橋連的雙特異性融合蛋白的制作方法

橋連的雙特異性融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明涉及橋連的雙特異性融合蛋白，具體地，本發明涉及改良的拮抗血管新生誘導因子的融合蛋白及其用途，更具體地，本發明涉及VEGF受體和FGF受體的融合蛋白及其在治療與血管新生相關的疾病中的用途。
【專利說明】
橋連的雙特異性融合蛋白
技術領域
[0001] 本發明涉及橋連的雙特異性融合蛋白，具體地，本發明涉及改良的拮抗血管新生 誘導因子的融合蛋白及其用途，更具體地，本發明涉及VEGF受體和FGF受體的融合蛋白及其 在治療與血管新生相關的疾病中的用途。
【背景技術】
[0002] 血管新生(Angiogenesis)是導致惡性腫瘤生長和轉移的基本要素之一 [1]。血管 新生過程受多種因子的調節，有些因子促進血管新生，有些因子抑制血管新生，目前已經知 道相當數目的血管新生刺激因子，例如血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，FGF)、肝細胞生 長因子（Hepatocyte growth factor，HGF)、DDR1、EphAl、EphA2、EphA8、EphBl、EphB4、EGFR、 HER-2、ErbB3、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、T i e-1 等，這些因子能刺激血管 內皮細胞的分裂、分化和血管的形態發生。其中，VEGF是目前所知對血管新生最特異、最有 效的生長因子[2,3]。
[0003] 在腫瘤組織內的缺氧環境中，腫瘤細胞分泌大量的VEGF，誘導血管內皮細胞的分 裂和迀移，最終建立腫瘤血管網絡。眾多動物試驗證明，抑制VEGF能阻止血管新生，進而抑 制腫瘤的生長。正因為此，VEGF及其受體是抗血管新生藥物最重要的靶標，目前在臨床試驗 中取得顯著療效的抗血管新生藥物有貝伐單抗(Bevacizumab，商品名Avastin)，它能夠直 接阻斷VEGF，抑制腫瘤血管的新生，于2004年被美國FDA批準上市作為結直腸癌的一線用 藥，是第一個被批準上市的通過抑制血管新生發揮抗癌作用的新藥。
[0004] 除了Avastin，還有若干個抗VEGF信號的藥物已獲得批準上市。Regeneron研發的 針對VEGF的融合蛋白Aflibercept(或稱VEGF-Trap)于2011年被FDA批準上市用于治療年齡 相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，又于2012年被批準用于治療 結直腸癌。成都康弘研發的針對VEGF的融合蛋白KH902于2013年11月被CFDA批準上市。
[0005] 抗VEGF藥物在腫瘤的臨床治療上取得了重大的進展，但是，臨床試驗也顯示抗 VEGF治療也存在相當大的局限。導致抗VEGF治療失敗或產生抗性的的根本原因可能在于腫 瘤血管新生是受到多種因子控制的，盡管VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一 的血管新生刺激因子。
[0006] 成纖維細胞生長因子(FGF)是結合肝素的生長因子家族，在哺乳動物中其具有22 個家族成員（FGF 1-14,16-23) JGF在多種生物學功能上具有重要作用，例如細胞增殖、分 化、迀移、血管新生和腫瘤發生。其通過結合并活化細胞表面FGF受體(FGFR)發揮其多種生 物學功能。（參見，例如Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev .16:139-149， 2005)。成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR)是與成纖 維細胞生長因子家族成員相結合的受體。成纖維細胞生長因子受體中的一部分參與疾病過 程。
[0007] 關于兩個結合結構域在Fc的兩端的報道，中國專利申請CN101490085A公開了一種 具有效應功能的單鏈多價結合蛋白，其中第一結合結構域與第二結合結構域均源自免疫球 蛋白，第一結合結構域與第二結合結構域分別在Fc的兩端。除此之外，中國專利申請 CN104159926A公開了一種包含補體抑制結構域、VEGF抑制結構域的融合蛋白，補體抑制結 構域、VEGF抑制結構域可以在Fc的兩端，也可以在Fc的一端。
[0008] 鑒于VEGF和FGF(尤其是FGF-2)在腫瘤血管新生中的重要作用，我們認為雙重拮抗 VEGF和FGF(尤其是FGF-2)的大分子蛋白藥物將能夠更好地抑制腫瘤血管的新生，在臨床上 得到更好的治療效果。中國專利ZL201110131029.X公開了一種VEGFR和FGFR的雙靶標融合 蛋白，將VEGFR和FGFR的血管新生抑制單元融合在一起，形成了抑制雙重靶標進而抑制血管 新生的融合蛋白，獲得了特別好的效果。
[0009] 盡管現有技術在本領域已經取得了上述進展，但是仍然需要穩定性更高、親和力 更強的血管新生抑制劑。本發明人出人意料地發現，將血管新生抑制單元（例如VEGFR和 FGFR的結構域)放在融合蛋白的兩端，可減少相互之間的影響，提高穩定性并且增強親和 力，進一步改進血管新生抑制效果。

【發明內容】

[0010] 在一個方面中，本發明提供了一種雙特異性融合蛋白，其從N端到C端依次包含:特 異性結合血管新生因子的第一靶向結合域、中間橋連結構域和特異性結合血管新生因子的 第二靶向結合域，其中：所述第一靶向結合域包含：一個或更多個VEGF受體或FGF受體的免 疫球蛋白樣結構域;所述中間橋連結構域為免疫球蛋白Fc區；和所述第二靶向結合域包含： 一個或更多個VEGF受體或FGF受體的免疫球蛋白樣結構域。
