓶，拿錫紙封口后，同無菌水放入高壓滅菌鍋滅菌。
[0048]S4.細菌的培養:
S41.取1g底泥于滅菌的三角瓶中，加入90mL滅菌水(濃度為10—工)，錫紙封口，于搖床(30 °C，120?150rpm)培養24h后，靜置，取上層清液。
[0049]S42.稀釋濃度:將裝有底泥和90mL滅菌水的三角瓶和5管9mL的無菌水排列好，按10一\ 10—2、10—3、10—4、10—5及10—6依次編號貼好標簽。在無菌操作條件下，吸取三角瓶中的ImL上層清液置于9mL無菌水中，得到10—2濃度的混合液。取ImL 10—2濃度的菌液于無菌水中，搖勻，得到10—3濃度的菌液。同法依次稀釋到10—6。
[0050]S43.倒平板:待經濕熱滅菌的培養基冷卻至50°C左右后倒入無菌培養皿中冷凝形成平板。
[0051 ] S4.涂布:從10—1開始吸取適量(100?200μ1)菌液于平板上，用三角刮刀在平板上以“J”字形旋轉涂布均勻。在恒溫培養箱(30°C)中倒置培養24h?36h。觀察不同稀釋濃度的培養基生長情況，選擇生長狀況較好的進行接種。
[0052]S45.劃線接種分離:點燃酒精燈，接種環沾取酒精后在火焰上進行灼燒滅菌，放在試管架上待其冷卻(最好備有3個)。將燒過的接種環冷卻后伸入培養皿中，挑取平板上長出的各種單菌落，分別轉移至平板上進行平板劃線。(培養皿壁需在火焰上微燒一周，且劃線時不能劃破培養基)，劃線完畢蓋好皿蓋，用封口膜封口，培養皿倒置于30 °C恒溫培養箱內培養24h。
[0053]S5.降解菌的初步篩選:
S51.無機鹽固體選擇培養基的配方為:Na2HP04.12H20 7g,KH2PO4 2g, (NH4)2SO4 0.5g、MgSO4.7H20 0.2g、ZnS04.7H20 0.005g ,NaMoO4.2H20 0.0025g、Ca(H2P04)2 0.014g、FeSO4.7H20 0.00013g、蒸餾水 1000ml，瓊脂 18g，pH7.00。
[0054]S52.配制一系列八氯二丙醚濃度梯度的無機鹽固體選擇培養基，將步驟S4中劃線分離的菌種接種至選擇培養基上根據情況培養3?5天，最后挑選出可耐200ppm選擇培養基的菌種進行編號，冷凍保存。
[0055]在篩選降解菌時用一系列的無機鹽固體選擇培養基，可同時達到馴化作用，周期短。
[0056]步驟S5的具體方法為:
(I)找一干凈(酸洗過)的1ml容量瓶于分析天平上，去皮，然后用取樣針吸取
0.10101083421標樣(純度為0.996)于容量瓶，然后用丙酮定容至101111，搖勻，即可得1000ppm八氯二丙醚母液，再根據需要稀釋。
[0057]配置八氯二丙醚濃度為Xppm的培養基:C2 X V3 = X X V4 C2:配置好的S421濃度(ppm);
V3往培養基中加入的C2濃度的S421的體積(ml);
X:培養基中S421濃度(ppm);
V4:培養基體積(ml)。
[0058]例如:1000ppmX V3=100ppm X 10ml
即:使10ml培養基中八氯二丙醚濃度為10ppm，需加入濃度為1000ppm的八氯二丙醚溶液lml。
[0059](2)從不含八氯二丙醚的培養基中觀察挑選出生長狀況良好的菌種進行劃線接種，對不同類型的菌種進行標記，如A、B、C......以此類推；
從30ppm濃度開始選擇培養，直至200ppm甚至更高濃度(菌種幾乎長不出來或生長時間過長為止)，然后做富集培養24h，保存菌種。
[0060]S6.降解性檢驗:
S61.取步驟S5保存的菌種進行解凍活化，每種劃2個平板(LB基礎培養基)，在平板上培養24h，用滅菌的接種環挑取分離效果較好的單菌落到50ml液體的LB液體培養基中培養(用肉眼看得到接種環上有菌，放到液體中多攪拌幾次，確保看得到菌種落入了液體中)，每種做I個，采用好氧振蕩培養法進行培養，即用無菌透氣封口膜封口后在30°C、150r/min的搖床中培養24h，得到富集液。
[0061 ] S62.取5ml步驟S61得到的富集液，于4000r/min的離心機中離心lOmin，然后傾去上清液，加入5ml磷酸鹽緩沖液，繼續離心，依次離心3次，最后加入5ml磷酸鹽緩沖液，制成菌懸液。配制50ml八氯二丙醚濃度為40ppm的無機鹽液體無菌降解液，高壓滅菌。然后取Iml菌懸液于50ml降解液中，置于搖床30°C150r/min培養6?7天。
[0062]S63.預處理:將步驟S62培養到時間的降解殘液進行預處理，通過萃取、旋蒸、稀釋，最后用正己燒制成空白理論濃度為5ppm的上機樣品，同時配制濃度為4口口111、2口口111、]^口111、
