一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，屬于天然藥物的領域。本發明的目的在于提供一種具有降血糖作用的甜玉米芯多糖組分的制備方法。本發明方法如下：一、將甜玉米芯粉碎，過篩，加入正己烷，室溫下攪拌處理，離心后取沉淀在室溫下晾干得到甜玉米芯粉；二、然后加入pH＝6的緩沖溶液、纖維素酶和果膠酶，微波提取，再恒溫下水浴加熱，離心處理后取上層清液；三、脫蛋白后脫色；四、用80％乙醇醇沉靜置，加入蒸餾水充分溶解后，通過DEAE?52進行分離，梯度洗脫，收集洗脫液，取蒸餾水洗脫后的組分過SephadexG?75柱層析純化。本發明方法的甜玉米芯多糖組分得率較高，降血糖效果明顯，制備方法簡單。
【專利說明】
一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于天然藥物技術領域;具體涉及一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組 分的制備方法。
【背景技術】
[0002] 全球有兩大著名玉米黃金帶，分別位于美國和中國。在我國傳統農產品加工中，大 部分甜玉米副產物甜玉米芯，作為清除飼料或都被埋于地下，造成極大的資源浪費。甜玉米 芯可用于制備飴糖、木糖醇、葡萄糖、糖醛、活性炭、釀酒、碎料板、粘結劑等。天然活性多糖 成分是近年來的研究熱點。多糖類化合物通常沒有細胞毒性，不影響正常細胞功能，具有高 效低毒的特點，是開發降血糖和免疫調節藥物、功能性食品的重要來源具有廣闊的前景。其 中以植物多糖的水溶性多糖最為重要。大量實驗證明，許多植物多糖能夠清除自由基、提高 抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化等活性，起到保護生物膜和延緩衰老的作用。研究發現，許 多多糖能減少脂質過氧化產物丙二醛的生成量，增加 S0D、GSH-px活性，降血糖等，在中藥藥 理中發揮著重要作用。
[0003] 糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病。在我國II型糖尿病占所有 糖尿病的90%以上。從天然藥物尤其是植物中尋求降血糖的有效成分是一條重要的途徑。 在國內，植物多糖近年來得到了廣泛的研究。表明多糖可降低糖尿病小鼠的血糖水平。研究 表明安吉白茶多糖、茶花多糖、蕪菁多糖在緩解糖尿病小鼠糖耐量降低方面具有顯著的作 用，并且達到了藥物組的治療水平。目前報道玉米須多糖、黃酮、皂苷類化合物經藥效學實 驗證明均具有降低糖尿病小鼠血糖的作用，黃酮組降血糖的作用效果更顯著。研究表明玉 米須水提物對正常小鼠有輕微的降血糖功能，還可阻止膽固醇在肝臟合成，因此具有降低 血液中膽固醇和甘油三酯的作用。但對玉米芯及甜玉米芯降血糖的研究未見報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種具有降血糖作用的甜玉米芯多糖組分的制備方法，甜 玉米芯多糖組分得率較高，降血糖效果明顯，制備方法簡單，具備一定的經濟和社會效益。
[0005] 本發明中的一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法是由下述步驟 完成的：
[0006] 步驟一、將甜玉米芯粉碎，過篩，加入正己烷，室溫下攪拌處理，離心后取沉淀在室 溫下晾干得到甜玉米芯粉；
[0007] 步驟二、向步驟一制得的甜玉米芯粉加入pH = 6的緩沖溶液、纖維素酶和果膠酶， 微波提取，再恒溫下水浴加熱，離心處理后取上層清液；
[0008] 步驟三、然后依次進行脫蛋白和脫色處理；
[0009] 步驟四、用80 % (體積）乙醇醇沉靜置過夜，加入5mL蒸餾水充分溶解后，通過DEAE-52進行分離，依次用蒸餾水、濃度為0. lmol/L的NaCl溶液、濃度為0.2mol/L的NaCl溶液及濃 度為0.3mo 1/L的NaCl溶液梯度洗脫，采用苯酚硫酸法隔管跟蹤監測，收集洗脫液，取蒸餾水 洗脫后的組分過S印hadexG-75柱層析純化，得到具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分。
[0010] 進一步限定，步驟一中過80目篩。
[0011]步驟一中甜玉米芯的質量與正己烷的體積之比為lg: 10mL。
[0012] 步驟一中室溫下攪拌時間為30min。
[0013] 步驟二中pH = 6的緩沖溶液是pH為6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，甜玉米 芯粉的質量與pH=6的緩沖溶液的體積之比為lg:20mL。
[0014] 步驟二中纖維素酶和果膠酶的總質量占甜玉米芯粉質量的1%，纖維素酶和果膠 酶的質量比為3:2。
