一種新型基因工程重組trail融合蛋白及制備方法和用圖
【專利摘要】本發明公開了一種利用腺病毒纖維蛋白片段作為三聚體模序與TRAIL融合表達，獲得穩定性和活性提高的重組蛋白，作為抗腫瘤治療藥物。還提供融合蛋白表達純化及活性檢測的方法。具體為：第一步；設計并構建融合基因，利用大腸桿菌系統低溫誘導表達；第二步：采用鎳柱親和層析的方法純化目的蛋白，利用凝血酶酶切位點切除His標簽，獲得最終目的蛋白；第三步：體外檢測融合蛋白對腫瘤細胞的殺傷活性和對正常細胞的毒性，第四步：不同條件下檢測融合蛋白的穩定性，第五步：裸鼠模型上檢測融合蛋白的體內抗腫瘤活性。有益效果：發明了2個腺病毒纖維蛋白片段作為三聚體模序的TRAIL融合蛋白。提供了一種簡單，快速的獲得高穩定性TRAIL蛋白的方法，可應用于TRAIL蛋白的抗腫瘤研究和應用。解決了TRAIL蛋白穩定性差，活性低的弊端。
【專利說明】
一種新型基因工程重組TRAIL融合蛋白及制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明涉及一種融合蛋白及制備方法和用途，特別涉及一種新型基因工程重組 TRAIL融合蛋白及制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族一員，具有廣譜抗癌的功能，且其對與正常的組織和細胞幾乎是無毒 的。有活性的TRAIL是三聚體狀態，由三聚體中心的鋅離子與各個單體上的半胱氨酸通過螯 合作用維持。但TRAIL本身半衰期短、穩定性差、生物活性不強、并且有研究表明引入標簽后 可溶性TRAIL三聚體結構秩序會改變從而產生肝毒性。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是為了解決TRAIL本身半衰期短、穩定性差以及生物活性不強的問 題而提供的一種新型基因工程重組TRAIL融合蛋白及制備方法和用途。
[0004] 本發明提供的新型基因工程重組TRAIL融合蛋白包含可溶性TRAIL蛋白片段和腺 病毒纖維蛋白片段，其中可溶性TRAIL蛋白片段進一步選自N端截短94個氨基酸的人TRAIL 蛋白，其核酸序列如SEQ ID N0:1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0005] 本發明提供的新型基因工程重組TRAIL融合蛋白中包含的腺病毒纖維蛋白片段分 別是人血清5型腺病毒和禽1型腺病毒纖維蛋白的Tail及Shaft片段，其包含人血清5型腺病 毒纖維蛋白片段的核酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，其包含 禽1型腺病毒纖維蛋白片段的核酸序列如SEQ ID N0:5所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 示
[0006] 本發明提供的新型基因工程重組TRAIL融合蛋白的制備方法，其方法如下所述：
[0007] 步驟一、取工程菌接種于LB培養基，37 °C搖菌培養至0D600達到0.2-1.2時，加入誘 導劑(0.3-1.2mM IPTG)培養4-20h，誘導培養溫度為20°C ;
[0008] 步驟二、收集菌體，裂解（用含有蛋白酶抑制劑的PBS重懸菌體沉淀，4 °C超聲破碎 20min)，收集上清，分離純化，切除標簽，分離純化采用鎳柱親和層析，其中洗滌液是含有 50mM咪唑的基礎液(NaH2P〇4 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0)，洗脫液是含有250mM咪唑的基礎 液，消化His標簽是利用載體上的凝血酶位點，將純化的蛋白與凝血酶混合1-18小時，混合 比例為lmg蛋白使用1 -100U凝血酶，混合條件為4°C。
