一種可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體及其應用，所述表達載體克隆區上游包含人類游離脂肪酸結合蛋白(FABP6)的編碼序列，下游為人類表皮生長因子的編碼序列，兩個基因的編碼區之間包含一段柔性接頭編碼序列，FABP6的氨基端包含His?Tag標簽蛋白編碼序列。本發明提供了一種可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體，其特點是：1)可溶性蛋白與包涵體蛋白的比值大于50％；2)容易借助組氨酸標簽(His?Tag)親和純化獲得目標蛋白。
【專利說明】
一種可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體及其應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種可溶性蛋白表達技術，尤其是涉及一種可溶性表皮生長因子融合 蛋白表達載體及其應用，屬于分子生物學基因工程領域。
【背景技術】
[0002] 1962年美國Stanley Cohen博士首次從小鼠的頌下腺里發現了53個氨基酸的寡 肽。由于該短肽具有廣泛的促細胞生長活性，因而得名表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)。經過其后的進一步研究，弄清了EGF的蛋白質序列和結構。上世紀70年代時， 發現人類具有同樣功能的和結構類似的EGF(hEGF)。隨后的研究發現它具有強大的促進細 胞生長的功能，它的功能是通過細胞膜上的EGF受體(EGFR)而得以實現，活化的受體通過 EGF-EGFR信號通路激活細胞核里的促有絲分裂相關基因，從而引起DNA復制和細胞生長、分 裂出新生細胞，EGF主要促進內皮和表皮細胞的增殖和新生。極微量的EGF涂于表皮，即可產 生明顯表皮新生變年輕現象，因而生物學界稱其為"美麗因子"。
[0003] 1986年，Dr. Stanley Cohen因為發現了表皮生長因子(EGF)和神經生長因子(NGF) 而榮獲諾貝爾生理學和醫學獎。
[0004] 現已清楚，EGF是一種廣泛存在于人和動物體內的、可以促進和抑制多種細胞生長 的小分子蛋白。其成熟肽含有53個氨基酸，分子量約6kD左右，含有3個二硫鍵，天然EGF的生 物活性高達1000萬U/mg以上。由于EGF具有廣泛促進上皮細胞生長的作用，促進了其在創面 修復和美容嫩膚領域的應用研究和需求，市場對EGF的需求增加。
[0005] 既往所采用的基因工程表達EGF的技術包括酵母細胞表達、大腸桿菌表達。畢赤酵 母的分泌型表達常常需要數日，容易降解。大腸桿菌表達雖然省時、經濟，但是表達產物幾 乎全部是無天然結構的包涵體，需要"變性一脫鹽一人工體外復性"等復雜操作過程，并且 體外復性不完全、容易錯配，導致人工體外復性產生的EGF常常達不到醫藥級活性（多50萬 U/mg EGF)。
【發明內容】
[0006] 鑒于以上問題，本發明的目的在于提供一種可溶性表皮生長因子融合蛋白及其編 碼基因。
[0007]本發明的另一目的在于提供上述融合蛋白表達載體，以提尚可溶性EGF的表達廣 量。
[0008] 本發明的又一目的在于提供上述表達載體的應用。
[0009] 本發明通過以下技術方案得以實現：
[0010] -種可溶性表皮生長因子融合蛋白，是如下⑴或⑵的蛋白質：
[0011] (1)由脂肪酸結合蛋白FABP和表皮生長因子EGF蛋白融合得到的融合蛋白；
[0012] 所述的脂肪酸結合蛋白FABP是FABP1~FABP9中的任意一種或亞種，所述FABP1~ FABP9的氨基酸序列如下所示：
[0013] 所述的FABP1為氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白質；
[0014] 所述的FABP1-1為氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的蛋白質；
[0015] 所述的FABP1-2為氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白質；
[0016] 所述的FABP2為氨基酸序列如SEQIDN0:4所示的蛋白質；
[0017] 所述的FABP3為氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的蛋白質；
[0018] 所述的FABP4為氨基酸序列如SEQIDN0:6所示的蛋白質；
[0019] 所述的FABP5為氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示的蛋白質；
[0020] 所述的FABP6為氨基酸序列是SEQ ID N0:8第2~127位氨基酸殘基所示的蛋白質； [0021] 所述的FABP7為氨基酸序列如SEQIDN0:9所示的蛋白質；
[0022] 所述的FABP8為氨基酸序列如SEQIDN0:10所示的蛋白質；
[0023] 所述的FABP9為氨基酸序列如SEQIDN0:11所示的蛋白質；