[0011]在一些實施方案中，所述一個或更多個VEGF受體的免疫球蛋白樣結構域獨立地選 自：VEGFR1或VEGFR2的第一免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二免疫球 蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1 或VEGFR2第四免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五免疫球蛋白樣結構域 或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六免疫球蛋白樣結構域或其一部分、和VEGFR1或VEGFR2第 七免疫球蛋白樣結構域或其一部分。
[0012] 在另一些實施方案中，所述一個或更多個FGF受體的免疫球蛋白樣結構域獨立地 選自：FGFR1第一免疫球蛋白樣結構域或其一部分、FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域或其一 部分和FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域或其一部分。
[0013] 在又一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區是人IgGl Fc區。
[0014] 在一些具體實施方案中，所述第一靶向結合域包含（優選地，從N端到C端依次包 含）：VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域，以及所述第二靶 向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含）：FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和FGFR1第 三免疫球蛋白樣結構域;或者
[0015] 所述第一靶向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含）:FGFR1第二免疫球蛋白 樣結構域和FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域，以及所述第二靶向結合域包含(優選地，從N端 至丨JC端依次包含）：VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域。
[0016] 在一些具體實施方案中，所述第一靶向結合域包含（優選地，從N端到C端依次包 含)或由其組成:VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域，以及 所述第二靶向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含)或由其組成:源自FGFR免疫球蛋 白樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和FGFR1第三免疫球 蛋白樣結構域;或者
[0017] 所述第一靶向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含）或由其組成：源自FGFR 免疫球蛋白樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和FGFR1第 三免疫球蛋白樣結構域，以及所述第二靶向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含)或 由其組成:VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域。
[0018] 特別地，本發明的融合蛋白中所述的源自FGFR免疫球蛋白樣結構域中間功能性序 列區的部分之氨基酸序列對應于SEQ ID N0:3中起點為選自第119至151位的氨基酸至終點 為第162位氨基酸的氨基酸序列，優選為SEQ ID N0:3第134至162位、145至162位、148至162 位、149至162位或151至162位所示的氨基酸序列，更優選為SEQ ID N0:3第148至162位所示 的氨基酸序列。
[0019] 在另一些具體實施方案中，所述VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID NO: 1第151至214位相對應的氨基酸序列;所述VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域具有:與SEQ ID NO:2第224至320位相對應的氨基酸序列；所述FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域具有：與 SEQ ID N0:3第163至247位相對應的氨基酸序列；和所述FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域具 有:與SEQ ID N0:3第270至359位相對應的氨基酸序列。
[0020] 在一些實施方案中，本發明的融合蛋白具有抑制血管新生的活性。
[0021] 在另一些實施方案中，相比于Fc區在融合蛋白之C端的融合蛋白，本發明的融合蛋 白表現出提高的穩定性和/或提高的活性。例如，相比于Fc區在融合蛋白之C端的融合蛋白， 本發明的融合蛋白表現出穩定性提高至少10 %、20 %、30 %、40 %、或50 %和/或活性提高至 少 10%、20%、30%、40%、或 50%。