[0009] 本發明提供的新型基因工程重組TRAIL融合蛋白穩定性的檢測方法:取具有相同 殺傷活性融合蛋白，使用蛋白濃度為sTR: 100nM，FA1FT: 50nM，HA5ST: 50nM，包括以下方法： [0010] 1)將蛋白樣品置于緩沖體系中〇h_24h，緩沖體系為4°C的PBS。
[0011 ] 2)將蛋白樣品置于緩沖體系中0h-24h，緩沖體系為37°C的PBS。
[0012 ] 3)將蛋白樣品置于血漿中0h-24h，血漿為37 °C裸鼠血漿。
[0013] 4)將蛋白樣品反復凍融，凍融方法為循環置于37°C10min與-80°C10min。
[0014] 本發明提供的新型基因工程重組TRAIL融合蛋白在腫瘤或癌癥治療中的應用。
[0015] 本發明的有益效果：
[0016]本發明提供的新型基因工程重組TRAIL融合蛋白不依賴于鋅原子的TRAIL三聚體， 方法簡單，純度高，無肝腎毒性，具有較好的抗腫瘤或癌細胞活性。
【附圖說明】
[0017] 圖1.新型基因工程重組TRAIL融合蛋白設計示意圖。
[0018] 圖2.表達重組TRAIL融合蛋白的質粒鑒定結果。
[0019] 圖3.TRAIL融合蛋白誘導表達和純化。
[0020] 圖4.TRAIL融合蛋白切除His標簽鑒定圖。
[0021] 圖5.切除標簽后的TRAIL融合進行非還原性SDS-PAGE。
[0022]圖6.不同濃度的TRAIL融合蛋白對多種腫瘤細胞的殺傷作用。
[0023]圖7.不同濃度的TRAIL融合蛋白對正常細胞的殺傷作用。
[0024] 圖8.Annexin V/PI檢測細胞凋亡。
[0025] 圖9. TRAIL融合蛋白的穩定性評價。
[0026] 圖10.腹腔注射原位注射TRAIL融合蛋白的抗腫瘤效果比較。
【具體實施方式】
[0027] 本說明書和權利要求書所使用的縮寫的含義如下所示：
[0028]
[0029] 本發明實施例中未說明來源的試劑和儀器均為普通市售品。
[0030] 下面以具體的實施例，對本發明的技術方案做進一步的技術說明；但本發明并不 限于這些實施例。
[0031] 實施例1腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表達載體的構建
[0032] 1.目的基因的獲得
[0033] 以實驗室保存的帶有TRAIL基因的質粒pDC316-TRAIL(人源，aa95-281)為模板進 行PCR，反應條件為:95°C預變性10min;95°C變性3〇8,56°(：退火3〇8,72°(：延伸11^11，30個循 環;72 °C延伸1 Omin。PCR產物經1.2 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR 產物。用Vector NTI Suited 6軟件根據Genebank提供的人TRAIL基因序列TRAIL引物如下：
[0034] 上游引物序列：5 ' -GCTAGCATGACCTCTGAGGAAACCATTTCTAC-3 '，含Nhe 頂每切位點。
[0035] 下游引物序列：5' -AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3'，含Hind II1 酶切位點。
[0036] 2.表達載體的構建
[0037] 以實驗室存有的禽類1型腺病毒(Fowl Adi)骨架質粒和上述獲得的TRAIL基因為 模板進行〇verlap-PCR，將Fowl Adi基因的C端(包括tai 1基底蛋白和全長的shaft，不包括 knob蛋白）與TRAIL的N端連接(如圖1，左圖），用pfu高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，為方便 將基因克隆入表達載體pET-28a，引物中添加相應的酶切位點。
[0038] 上游引物：5 ' -GCTAGCATGGCTGACCAGAAAAGGAAGCTG-3 '，含Nhe 頂每切位點。