[0015] 步驟二中微波功率為600W，微波時間8min。
[0016] 步驟二中95 °C恒溫水浴2~2 · 5h。
[0017] 步驟三中脫蛋白：吸取50mL的上層清液，加入木瓜蛋白酶酶，木瓜蛋白酶酶添加量 為1.8%(酶的質量為甜玉米芯質量的2%)，調節pH至7.2,52°C水浴條件下酶1.7h后，進行 沸水浴5min。冷卻后，3000r/min離心10min。上清液以體積比3:1加入Sevag試劑混合，常溫 下攪拌lh，靜置2h分層，除去有機試劑層和蛋白層。
[0018] 步驟三中脫色:加入D301R樹脂，在43°C振蕩2h，反復脫色直至色素完全脫除。
[0019]本發明方法得到的甜玉米芯多糖組分均一，為白色粉末，與茚三酮反應呈陰性，說 明樣品中不含氨基酸或者蛋白質，碘-碘化鉀實驗呈陰性，說明其中不含有淀粉。Molish反 應呈陽性，在樣品試液和硫酸的交界面有一圈紫色環，說明甜玉米芯多糖樣品中含有糖類、 多糖或甙類，斐林實驗證明甜玉米芯多糖組分不含有還原糖，而水解后反應生成磚紅色沉 淀。
[0020] 本發明具有降血糖作用對改善糖尿病大鼠的體重減輕和高血糖癥狀及臟器損傷 有顯著效果，制備方法簡單，具備顯著的經濟和社會效益。
【附圖說明】
[0021] 圖1是甜玉米芯多糖分級結果圖；圖2是SCP-80級分DEAE-52洗脫曲線；圖3是SCP-80級分SephadexG-200洗脫曲線。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0022] 一:本實施方式中甜玉米芯多糖降血糖活性組分制備，按以下步驟 操作：
[0023] 步驟一、原料甜玉米芯經粉碎機粉碎，過80目篩子，向過篩甜玉米芯中以lg: 10mL 的比加入正己燒，室溫下攪拌30min，4000r/min離心10min，沉淀在室溫下瞭干，即得脫脂甜 玉米芯粉。
[0024] 步驟二、準確稱取10g脫脂甜玉米芯粉，按1:20的料液比（g:mL)加入pH = 6的緩沖 溶液磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，天津基準化學試劑有限公司）、纖維素酶和果膠酶 (纖維素酶和果膠酶質量比為3:2,復合酶總質量占甜玉米芯粉質量的1%)，攪拌均勻后置 于微波合成儀中，在25°C、600w的條件下處理8min(利用微波處理提高細胞內部溫度使細胞 外部壓力增大直至使細胞壁破裂，從而加速細胞內部的有效成份的釋放從而被溶解）。 [0025] 然后置于50°C恒溫水浴鍋內浸提2.5h，酶解后的樣品滅酶后冷卻到室溫，4000r/ min離心處理lOmin。
[0026] 棄殘渣，取上清液備用，用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，測得多糖含量為16.7 %。
[0027] 步驟三、將步驟二提取的上清液采用seveg-酶法脫蛋白，木瓜蛋白酶添加量為 1.8 % (酶的質量為甜玉米芯質量的2 % )，調節pH至7.2，52°C水浴條件下酶解1.7h后，進行 沸水浴5min。冷卻后，3000r/min離心10min后上清液以體積比3:1加入Sevag試劑混合，常溫 下攪拌lh，靜置2h分層。除去有機試劑層和蛋白層。
[0028]將脫蛋白后的粗多糖按液料比為15:1添加 D301R樹脂，在43 °C振蕩2h，反復2次(色 素完全脫除）。
[0029] 步驟四、然后分別以乙醇體積濃度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 和90 %進行醇沉靜置過夜。
[0030] 取SCP-80 1 · Og，加入5mL蒸餾水充分溶解后，通過DEAE-52 (2 · 6 X 60cm)進行分離， 取蒸餾水洗脫后的組分過SephadexG-75柱層析(2.6X 100cm)進一步純化，采用苯酸硫酸法 隔管跟蹤監測，最終得到甜玉米芯多糖均一組分SCP-80-I (白色粉末）。
[0031] 由圖1可知，用80%乙醇沉淀獲得的甜玉米芯多糖組分得率較高。
[0032]由圖2可知，采用DEAE-52分離SCP-80得三個組分，其中蒸餾水洗脫得SCP-80-I回 收率最高。
[0033] 由圖3可知，采用SephadexG-75純化，證明SCP-80-I為均一組分。
[0034]采用下述試驗驗證SCP-80-I降血糖藥效，具體內容如下：
[0035] A ·實驗動物
[0036]雄性Wista大鼠，體質量170_175g，購自長春億斯實驗動物有限責任公司，生產許 可證號:N〇.SCXk(Ji)-2011-0004。各組動物均在同樣環境下飲水、攝食，保持自然光照。動 物飼料由長春億斯實驗動物中心提供。
[0037] B.實驗材料