0.5ppm、0.25ppm、0.125ppm、0.625ppm的標準液，同樣品一起上機，用外標法制備標準曲線。
[0063]步驟S63的具體方法為:
①按照樣品數量搭配分液漏斗(最好多出來一兩個，以作備用)，確保不漏液；
②將降解液倒入分液漏斗，用50ml正己烷分3次(20+15+15ml)萃取降解液，萃取在250ml分液漏斗中進行。每次萃取前，先加正己烷于裝了降解液的三角瓶中，輕輕震蕩清洗后倒入分液漏斗內，來回顛倒振蕩數次(小心震蕩，有時候分液漏斗上口瓶塞不完全密封，顛倒時會有液體灑出)，靜置1min;
③收集下層水相溶液于原三角瓶中，上層有機相溶液從上口倒入雞型瓶內，雞型瓶用錫紙包口。然后再將三角瓶中的下層溶液又加入漏斗中，如此萃取三次，合并萃取液；
④38°C揮發旋蒸正己烷至干后加入20ml正己烷溶解，再超聲清洗(需手拿雞型瓶傾斜慢慢旋轉，然后拿滴管吸取瓶底溶液，沿瓶內壁吹洗)3_5min，倒入25ml容量瓶用正己烷定容；
⑤從25ml中準確吸取Iml于1ml容量瓶用正己燒定容1ml，然后取Iml于進樣瓶，封口放冰箱待上機。
[0064]如上，上機前預處理時通過正己烷萃取、旋蒸、超聲清洗等步驟，可顯著提高加標回收率。
[0065]S64.取步驟S63得到的處理樣品Ιμ?于Agilent6890氣相色譜儀上機定量檢測，找出對八氯二丙醚降解率高的菌株。
[0066]2、經過上述方法，篩選得到對八氯二丙醚具有優良降解特性的微生物菌株。
[0067]3、對篩選得到的菌株進行鑒定
(I)提取菌株的基因組DNA作為模板，采用16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCA)/1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)進行擴增。PCR 反應體系(50yL):菌液2μ1，引物各(10 ymol.L_1)2yl ,10 XPCR Buffer 5yl，dNTP(2.5 mmol.IT1Myl，rTaqDNA聚合酶(5U.μΙΓ1)141。卩0?反應條件:941€ 5 min，94°C 30 s，50°C 30s，72°C 2min，循環35次，72°C 1min0
[0068](2)反應完成后，取出Eppendorf管，從中吸取5μ1反應產物，加入Ιμ?上樣緩沖液，點入預先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中，120V，電泳24min，結束后在紫外凝膠成像儀下檢測擴增結果。
[0069](3)同時，擴增產物純化后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將公司測序送回的序列在NCBI網站中中利用BLAST進行自動比對分析，選擇相似性最高的結果。
[0070]最終確定所篩選得到的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。經過鑒定，該菌株屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸產氣桿菌屬(Enterobacter)，是一種革蘭氏陰性菌。因此，命名為產氣腸桿菌(jSflteroAacier 361'0即/365)菌株]\12016517，并于2016年5月17日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為⑶MCC No:60041，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
[0071]
實施例2八氯二丙醚降解液降解條件優化
1、利用利用產氣腸桿菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法是:
含有八氯二丙醚的土壤先經過滅菌，配置濃度為40ppm的八氯二丙醚降解液，再按照I?8%的接種量，將產氣腸桿菌菌株M2016517接種于含有八氯二丙醚的降解液中，在轉速為125?175r/min、pH為5?9、溫度為20?30°C條件下進行降解。
[0072]2、接種量的優化
以不同梯度為1%、2%、4%、6%、8%的接種量為變量，篩選最佳的接種量。
[0073]結果顯示，接種量為1%時的降解率為20.7%，接種量為2%時降解率最高，為56.5%，接種量為4%時降解率20.6%，接種量為6%時降解率為44.1%，接種量為8%時降解率為33.6%。