[0022] 在一些特定的實施方案中，本發明的融合蛋白包含或由其組成：
[0023] (l)SEQ ID N0:6、8、10和12中任一項所示氨基酸序列，或由SEQ ID N0:7、9、ll和 13中任一項所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列；
[0024] (2)與SEQ ID N0:6、8、10和12中任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基 酸序列，優選地至少80 %、90 %、93 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性;或者 [0025] (3)由與SEQ ID N0:7、9、ll和13中任一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核 苷酸序列所編碼的氨基酸序列，優選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一 性。
[0026] 在另一個方面，本發明提供了編碼本發明融合蛋白的分離的核酸分子。
[0027] 在另一個方面，本發明提供了包含本發明核酸分子的載體。
[0028] 在又一個方面，本發明提供了用本發明的載體轉染的細胞，優選CH0細胞。
[0029] 在又一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本發明的融合蛋白，以及可 藥用載體。
[0030] 在又一個方面，本發明提供了根據本發明的融合蛋白或藥物組合物在制備用于在 哺乳動物中抑制血管新生的藥物中的用途。
[0031] 在又一個方面，本發明提供了根據本發明的融合蛋白或藥物組合物在制備用于治 療或預防腫瘤和/或眼科血管新生性疾病的藥物中的用途，優選地所述腫瘤是實體瘤，所述 眼科血管新生性疾病選自年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜病變等。
[0032] 在又一個方面，本發明提供了根據本發明的融合蛋白或藥物組合物，其用于治療 或預防腫瘤和/或眼科血管新生性疾病的藥物中，優選地所述腫瘤是實體瘤，所述眼科血管 新生性疾病選自年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜病變等。
[0033] 在又一個方面，本發明提供了治療或預防腫瘤和/或眼科血管新生性疾病的方法， 其包括向有此需要的對象施用治療有效量的根據本發明的融合蛋白或藥物組合物。優選地 所述腫瘤是實體瘤，所述眼科血管新生性疾病選自年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜 病變等。
[0034] 本發明涉及一種雙靶標融合蛋白，其包含三個結構域，第一靶向結合域、中間橋連 結構域、第二靶向結合域。
[0035]在一些實施方案中，所述第一靶向結構域為衍生自VEGFR胞外區的部分或衍生自 FGFR胞外區的部分，第二靶向結合域為衍生自FGFR胞外區的部分或衍生自VEGFR胞外區的 部分。
[0036] 特別地，所述衍生自VEGFR胞外區的部分包括VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3的胞外 區部分。
[0037] 特別地，所述衍生自FGFR胞外區的部分包括FGFR1和/或FGFR2和/或FGFR3和/或 FGFR4的胞外區部分。
[0038] 在又一些實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區的部分包含選自下列的一項或多 項或者由其組成:VEGFR的第一免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR的第二免疫球蛋白 樣結構域或其一部分、VEGFR的第三免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR的第四免疫球 蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR的第五免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR的第六免 疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR的第七免疫球蛋白樣結構域或其一部分。
[0039]在又一些實施方案中，所述衍生自FGFR胞外區的部分包含選自下列的一項或多項 或者由其組成:FGFR的第一免疫球蛋白樣結構域或其一部分、源自FGFR免疫球蛋白樣結構 域中間功能性序列區的部分、FGFR第二免疫球蛋白樣結構域或其一部分、FGFR第三免疫球 蛋白樣結構域或其一部分。特別地，本發明的融合蛋白所包含的結構域和/或區段等之間可 以直接連接和/或通過接頭連接，在一個具體實施方案中，本發明的融合蛋白包含所述源自 FGFR免疫球蛋白樣結構域中間功能性序列區的部分，優選地，所述源自FGFR免疫球蛋白樣 結構域中間功能性序列區的部分不包括酸性盒(acidic box，AB)。
[0040] 具體地，所述衍生自VEGFR胞外區的部分包括VEGFR1和/或VEGFR2的第二免疫球蛋 白樣結構域和VEGFR1和/或VEGFR2的第三免疫球蛋白樣結構域。更具體地，所述衍生自 VEGFR胞外區的部分包括VEGFR1的第二免疫球蛋白樣結構域和VEGFR2的第三免疫球蛋白樣 結構域。