[0024]或者，為將SEQ ID NO: 1~11所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質；
[0025]所述表皮生長因子EGF蛋白為氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示的蛋白質，或者為 將SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質；
[0026] 所述的脂肪酸結合蛋白FABP和表皮生長因子EGF蛋白通過柔性接頭連接；
[0027] (2)將(1)的N端連接組氨酸標簽得到帶標簽融合蛋白。
[0028]作為一種優選技術方案，所述的脂肪酸結合蛋白FABP優選為人類FABP6。
[0029] 上述的柔性接頭優選為6~30個氨基酸，進一步優選為15~20個氨基酸，更進一步 優選的所述柔性接頭的序列如SEQ ID N0:15所示;所述組氨酸標簽包含5-8個His，優選6個 His，更進一步優選的，所述組氨酸標簽的序列如SEQ ID N0:13所示。
[0030] 更進一步優選的，所述的可溶性表皮生長因子融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :16所示。
[0031 ]上述可溶性表皮生長因子融合蛋白的編碼基因。
[0032] 作為一種優選技術方案，上述可溶性表皮生長因子融合蛋白編碼基因的核苷酸序 列如SEQ ID N0:17所示。
[0033] 含有上述編碼基因的表達載體、轉基因細胞系和表達工程菌。
[0034] -種可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體，其在于該表達載體是將上述融合蛋 白的編碼基因插入到原核細胞表達質粒的Ncol/Xhol酶切位點之間得到;優選的：所述融合 蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示;所述的原核細胞表達質粒為pET28a。
[0035] -種制備可溶性表皮生長因子融合蛋白的方法，將上述的表達載體轉化感受態表 達菌株獲得表達工程菌，并進行培養得到可溶性表皮生長因子融合蛋白。
[0036] 上述可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體在表達可溶性表皮生長因子融合蛋 白中的應用。
[0037]本發明最優選的可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體FABP6-EGF的詳細制備過 程：
[0038] 1)基于多聚酶鏈式反應(PCR)的全基因人工合成方法，合成人游離脂肪酸結合蛋 白6(FABP6)與人EGF的融合蛋白FABP6-EGF(SEQIDN0:16)的DNA編碼序列（SEQIDN0 : 17)。
[0039] 2)將上述融合蛋白FABP6-EGF的編碼DNA經過Ncol/Xhol DNA內切酶消化，瓊脂糖 凝膠電泳分離純化，得到插入片段。
[0040] 3)經過內切酶Ncol/Xhol雙酶切并瓊脂糖凝膠電泳分離純化原核細胞表達質粒 pET28a，但不限于該表達質粒。
[00411 4)用T4DNA連接酶將載體pET28a與融合蛋白FABP6-EGF編碼DNA的插入片段相連 接，轉化感受態菌DH5a，獲得正確序列的陽性克隆PFABP6-EGF，作為工程質粒(SEQ ID N0: 34)0
[0042] 5)將pFABP6-EGF質粒轉化BL21(DE3)感受態表達菌株，卡那霉素存在下篩選與誘 導表達測試，獲得表達工程菌株BL21 (DE3) /pFABP6-EGF。
[0043] 本發明所述的FABP優選人類FABP，本發明采用人類FABP6，但不限于FABP6，可以是 FABP1 ~FABP9的任何一種（SEQ ID N0:1 ~11)。
[0044] 所述的FABP優選置于EGF上游，在FABP與EGF之間優選放置柔性接頭DNA編碼序列， 優選編碼6~30個氨基酸，進一步優選編碼15~20個氨基酸。
[0045]所述的FABP編碼序列上游包含組氨酸標簽，所述的組氨酸標簽5-8個His密碼子不 等，優選6個。所述的組氨酸編碼序列位于起始密碼子ATP的下游。
[0046]本發明所述的pFABP-EGF表達載體在表達目標蛋白中具有如下優點：
[0047] 1)可溶性蛋白與包涵體蛋白的比值大于50% ;
[0048] 2)容易借助組氨酸標簽(His-Tag)親和純化獲得目標蛋白。
【附圖說明】
[0049] 圖1、FABP-EGF融合蛋白示意圖
[0050] 圖2、pFABP6-EGF表達載體物理圖
【具體實施方式】
[0051] 下面通過具體實施例對本發明的應用進行說明，所舉的實施例僅是對本發明的應 用作概括性例示，有助于更好地理解本發明的用途，但并不會限制本發明應用范圍。下述實 施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法;所述試劑和材料，如無特殊說明，均可 從商業途徑獲得。