[0038]鏈脲佐菌素 STZ(購于Sigma公司）；鹽酸二甲雙胍片（貴州圣濟堂制藥有限公司）； 羅氏血糖測定儀和血糖試紙(德國羅氏公司）；全自動生化分析儀（日本日立一 7060型） [0039] C.實驗方法
[0040] (1)糖尿病動物模型的建立
[00411將80只雄性Wista大鼠飼養一周后，抽取10只作為正常對照組，普通飼料喂養，其 余70只用于造模。高脂飼料配方:基礎飼料78.8%，蛋黃粉10%，豬油10%，膽鹽0.2%，膽固 醇1%。正常對照組喂食基礎飼料，其他各組則喂食高脂飼料。大鼠自由飲水及攝食，21天后 禁食過夜（12h)，次日采血。確定高脂模型建立。
[0042] (2)實驗分組與藥物劑量
[0043] 70只高脂模型大鼠給腹腔內注射STZ溶液(55-60mg/kg，檸檬酸緩沖溶液，pH4.2- 4.5)，禁食16h，尾靜脈采血，用血糖測定儀測定空腹血糖濃度（FBGhlOnmol/L彡FBG彡 25nmol/L為造模成功，確定為糖尿病模型。符合標準的糖尿病模型小鼠60只，隨機分為5組， 每組12只。具體分組和灌胃劑量如下：第1組為正常大鼠+相同劑量的生理鹽水灌胃，第2組 為糖尿病模型大鼠+相同劑量的蒸餾水灌胃，第3組為糖尿病模型大鼠+低劑量SCP-80-I灌 胃100mg/(kg · d)，第4組為糖尿病模型大鼠+中劑量SCP-80-I灌胃200mg/(kg · d)，第5組為 糖尿病模型大鼠+高劑量SCP-80-I灌胃400mg/(kg · d)，第6組為糖尿病模型大鼠+鹽酸二甲 雙胍灌胃400mg/(kg · d)。灌胃前將各藥品溶解后配成溶液，按一定比例連續灌胃21d。
[0044] (3)體質量和血糖含量測定
[0045] 大鼠糖尿病模型建立后，分別在灌胃0、7、14、21d每組禁食不禁水12h后，測定小鼠 體質量并剪采血，采用羅氏血糖儀測定血糖的含量
[0046] (4)指標測定
[0047] 大鼠連續灌胃21d后，禁食12h，乙醚麻醉，由其腹主動脈采血處死，取血6-8mL，室 溫凝固約60min，3000r/min離心10min，分離血清，-20 °C冰箱保存，待測。用全自動生化分析 儀測定血清中總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白 膽固醇(HDL-C)的含量。大鼠處死后，立即解剖摘取大鼠肝臟、腎臟和胰腺并稱重。計算各臟 器指數[程素嬌，烏飯樹樹葉降血糖研究[D].江南大學碩士論文，2013]。
[0048] (5)統計學分析
[0049] 采用DPS 9.50軟件進行數據處理和方差分析，試驗結果以"i±/'表示，組間差異 比較采用t檢驗，以p〈0.05為有統計學顯著差異性。
[0050] D.結果
[0051 ] (1) SCP-80-I對糖尿病大鼠體質量影響
[0052]由表1可知，在實驗初期，各組體重之間并無顯著差異。一周之后，對照組的體重增 長高于其他組，陽性對照組和藥物治療組體重也呈增長趨勢。一周后，模型組與對照組比 較，體重顯著下降（P〈〇. 01)。中劑量組合低劑量組與模型組比較，體重沒有顯著差異（P> 0.05)。陽性對照組和高劑量組與模型組對比，體重變化有差異(p〈0.05)。3周后，模型組體 重顯著低于各藥物組(P〈〇.〇l)。陽性對照組和SCP-80-I各組與對照組相比有顯著差異，呈 劑量依賴性。
[0053] 表1SCP-80-I對STZ誘導大鼠體質量的影響
[0054]
[0055] 注:&:卩〈0.05，厶:？〈0.01與正常組比；13:?〈0.05,8:?〈0.01與對照組比 ；(3:?〈0.05;
[0056] C:P〈(h01與陽性對照組比
[0057] (2) SCP-80-I對糖尿病大鼠血糖影響
[0058]由表2可知，小鼠腹腔注射STZ后，血糖顯著升高，均大于10mm〇l/L說明糖尿病小鼠 模型造模成功，給藥前，模型對照組與各藥物組比較無顯著差異(P>〇.05)。連續給藥7d后， 陽性對照組和SCP-80-I各組與對照組相比均可降低大鼠血糖(？〈0.01，？〈0.05)。給藥21(1 后，陽性對照組和SCP-80-I各組都可顯著降低大鼠血糖水平(p〈0.01)，并呈劑量依賴性。說 明SCP-80-I具有良好的降血糖作用。
[0059] 表2SCP-80-I對STZ誘導大鼠血糖的影響
[0060]
[0061] 注:&:?〈0.05，厶:？〈0.01與正常組比；13:?〈0.05,8:?〈0.01與對照組比 ；
[0062] c: P〈0 · 05，C: P〈0 · 01 與陽性對照組比
[0063] (3) SCP-80-I對糖尿病大鼠臟器系數影響
[0064]由表3可知，SCP-80-I各組與模型組相比，臟器指數有顯著升高(p〈0 · 05，p〈0 · 01)。 這表明，高脂肪和糖尿病大鼠出現明顯的肝臟腫脹現象，腎臟和胰腺肥大。實驗結果表明， SCP-80-I可以改善這些現象并呈劑量依賴性。