[0041 ]在一個實施方案中，本發明所述的VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID NO: 1第151至214位相對應的氨基酸序列，本發明所述的VEGFR1第三免疫球蛋白樣結構 域具有:與SEQ ID NO: 1第230至327位相對應的氨基酸序列。
[0042]在一個實施方案中，本發明所述的VEGFR2第二免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID N0:2第141至207位相對應的氨基酸序列，本發明所述的VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構 域具有:與SEQ ID N0:2第224至320位相對應的氨基酸序列。
[0043]在一些具體實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區部分還包括VEGFR1的第一免疫 球蛋白樣結構域。優選地，所述VEGFR1的第一免疫球蛋白樣結構域具有與SEQ ID NO: 1第32 到123位相對應的氨基酸序列，或者具有與SEQ ID NO: 1第32到123位的氨基酸序列有至少 70%同一性，優選地至少80%、90%、93%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列。
[0044]在一些實施方案中，所述衍生自FGFR胞外區部分包括FGFR1第二Ig樣結構域或其 一部分、第三免疫球蛋白樣結構域或其一部分、以及源自FGFR免疫球蛋白樣結構域中間功 能性序列區的部分。
[0045]在一些實施方案中，本發明的融合蛋白中所述的源自FGFR免疫球蛋白樣結構域中 間功能性序列區的部分之氨基酸序列對應于SEQ ID N0:3中起點為選自第119至151位的氨 基酸至終點為第162位氨基酸的氨基酸序列，優選為SEQ ID N0:3第134至162位、145至162 位、148至162位、149至162位或151至162位所示的氨基酸序列，更優選為SEQ ID N0:3第148 至162位所示的氨基酸序列。
[0046]在另一些實施方案中，所述的FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域具有與SEQ ID N0:3 第163至247位相對應的氨基酸序列，所述的FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域具有與SEQ ID NO: 3第270至359位相對應的氨基酸序列。
[0047]更具體地，衍生自FGFR胞外區部分還包括FGFR1的第一 Ig樣結構域或一部分。其中 所述FGFR1的第一免疫球蛋白樣結構域具有與SEQ ID N0:3第40至118位相對應的氨基酸序 列，或者與SEQ ID N0:3第40至118位的氨基酸序列有至少70%同一性，優選地至少為80%、 90%、93%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列。
[0048]在又一個實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區的部分為圖3 VR M1-M5所示的氨 基酸序列，或者與圖3VR M1-M5所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。 [0049]在又一個實施方案中，所述衍生自FGFR胞外區的部分為圖4 FR M1-M10所示的氨 基酸序列，或者與圖4FR M1-M10所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。 [0050] 中間橋連結構域
[0051 ]在本發明的一些實施方案中，所述中間橋連結構域包括免疫球蛋白結構域、亮氨 酸拉鏈(Leucine zipper)等。特別地，所述免疫球蛋白結構域為免疫球蛋白Fc結構域，優選 人IgG Fc區，更優選地是人IgG 1的Fc區，再優選地其具有:與SEQ ID N0:4相對應的氨基酸 序列，或者與SEQ ID N0:4的氨基酸序列有至少70%同一性，優選地至少80%、90%、93%、 95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者與SEQ ID N0:5相對應的核苷酸序列所 編碼的氨基酸序列，或者與SEQ ID N0:5的核苷酸序列有至少70%同一性，優選地至少 80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
[0052] 接頭
[0053]在一些實施方案中，所述第一靶向結合域、所述第二靶向結合域直接或通過接頭 融合到所述中間橋連結構域的N端或C端。
[0054]在本發明的一些具體實施方案中，本發明的融合蛋白從N端到C端可包含:第一靶 向結合域-接頭-中間橋連結構域-第二靶向結合域，第一靶向結合域一中間橋連結構域-接 頭-第二靶向結合域，第一靶向結合域-接頭-中間橋連結構域-接頭-第二靶向結合域，或者 第一靶向結合域一中間橋連結構域-第二靶向結合域。