[0039] 下游引物:5 ' -AAGCTITTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3 '，含Hind IΠ 酶切位點。
[0040] 融合蛋白Fowl Adlfiber sTR(FAlFT)的核酸編碼序列如SEQ ID N0:1，氨基酸序 列如SEQ ID N0:2。
[00411以實驗室存有的人類5型腺病毒(Human Ad5)骨架質粒和上述獲得的TRAIL基因 為模板進行0verlap-PCR，將Human Ad5的N端shaft(只包含Shaft的C端一個螺旋，不包含 knob)與TRAIL的N端連接(如圖1 )，用pfu高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。
[0042] 上游引物：5 ' -GCTAGCATGGGTGCCATTACAGTAGGAAAC-3 '，含Nhe 頂每切位點。
[0043] 下游引物:5'-AAGCTITTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3'，含Hind II1 酶切位點。
[0044] 融合蛋白HumanAd5fibersTR(HA5ST)的核算編碼序列如SEQIDN0:3，氨基酸序 列如SEQ ID N0:4。
[0045] 將上述FA1FT和HA5ST的PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖lhPCR產物用瓊 脂糖膠回收試劑盒(TAKARA)回收，與平末端載體Peasy(北京全式金)連接，經測序正確后， 利用Nhe I和Hind III酶切位點，將融合基因進行雙酶切，用瓊脂糖膠回收試劑盒回收DNA 片段，再與經同樣雙酶切的pET28_a載體相連接，鏈接產物轉化至DH5a感受態細胞，通過卡 納抗性篩選和質粒雙酶切鑒定（圖2)，陽性克隆進一步通過DNA序列分析進行驗證，堅定正 確的質粒分別命名為pET-28a-sTR、pET-28a-FAl FT、pET-28a-HA5ST。
[0046] 實施例2腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表達載體的構建
[0047] 1.原核表達
[0048]將上述3個原核表達質粒分別轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(大連寶生物）， 涂于含有卡納青霉素（l〇〇ug/ml)的LB固體培養基上，置于37°C恒溫箱中過夜培養。在上述 平板中挑取單菌落，接于1 OmLLB液體培養基中過夜培養。將得到的菌液接種于1L LB液體培 養基中，37°C振蕩大量培養。菌體的0D600值達到0.8時，加入終濃度lmmol/L的誘導劑異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，北京鼎國），20°C誘導表達16小時。誘導前和誘導后的菌體留 樣進行SDS-PAGE電泳，如圖3。
[0049] 2.蛋白純化
[0050] 將大量誘導后菌體在4°C下，以4000rpm離心30min收菌，超聲破碎20min，在4°C下， 以12000rpm離心30min得上清、沉淀，分別取樣電泳。上清經0.22μηι濾膜過濾后，進行鎳離子 親和柱(美國Invitrogen)純化。先以基礎液(NaH2P〇4 50mM;NaCl 500mM; ρΗ=8 · 0)平衡鎳離 子親和柱，再將濾后上清液掛柱。然后用基礎液、含50mM咪唑的基礎液、含250mM咪唑的基礎 液、含300mM咪唑的基礎液依次進行洗脫2個柱體積。每個梯度用1.5mL Ep管接樣10個EP管 (每管lmL)。再用基礎液和雙蒸水分別洗2個柱體積，然后以20 %乙醇洗一個柱體積，20 %乙 醇封柱，4 °C保存，取0.5mg/ml的純化后樣品進行SDS-PAGE電泳，鑒定濃縮后蛋白純度較高 (圖3)還原性SDS-PAGE電泳：向30yL收獲的蛋白樣品中加入10yL 4 X上樣緩沖液（0.35M 1^8-!1(：1(?!1 = 6.8)，3〇%甘油，1〇%3〇3,〇.〇12%溴酚藍，6%0-巰基乙醇），充分混勻，1〇〇 。(:煮沸20min后，4°C 12000 X g，離心10min，取20yL離心上清加載至13 · 5%SDS-PAGE凝膠中， 120￥電泳1.511。