[0074]3、轉速的優化
以不同梯度為125、150、175r/min的轉速為變量，篩選最佳的轉速。
[0075]結果顯示，轉速為125r/min下時降解率為0.6%，轉速為150r/min時降解率為14.8%，轉速為175r/min時降解率最高，為25.6%。
[0076]4、溫度的優化
以不同梯度為20、25、30 0C的溫度為變量，篩選最佳的溫度。
[0077]結果顯示，20 0C時降解率為2.5%，25 °C時降解率為16.5%，30 °C時降解率最高，為53%。
[0078]5、pH 的優化
以不同梯度為5,6,7,8，9的pH為變量，篩選最佳的pH。
[0079]結果顯示，pH為5時降解率為39.5%，pH為6時降解率為77.4%，pH為7時降解率最高，為83.4%，pH為8時降解率為40.5%，pH為9時降解率為21.8%。
[0080]6、底物濃度的優化
以不同梯度為30、50、100、200ppm的底物濃度為變量，篩選最佳降解底物濃度。
[0081 ]結果顯示，底物濃度為30ppm時降解率最高，為95%，底物濃度為50ppm時降解率為42.2%，底物濃度為10ppm時降解率為32.5%，底物濃度為200ppm時降解率為6.1%。
[0082]綜上所述，綜合研究篩選后顯示，針對降解八氯二丙醚降解液的最佳降解條件為:底物濃度為30ppm，接種量為2%，在轉速為175r/min、pH為7、溫度為30°C條件下進行降解。最佳降解率可達95%。
[0083]
實施例3八氯二丙醚加標回收提取
1、根據實施例2中的八氯二丙醚降解液的配制方法，配制出2份八氯二丙醚濃度為40ppm的降解液樣品，并向其中一份加入定量的八氯二丙醚標準物，然后通過萃取、旋蒸、稀釋等預處理過程，取Iml樣品于進樣瓶，封口放冰箱待上機。
[0084]2、結果顯示，加標回收率達84%。
[0085]
實施例4八氯二丙醚加標污染土壤的降解修復
1、降解菌:產氣腸桿菌(Mnterobacter ae1gaoes)菌株M2016517。
[0086]2、樣品制備
(I)從農場中取無八氯二丙醚污染的土壤，風干后過0.8mm篩后備用。
[0087](2)于干凈玻璃培養皿中秤取50g 土壤，于24h內121°C高壓滅菌20min兩次。
[0088](3)滅菌后的土壤置于無菌操作臺冷卻后，加入八氯二丙醚配制成50mg/kg的污染土，將用LB液體培養基在150r/min、30 V下富集培養24h的降解菌以5%接種量接入培養皿，加入適量無菌水，使水分保持在60%。
[0089]上述為實驗組:即土壤滅菌處理，接菌。
[0090]另外，同時設置3個對照組，分別為:
對照組I: 土壤滅菌處理，不接菌；
對照組2:自然土壤未滅菌處理，接菌；
對照組3:自然土壤未滅菌，不接菌。
[0091]共4組，每組3個平行。
[0092]3、實驗方法
將培養皿放入恒溫培養箱避光培養7d后取樣測定八氯二丙醚的含量。
[0093]土壤中八氯二丙醚的分析檢測:
(I)低溫(40°C )烘干污染土，過0.3mm篩;取2g于1ml離心管中，加入1ml乙酸乙酯，于溫水浴(不高于40°C)超聲提取10111；[11，然后40001'/111；[11離心10111；[11，將上層液移至雞心瓶中，重復提取2次，合并上層液，旋蒸至近干。
[0094](2)然后加20ml正己烷超聲洗滌，取400μ1于1ml容量瓶定容得理論空白濃度為0.2ppm的提取液，取Ιμ?于Agi lent6890氣相色譜儀上機定量檢測。
[0095]降解率=100%(對照樣品殘留量一處理樣品殘留量)/對照樣品殘留量。
[0096]4、結果
經檢測，實驗組的降解率為59.5%，對照組I的降解率為3.7%，對照組2的降解率為43.8%，對照組3的降解率為5%。
[0097]
實施例5實際污染土壤的降解修復
1、土壤
紅壤污染土:采自華南農業大學樹木園。
[0098]水稻污染土:采自華南農業大學農場。
[0099]2、同上，利用本發明的產氣腸桿菌菌株M2016517進行降解實驗。
[0100]實驗結果顯示，降解I天后，產氣腸桿菌菌株M2016517對紅壤污染土的降解率7.2%，而對水稻污染土降解3.2%。
[0101 ] 第4天后，該菌株對紅壤污染土降解率為32.8%，而對水稻污染土降解了 18.5%。
[0102] 第7天后，紅壤污染土最終降解率高達65.6%，而水稻污染土降解率為54%。
【主權項】