[0055] 在一些實施方案中，所述接頭為短肽接頭，例如可選自：GS、PPP、SGGGGSE、DKTHTS、 (GGGGS)η(其中η為 1-19)、AAAGSGGASAS、AAAGS、GXaaGGGSGASAS(其中Xaa為任意氨基酸）、 AAAGSGXaaSGASAS(其中Xaa為任意氨基酸）、ASGGGGSGGGGA、GGGGSGGGGA、ASGA、和GGGGGG。優 選地，所述接頭可選自：ASGGGGSGGGGA、（GGGGS)n(其中 n 為1-19,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或其任意區間）、666656666厶、厶56厶和666666。
[0056]本發明人出人意料地發現，僅僅通過調整靶向結合域與中間橋連結構域(例如Fc 區）的順序，就出人意料地使得本發明的融合蛋白在穩定性和結合親和力方面得到了顯著 的改善。具體地，本發明的融合蛋白在37°C放置15天后，純度下降不超過1.5%，與對照下降 了約12 %相比，穩定性有意料不到的改善。
【附圖說明】：
[0057]圖1 ELISA法測融合蛋白與FGF-2的結合能力。
[0058]圖2融合蛋白的VEGF端細胞活性測定結果。
[0059]圖3所示為VEGFR胞外區M1-M5的氨基酸序列。"......"表示與Ml所示序列一致， 表示不含該序列。
[0060]圖4所示為FGFR胞外區M1-M10的氨基酸序列。"......"表示與Ml所示序列一致， 表示不含該序列。
[0061 ]圖5所示為SDS-PAGE法測S1融合蛋白的穩定性。
【具體實施方式】
[0062] 定義：
[0063] 除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同 含義。關于本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標 準3字母和/或1字母代碼。特別地，本文所使用術語的含義還可參見中國專利申請 201110131029.X。
[0064] 盡管本發明的廣義范圍所示的數字范圍和參數近似值，但是具體實施例中所示的 數值盡可能準確的進行記載。然而，任何數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自 的測量中存在的標準偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應理解為涵蓋其中包含的任何 和所有子范圍。例如記載的"1至10"的范圍應認為包含最小值1和最大值10之間（包含端點） 的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子范圍，例如1至6.1，以及以 最大值10或更小終止的子范圍，例如5.5至10。另外，任何稱為"并入本文"的參考文獻應理 解為以其整體并入。
[0065] 另外應注意，如本說明書中所使用的，單數形式包括其所指對象的復數形式，除非 清楚且明確的限于一個所指對象。術語"或"可與術語"和/或"互換使用，除非上下文另有清 楚指明。
[0066]本文使用的術語"Fc"、"Fc區"、"Fc片段"或"免疫球蛋白Fc區"等表示免疫球蛋白 的可結晶片段，在本發明中，所述Fc區優選人IgGl的Fc區。
[0067]本文使用的術語"可溶性"蛋白是指在生物學相關的溫度、pH水平和滲透壓下可溶 于水溶液的蛋白。在某些實施方案中，本發明的融合蛋白是可溶性蛋白。本文使用的"可溶 性融合蛋白"表示該融合蛋白不包含跨膜區和胞內區。
[0068]如本文所用，術語"分離的"是指以下物質和/或實體，（1)與起初產生時(在天然環 境中和/或在試驗設置中）和其相關聯的至少一些組分相分離和/或(2)通過人工生產、制備 和/或制造。分離的物質和/或實體可與至少約10 %、約20%、約30%、約40 %、約50%、約 60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%、基本100%或100%的其初始相關聯 的其他組分相分離。在某些實施方案中，本發明的融合蛋白是分離的融合蛋白。
[0069]術語"部分"和"片段"可互換的指代多肽、核酸或其它分子構建物的一部分。
[0070]本文使用的術語"Ig樣結構域"或者"免疫球蛋白樣結構域"可互換使用，其表示本 發明的蛋白中與免疫球蛋白結構類似的結構域。所述Ig樣結構域可見于多種蛋白質家族， 參與多種生物學功能，包括細胞-細胞識別、細胞表面受體、免疫功能等等。
[0071] 本文使用的術語"FGFR"表示成纖維細胞生長因子受體，其可以是FGFR1、FGFR2、 FGFR3和/或FGFR4。優選地，本發明中的FGFR是FGFR1，更優選人FGFR1。例如"FGFR1"表示成 纖維細胞生長因子受體1。
[0072]本文使用的術語"FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區"或"FGFR Ig樣結構域中間 功能性序列"或"IFS"表示FGFR蛋白中第一Ig樣結構域和第二Ig樣結構域之間的序列。優選 地，IFS序列具有對應于SEQ ID N0:3第119至162位的氨基酸序列。本發明人出乎意料地發 現，所述中間功能性序列區對于Ig樣結構域的功能具有顯著的影響。在一些實施方案中，本 發明提供了FGFR融合蛋白，其包含多種不同長度的源自所述中間功能性序列區的部分，特 別優選地源自所述中間功能性序列區的部分不包含酸性盒。更優選地，所述源自IFS的部分 具有與SEQ ID N0:3第134至162位、145至162位、148至162位、149至162位或151至162位對 應的氨基酸序列。所述FGFR蛋白優選FGFR1(SEQ ID從):3)，特別是人?6?1?1蛋白。
[0073] 本文使用的術語"酸性盒(acidic box)"表示在上述IFS中由8個酸性氨基酸組成 的區段，即序列為EDDDDDDD的區段。具體地，其為FGFR1 (SEQ ID N0:3)的127到133位序列。