[0051] 表1.重組TRAIL蛋白單體分子質量的理論值與電泳結果比較
[0052]
[0053]切除His標簽:將純化后的蛋白濃縮除去咪唑，然后按照酶:蛋白=10U: lmg的比例 加入凝血酶(經科化學），4°C攪拌12h。再利用鎳柱與His標簽的親和性除去切下來的片段。 切除標簽后的蛋白進行western blot，分別使用TRAIL抗體和His標簽抗體鑒定，anti TRAIL的結果顯示，切除標簽的重組TRAIL蛋白分子量略有減小，蛋白有約20 %的損失。anti His的結果顯示，凝血酶處理后的蛋白不能被染出條帶，證明成功去除標簽，結果如圖4。為 了更好的保護未經修飾重組TRAIL蛋白，即sTR的穩定性及活性，在最終得到的sTR蛋白樣品 中，加入ZnCl 2加入比例為0.46mol鋅/mol蛋白，同時為了避免蛋白發生高聚，每組蛋白樣品 中加入ImM DTT。
[0054] 除標簽后的融合蛋白進行非還原性⑶S-PAGE電泳鑒定Fiber-TRAIL融合蛋白在溶 液中呈三聚體狀態（圖5)。非還原性SDS-PAGE電泳：向30yL收獲的蛋白樣品中加入1 OyL 4 X 非還原性上樣緩沖液(0.35M 1^8-!1(：1(?!1=6.8)，30%甘油，10%303,0.012%溴酚藍），充 分混勻，4°C，12000 X g，離心10min，取20yL離心上清加載至13.5 % SDS-PAGE凝膠中，120V電 泳1·5h。
[0055] 實施例3Fiber-TRAIL融合蛋白對腫瘤細胞殺傷作用的檢測 [0056] 腫瘤細胞株：
[0057] 乳腺癌細胞:ZR-75-30，MCF7;肺癌細胞:A549;肝癌細胞:SMMC-7721;結腸癌細胞： SW480;宮頸癌細胞:Hela;乳腺正常細胞:MCF-10A;肝正常細胞:Chang Liver。
[0058] 1 )FA1FT和HA5ST對腫瘤細胞的殺傷作用
[0059] 實驗方法:細胞培養在含10%小牛血清的，10(^8/1111鏈霉素和1001]/1111青霉素的培 養基中，37°C，5%C02條件下培養。將1 X 104個細胞接種于96孔板中，貼壁過夜，然后將培養 基換為含2 %小牛血清的培養基，加入不同濃度梯度(0.01，0.1，1，10和100nM)的實例2中 獲得的融合蛋白。作用過夜后，加入20μ1的MTT溶液，反應4小時后，棄去上清液，加入150μ1 的DMS0溶解沉淀，然后用酶標儀測定490nm吸光值。以未經過蛋白處理的細胞存活率為 100%來計算蛋白處理的細胞存活率。
[0060]實驗結果:如圖6所示，隨著蛋白濃度提高，FA1FT和HA5ST對腫瘤細胞的殺傷能力 逐漸增強，細胞存活率降低。ZR-75-30，SMMC-7721，Hela三種細胞對融合TRAIL蛋白均較敏 感，當蛋白濃度為1~1〇ηΜ時，細胞存活率在50 %左右。MCF-7，A549，SW480，對FA1FT和HA5ST 的敏感性稍弱，當蛋白濃度為10~l〇〇nM時，細胞存活率在50 %左右。正常肝細胞，乳腺細胞 對蛋白不敏感，即使蛋白濃度達到1 OOnM時，細胞存活率仍然在90 %以上。
[0061] 這些結果表明，FA1FT和HA5ST可以選擇性的殺傷腫瘤細胞，如乳腺癌，肺癌，肝癌 細胞，結腸癌，宮頸癌，而對正常細胞無毒性(圖7)。
[0062] 2)FA1FT和HA5ST對腫瘤細胞的殺傷途徑的檢測