[0052] 實施例1
[0053] 一種可溶性表皮生長因子融合蛋白FABP6-EGF表達載體的構建方法，包括以下步 驟：
[0054] 步驟一、人類FABP與人類EGF的編碼DNA的人工合成和優化，本實施例以人類FABP6 為例（SEQ ID N0:8)，人類EGF以53個氨基酸的成熟肽為例（SEQ ID N0:12):
[0055] (1)將His-Tag氨基酸序列（SEQ ID NO: 13)、去除起始甲硫氨酸的FABP6氨基酸序 列（SEQ ID N0:14)、柔性接頭氨基酸序列（SEQ ID N0:15)、EGF氨基酸序列（SEQ ID N0:12) 按次序合并為"His-Tag-FABP6-柔性接頭一EGF" (SEQ ID NO: 16)，但不限于此序列，以蛋 白質氨基酸序列同源性等于或大于85 %為限。
[0056] (2)將該編碼序列（SEQ ID從):16)輸入從^1軟件0熟￥〇冰8(￥3.2.3):
[0057] ①獲得逆翻譯的并且密碼子優化了的DNA編碼序列（SEQ ID NO: 17);
[0058] ②獲得用于PCR方法全基因合成的引物(SEQ ID NO: 18~33);
[0059] ③在第一個引物的起始密碼5'-端添加 Ncol內切酶位點和四個保護堿基（SEQ ID N0：18)；
[0060] ④在最后一個引物的終止密碼的5'-端添加 Xhol內切酶位點和四個保護堿基(SEQ ID NO:33)。
[0061] (3)多聚酶鏈式反應(PCR)法合成全長編碼DNA序列第一步：
[0062] ①將引物用無菌去離子水分別稀釋至ΙΟμΜοΙθ濃度；
[0063]②從每管引物分別取lyL加入1支200yL PCR管；
[0064] ③然后依次加入dNTP 4yL，10x PCR Buffer 5yL，無菌去離子水加至50yL;
[0065] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25yL;
[0066] ⑤PCR參數：預變性95°C/3min;變性94°C/30sec,退火58°C/30sec,延伸72°C/ 2min,20個循環;補全延伸72°C/5min。
[0067] (4)多聚酶鏈式反應(PCR)法合成全長編碼DNA序列第二步：
[0068] ①取第一步PCR擴增產物lyL加入到200yL新的PCR管；
[0069] ②分別加入第一個引物（SEQIDN0:18)和最后一個引物（SEQIDN0:33)各2μL; [0070] ③然后依次加入dNTP 4yL，10x PCR Buffer 5yL,無菌去離子水加至50yL;
[0071] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25yL;
[0072] ⑤PCR參數：預變性95°C/3min;變性94°C/30sec,退火60°C/30sec,延伸72°C/ 2min, 35個循環;補全延伸72°C/5min。
[0073] (5)PCR產物的純化與酶切:PCR產物經微型硅膠柱離心純化，Nco I/Xho I限制性 內切酶雙酶切過夜。
[0074] (6)酶切DNA產物的純化:采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收獲得兩端分別是Nco I和 Xho I的粘性接頭的插入片段。
[0075] 步驟二、載體DNA制備：
[0076] 制備表達載體pET28a，但不限于該表達載體：
[0077] (1)取pET28a載體2yg，用限制性內切酶Nco I和Xho I雙酶切。
[0078] (2)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化線性化后的pET28a載體。
[0079]步驟三、連接與轉化
[0080] (1)用T4DNA連接酶將包含FABP6-EGF序列的插入片段和步驟二制備好的pET28a表 達載體連接。
[0081 ] (2)轉化大腸桿菌感受態菌株DH5a，含卡那霉素(Kan)抗生素的瓊脂培養皿培養過 夜，然后挑取單菌落，常規PCR法鑒定陽性克隆。
[0082] (3)將陽性克隆送交DNA序列分析，選取和保留序列正確的克隆，常規制備DNA質 粒。
[0083] (4)獲得的工程載體質粒命名為pFABP6-EGF(SEQ ID N0:34)
[0084]實施例2載體的表達測試：
[0085] (1)將得到的pFABP6-EGF載體DNA質粒轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)感受態細 胞，獲得卡那霉素 (Kan)抗性的菌落。
[0086] (2)挑取單菌落數個，LB培養基培養，IPTG誘導4-12小時，收集菌液lmL，離心收集 菌體，1 X PBS洗滌一次，再懸浮于0.5mL 1 X PBS，超聲破碎菌體，離心去沉淀。
[0087] (3)取適量20yL上清與SDS-PAGE上樣緩沖液混合，95°C加熱變性10分鐘，離心收集 至管底，置于冰上。