1.一種從土壤或污泥中獲取能夠降解八氯二丙醚的微生物的方法，其特征在于，以含有八氯二丙醚的污泥或土壤為樣本，通過微生物菌種的培養、分離、純化、馴化，選擇出對八氯二丙醚具有降解性的降解菌。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有八氯二丙醚的污泥或土壤為從長期使用農藥的農田地、石化廠或蚊香生產廠采集的土樣或污泥。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.采樣:從長期使用農藥的田地、石化廠或蚊香生產廠采集土樣或污泥； 52.細菌的培養:用滅菌水溶解土樣或污泥，震蕩培養后，靜置，取上層清液，并分別稀釋為不同濃度梯度的菌液，再經過涂布平板培養、劃線分離培養； 53.降解菌的初步分離:將步驟S2劃線分離的菌種接種至一系列八氯二丙醚濃度梯度的選擇培養基上進行培養，挑選出可耐八氯二丙醚的菌種； 54.降解菌分離:將步驟S3得到的菌種劃平板培養，選擇降解效果較好的單菌落進行液體培養基培養，收集菌體制成菌懸液，然后取菌懸液加入含有八氯二丙醚的降解液中進行培養，分離出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.采樣:從長期使用農藥的田地、石化廠或蚊香生產廠采集土樣或污泥； 52.細菌的培養: 521.取土樣或污泥于滅菌的容器中，加入滅菌水，封口，于28?30°C，120?150rpm培養20?24h后，靜置，取上層清液； 522.稀釋濃度:在無菌操作條件下，吸取上層清液置于無菌水中，分別稀釋為不同濃度梯度的菌液； 523.涂布:將不同濃度梯度的菌液分別涂布于LB平板，30°C恒溫倒置培養24h?36h; 524.劃線接種分離:將平板上的各種單菌落分別挑至新的平板上進行平板劃線，封口，28?30°C恒溫倒置培養20?24h; 53.降解菌的初步分離:將步驟S24劃線分離的菌種接種至一系列八氯二丙醚濃度梯度的選擇培養基上，培養3?5天，挑選出可耐八氯二丙醚的菌種； 54.降解菌分離: S41.將步驟S3得到的菌種劃LB平板，培養20?24h，再挑取分離降解效果較好的單菌落至液體LB液體培養基中，封口后在30°C、150r/min的搖床中培養24h，得到富集液； S42.富集液離心去上清液，用磷酸鹽緩沖液離心清洗數次，最后加入磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，然后取菌懸液于含有八氯二丙醚的降解液中，置于搖床30°C、150r/min培養6?7天； S43.降解菌分離:將步驟S42培養到時間的降解殘液進行預處理，通過萃取、旋蒸、稀釋，最后用正己烷制成上機樣品，進行氣相色譜定量檢測，分離出八氯二丙醚高降解率的微生物菌。5.一株能夠降解八氯二丙醚的產氣腸桿菌(tero/?ac ier aeroge/jes)菌株M2016517，其特征在于，該菌株于2016年5月17日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCC No:60041，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。6.根據權利要求5所述的產氣腸桿菌(i?/3iero/7acieraerogaoes)菌株M2016517，其特征在于，該菌株屬于腸桿菌科、腸產氣桿菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，其16S rDNA序列如SEQID N0.1所示。7.產氣腸桿菌菌株M2016517在降解八氯二丙醚方面的應用。8.產氣腸桿菌菌株M2016517在制備八氯二丙醚降解制劑方面的應用。9.一種利用產氣腸桿菌菌株M2016517降解八氯二丙醚的方法，其特征在于，是按照I?8%的接種量，將產氣腸桿菌菌株M2016517接種于含有八氯二丙醚的待降解樣品，在轉速為125?175r/min、pH為5?9、溫度為20?30°C條件下進行降解。10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，當所述含有八氯二丙醚的待降解樣品為含有八氯二丙醚的土壤時，土壤需要先經過滅菌，然后加入無菌水制成待降解污染土壤。
【文檔編號】A62D101/28GK106085897SQ201610379246
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】呂輝雄, 周耀紅, 黃雪晶, 陳少華, 楊啟平, 邵力恒, 劉志健
【申請人】華南農業大學