[0063]實驗方法:取對數生長期的ZR-75-30細胞，調整細胞懸液濃度為5X105/ml，以每 孔2ml鋪6孔板，過夜培養。調整蛋白樣品終濃度為10nM，37°C，5%⑶2培養4h;胰酶消化細 胞。用lml預冷的PBS重懸細胞。用100~500μ1的Annexin-V(FITC)/PI試劑盒中的lXBiding buffer重懸，300目紗網過濾后上機檢測。
[0064] 實驗結果:如圖8所示，10nM的FA1FT組中，有61.3%的細胞進入凋亡狀態，說531'組 中有66.8 %的細胞進入凋亡狀態，是sTR組(34.1 % )的2倍。
[0065] 綜上，本發明通過對腫瘤細胞和正常細胞的存活率檢測，FA1FT和HA5ST對腫瘤細 胞的殺傷活性是在凋亡水平實現的，并未導致細胞壞死。
[0066] 實施例4Fiber-TRAIL融合蛋白體外穩定性檢測 [0067] 1)FA1FT和HA5ST在PBS中的穩定性
[0068]實驗方法：取具有相同殺傷能力的各組蛋白作為起始點。即：sTR(100nM)，FAlFT (50nM)，HA5ST(50nM)。將各組蛋白用PBS稀釋，放置于4°C或37°C環境中，在不同時間點取樣 進行MTT實驗，檢測剩余活性。
[0069] 實驗結果:如圖9所示，37°C環境下，未經改造的sTR在2h時已經完全喪失了活性，4 °C環境中逐漸喪失活性。而FA1FT和HA5ST對ZR-75-30細胞的殺傷能力在24h內一直維持穩 定，幾乎沒有損失，與sTR相比有顯著性差異(*，P〈0.1 ;#，P〈0.01;*#，P〈0.001)。
[0070] 2)FA1FT和HA5ST在血漿中的穩定性
[0071] 實驗方法:將各組蛋白與裸鼠血漿混合孵育，置于37°C環境中，在不同時間點取樣 進行剩余活性的檢測。
[0072] 實驗結果：如圖9所示，在37°C血漿環境中，sTR在0.5h是活性降低一半，lh已經喪 失全部殺傷活性。FA1FT和HA5ST的殺傷能力在6h內維持穩定，隨后蛋白活性逐漸降低，但在 24h時仍具有40%的殺傷力，與sTR相比有顯著性差異。
[0073] 3)FA1FT和HA5ST反復凍融后的穩定性
[0074] 實驗方法:將FA1FT和HA5ST融合蛋白分別置于-80 °C和37 °C反復凍融，取不同凍融 次數的蛋白樣品進行剩余活性的檢測。
[0075] 實驗結果:如圖9所示，sTR在一次凍融后就失去三聚體構象，不能誘導ZR-75-30細 胞凋亡。雖然FA1FT和HA5ST隨凍融次數的增加逐漸失去殺傷活性，與sTR比較，在穩定性上 仍然有顯著性差異(*，Ρ〈〇·1;#，Ρ〈〇·〇1;*#，Ρ〈〇·〇〇1)。
[0076]實施例5Fiber_TRAIL融合蛋白（實施例2制備)體內抗腫瘤檢測 [0077] 1)腹腔注射FA1FT和HA5ST的抗腫瘤效果
[0078]實驗方法：收集生長狀態良好的ZR-75-30細胞，離心除去培養基，無菌PBS洗滌兩 次，最后用適量的預冷的PBS重懸細胞，使細胞數為IX 107個/ml，冰上暫存。選7周齡的 BALB/c雌性裸鼠，在背部右后處皮下注入100μΙ的ZR-75-30細胞，1 X 106個/ml。約14天，月中 瘤體積長到約150mm3時，腹腔給藥，0. lnmol/只，連續注射8天。對照組注射相同體積的PBS， 每天記錄瘤體積。以治療第1天的初始瘤體積為100%，計算每組每只鼠的相對瘤體積為縱 坐標。（每組8只鼠。*，Ρ〈0· 1 ;**，Ρ〈0·01 ;***，Ρ〈0·001)。
[0079] 結果如圖10，PBS組腫瘤迅速增長，在成瘤后第12天，相對瘤體積已經超過2000,相 比于sTR，HA5ST能夠有效抑制腫瘤生長，在開始治療后第24天，sTR組相對瘤體積在1409 土 200，HA5ST組相對瘤體積在199 % ± 30 %，FA1FT組相對瘤體積在第13天時，相對瘤體積達到 1586% ±300%。