[0088] (4)取10yL上樣，12%聚丙烯酰胺電泳，考馬斯亮藍染色、脫色，觀察蛋白質條帶和 FABP6-EGF蛋白的表達情況。
[0089] (5)重組FABP6-EGF，包括N-HisTag、柔性接頭、多克隆區，共209aa，分子量 17.2kDaDFABP6-EGF占菌體總蛋白的20-25%，可溶性蛋白占50-60%，包涵體占40-50 %，優 于既往文獻記載的EGF裸露表達幾乎全部為包涵體的表達載體。
【主權項】
1. 一種可溶性表皮生長因子融合蛋白，其特征在于是如下（1)或(2)的蛋白質： (1) 由脂肪酸結合蛋白FABP和表皮生長因子EGF蛋白融合得到的融合蛋白； 所述的脂肪酸結合蛋白FABP是FABP1~FABP9中的任意一種或亞種，所述FABP1~FABP9 的氨基酸序列如下所示： 所述的FABP1為氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白質； 所述的FABP1-1為氨基酸序列如SEQIDN0:2所示的蛋白質； 所述的FABP1-2為氨基酸序列如SEQIDN0:3所示的蛋白質； 所述的FABP2為氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的蛋白質； 所述的FABP3為氨基酸序列如SEQIDN0:5所示的蛋白質； 所述的FABP4為氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的蛋白質； 所述的FABP5為氨基酸序列如SEQIDN0:7所示的蛋白質； 所述的FABP6為氨基酸序列是SEQ ID NO:8第2~127位氨基酸殘基所示的蛋白質； 所述的FABP7為氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白質； 所述的FABP8為氨基酸序列如SEQIDN0:10所示的蛋白質； 所述的FABP9為氨基酸序列如SEQIDN0 :11所示的蛋白質； 或者，為將SEQ ID NO: 1~11所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質； 所述表皮生長因子EGF蛋白為氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示的蛋白質，或者為將SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具 有相同功能的由其衍生的蛋白質； 所述的脂肪酸結合蛋白FABP和表皮生長因子EGF蛋白通過柔性接頭連接； (2) 將(1)的N端連接組氨酸標簽得到帶標簽融合蛋白。2. 根據權利要求1所述的可溶性表皮生長因子融合蛋白，其特征在于所述的脂肪酸結 合蛋白FABP優選為人類FABP6。3. 根據權利要求1所述的可溶性表皮生長因子融合蛋白，其特征在于所述的柔性接頭 優選為6~30個氨基酸，進一步優選為15~20個氨基酸，更進一步優選的所述柔性接頭的序 列如SEQ ID NO: 15所示;所述組氨酸標簽包含5-8個His，優選6個His，更進一步優選的，所 述組氨酸標簽的序列如SEQ ID NO: 13所示。4. 根據權利要求3所述的可溶性表皮生長因子融合蛋白，其特征在于該融合蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。5. 權利要求1~4中任意一項所述可溶性表皮生長因子融合蛋白的編碼基因。6. 根據權利要求5所述可溶性表皮生長因子融合蛋白的編碼基因，其特征在于該編碼 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。7. 含有權利要求5或6所述編碼基因的表達載體、轉基因細胞系和表達工程菌。8. -種可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體，其特征在于該表達載體是將權利要求 1-4中任意一項所述融合蛋白的編碼基因插入到原核細胞表達質粒的Ncol/Xhol酶切位點 之間得到;優選的：所述融合蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示;所述的原 核細胞表達質粒為pET28a。9. 一種制備可溶性表皮生長因子融合蛋白的方法，其特征在于將權利要求8所述的表 達載體轉化感受態表達菌株獲得表達工程菌，并進行培養得到可溶性表皮生長因子融合蛋 白。10.權利要求8所述可溶性表皮生長因子融合蛋白表達載體在表達可溶性表皮生長因 子融合蛋白中的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK106084066SQ201610404986
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】李萬波, 陜婧婧, 盧嬋
【申請人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司