[0065] 表3SCP-80-I對STZ誘導大鼠臟器系數的影響
[0066]
[0067]
[0068] 注:a: P〈0 · 05，A: P〈0 · 01 與正常組比；b: P〈0 · 05，B: P〈0 · 01 與對照組比；
[0069 ] c: P〈〇 · 05，C: Ρ〈0 · 01 與陽性對照組比
[0070] (4)SCP-80_I對糖尿病大鼠血糖影響
[0071] 從表3可知，在灌胃21d后，SCP-80-I高劑量和中劑量組與對照組相比可顯著降低 TC、TG、和LDL-C水平，升高HDL-C水平。SCP-80-I低劑量可降低TC和LDL-C。SCP-80-I各組呈 一定的量效關系，其中高劑量的效果最為顯著。說明SCP-80-I可以改善STZ誘導糖尿病大鼠 的血脂水平。
[0072] 表4SCP-80-I對STZ誘導大鼠血脂的影響
[0073]
[0074] 注:a: P〈0 · 05，A: P〈0 · 01 與正常組比；b: P〈0 · 05，B: P〈0 · 01 與對照組比。
[0075]經過動物試驗證明，本實施方式方法得到的SCP-80-I具有顯著的降血糖效果。
【主權項】
1. 一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征在于該方法是由下述 步驟完成的： 步驟一、將甜玉米芯粉碎，過篩，加入正己烷，室溫下攪拌處理，離心后取沉淀在室溫下 瞭干得到甜玉米芯粉； 步驟二、向步驟一制得的甜玉米芯粉加入pH=6的緩沖溶液、纖維素酶和果膠酶，微波 提取，再恒溫下水浴加熱，離心處理后取上層清液； 步驟三、然后依次進行脫蛋白和脫色處理； 步驟四、用80 % (體積）乙醇醇沉靜置過夜，加入5mL蒸餾水充分溶解后，通過DEAE-52進 行分離，依次用蒸餾水、濃度為〇. lmo 1/L的NaCl溶液、濃度為0.2mo 1/L的NaCl溶液及濃度為 0.3mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，采用苯酚硫酸法隔管跟蹤監測，收集洗脫液，取蒸餾水洗脫 后的組分過S印hadexG-75柱層析純化，得到具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分。2. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟一中過80目篩。3. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟一中甜玉米芯的質量與正己烷的體積之比為lg: 10mL。4. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟一中室溫下攪拌時間為30min。5. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟二中pH = 6的緩沖溶液是pH為6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，甜玉米芯粉 的質量與pH=6的緩沖溶液的體積之比為1 g: 20mL。6. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟二中纖維素酶和果膠酶的總質量占甜玉米芯粉質量的1%，纖維素酶和果膠酶的 質量比為3:2。7. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟二中微波功率為600W，微波時間8min。8. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟二中95 °C恒溫水浴2~2.5h。9. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟三中脫蛋白：吸取50mL的上層清液，加入木瓜蛋白酶酶，添加量為1.8%，調節pH至 7.2,52 <€水浴條件下酶1.711后，進行沸水浴5111；[11，冷卻后，300〇1'/111；[11離心1〇111；[11。上清液以 體積比3:1加入Sevag試劑混合，常溫下攪拌lh，靜置2h分層，除去有機試劑層和蛋白層。10. 根據權利要求1所述一種具有降血糖功能的甜玉米芯多糖組分的制備方法，其特征 在于步驟三中脫色:加入D301R樹脂，在43°C振蕩2h，反復脫色直至色素完全脫除。
【文檔編號】A61P3/10GK106084082SQ201610487000
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月28日
【發明人】馬永強, 遲淳良, 王鑫, 周恪馳, 莊星光
【申請人】哈爾濱商業大學