[0080] 2)原位注射FA1FT和HA5ST的抗腫瘤效果
[0081 ] 實驗方法:選7周齡的BALB/c雌性裸鼠，在背部右后處皮下注入100μΙ的ZR-75-30 細胞，1 X 1〇6個/ml。約14天，腫瘤體積長到約400mm3時，原位注射蛋白，注入體積不超過50μ 1，0.5nmol/只，連續注射8天。對照組注射相同體積的PBS，每天記錄瘤體積。以治療第1天的 初始瘤體積為1 〇〇 %，計算每組每只鼠的相對瘤體積為縱坐標。（每組8只鼠。*，P〈0.1 ;**，P〈 〇·〇1;***，Ρ〈〇·〇〇1)。
[0082]結果如圖10，PBS組在成瘤后第9天，相對瘤體積超過平均值在405%，治療結束時 sTR組相對瘤體積平均值在200 %，FA1FT組相對瘤體積平均值在134 %
[0083]綜上，本發明成功獲得了腺病毒fiber-TRAIL融合蛋白，其三聚體構象的維持不依 賴于結構中心的鋅離子，與天然的可溶性TRAIL蛋白相比，其穩定性顯著提升，體內外抗腫 瘤活性也顯著增強，并且沒有對正常組織細胞造成毒性。
【主權項】
1. 一種新型基因工程重組TRAIL融合蛋白，其特征在于：包含可溶性TRAIL蛋白片段和 腺病毒纖維蛋白片段。2. 權利要求1的重組TRAIL融合蛋白，其中所述可溶性TRAIL蛋白片段選自人TRAIL蛋白 可溶性胞外區。3. 權利要求2的重組TRAIL融合蛋白，其中所述可溶性TRAIL蛋白片段進一步選自N端截 短94個氨基酸的人TRAIL蛋白，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:2 所示。4. 權利要求1的重組TRAIL融合蛋白，其中所述腺病毒纖維蛋白片段選自人腺病毒、禽 腺病毒和猴、馬、牛、羊、豬、狗、鼠等哺乳類動物腺病毒。5. 權利要求4的重組TRAIL融合蛋白，其中所述腺病毒纖維蛋白片段進一步選自人血清 5型腺病毒和禽1型腺病毒。6. 權利要求1的重組TRAIL融合蛋白，其中所述腺病毒纖維蛋白片段進一步包含Tail和 Shaft結構。7. 權利要求1的重組TRAIL融合蛋白，其包含人血清5型腺病毒纖維蛋白片段的核酸序 列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，其包含禽1型腺病毒纖維蛋白片段 的核酸序列如SEQ ID N0:5所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。8. 權利要求1的重組TRAIL融合蛋白，其包含選自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9的核酸序 列和選自SEQIDN0:8、SEQIDN0:10的氨基酸序列。9. 一種新型基因工程重組TRAIL融合蛋白的制備方法，其方法如下所述： 步驟一、取工程菌接種于LB培養基，37°C搖菌培養至0D600達到0.2-1.2時，加入誘導劑 (0.3-1.2mM IPTG)培養4-20h，誘導培養溫度為20°C; 步驟二、收集菌體，超聲裂解，收集上清，分離純化，切除標簽，分離純化采用鎳柱親和 層析，其中洗滌液是含有50mM咪唑的基礎液(NaH2P04 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0)，洗脫液 是含有250mM咪唑的基礎液，消化His標簽是利用載體上的凝血酶位點，將純化的蛋白與凝 血酶混合1-18小時，混合比例為lmg蛋白使用1-100U凝血酶，混合條件為4°C。10. -種新型基因工程重組TRAIL融合蛋白在腫瘤或癌癥治療中的應用。
【文檔編號】A61K38/16GK106084063SQ201610356325
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】于彬, 于湘暉, 孔維, 閆晶怡, 王真
【申請人】吉林大學