[0074] 本文所使用的術語"對象"是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如家養動 物(如狗、貓等），家畜(如牛、羊、豬、馬等)或實驗動物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等）。
[0075] 本文使用的術語"一致性"、"百分比一致性"、"同源性"或"同一性"指兩個氨基酸 序列之間或者核酸序列之間的序列同一性。可以通過比對兩個序列來確定百分比一致性， 百分比一致性指所比較的序列共有位置相同殘基（即氨基酸或核苷酸)的數量。可使用本領 域的標準算法（例如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl .Math· 2:482;Needleman和Wunsch， 1970，J.MoI.Biol.48:443;Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad·Sci·，USA，85:2444) 或者通過這些算法的計算機化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，WI)進行序列比對和比較， 所述計算機化版本公開可用為BLAST和FASTA。另外，通過美國國家衛生研究院（Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比較。當使用BLAST和缺口BLAST程序時，可使用各個程序(例 如BLASTN，在美國國家生物技術信息中心的因特網站點上可用）的缺省參數。在一個實施方 案中，可使用缺口權重為1的GCG來確定兩個序列的百分比同一性，使得每個氨基酸缺口給 予權重如同它是兩個序列間的單氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序（2.0版），其是GCG (Aceelrys，San Diego，CA)序列比對軟件包的一部分。
[0076]下面給出hFGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結構域，可參見http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH15035.1
[0077] MffSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEYES
[0078] FGFR1的氨基酸序列可參見SEQ ID N0:3。
[0079] 本文使用的術語"VEGFR"表示血管內皮細胞生長因子受體，其可以是VEGFR1、 VEGFR2和/或VEGFR3。優選地，本發明中的VEGFR是VEGFR1和/或VEGFR2,優選人的VEGFR。例 如"VEGFR1"表示血管內皮細胞生長因子受體1。
[0080] 下面給出hVEGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結構域，各結構域之間 為天然連接序列。hVEGFRl 的具體序列可參見 http: //www · uniprot · org/uniprot/P17948:
[0082] VEGFR1的氨基酸序列可參見SEQ ID N0:1。
[0083] 下面給出hVEGFR2的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結構域，各結構域之間 為天然連接序列。hVEGFR2的具體序列可參見http: //www · uniprot · org/uniprot/P35968
[0084]

[0085] VEGFR2的氨基酸序列可參見SEQ ID N0:2。
[0086] 本文使用的術語融合蛋白或部分或結構域"與SEQ ID Ν0:Ν對應的氨基酸序列"表 示，所述融合蛋白或部分或結構域具有基本上如SEQ ID Ν0:Ν所示的氨基酸序列，優選地其 中含有不超過1、2、3、4、5、10或20個氨基酸替換、添加或缺失，又優選地所述融合蛋白或部 分或結構域具有與SEQ ID勵4所示氨基酸序列至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99%的同一性，更優選地，所述融合蛋白或部分或結構域具有SEQ ID N04所示氨基酸序 列。
[0087] 本發明的所述的"接頭"可以是本文公開的任意融合蛋白的成分的接頭。在一些實 施方案中，該接頭用在第一靶向結合域和橋連結構域之間或第二靶向結合域和橋連結構域 之間。在一些實施方案中，融合多肽包含至少一個接頭，但不超過兩個接頭，例如，融合多肽 可以從N端到C端按以下順序排列：1)第一靶向結合域-接頭-橋連結構域-第二靶向結合域； 2)第一靶向結合域-接頭-橋連結構域-接頭-第二靶向結合域;3)第一靶向結合域-橋連結 構域-接頭-第二靶向結合域。
[0088] 在所述方法的一些實施方案中，可一起（同時)或在不同時間（依次地)施用一種或 多種VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。另外，所述融合蛋白可與另一類治療癌癥或抑制血管新生的 藥物一起施用。
[0089] 在一些實施方案中，本公開的主題方法可單獨使用。或者，可將所述主題方法與其 它用于治療或預防增殖性疾病(例如腫瘤）的常規抗癌治療法組合使用。例如，這些方法可 用于預防癌癥、預防癌癥復發和手術后轉移，以及作為其它癌癥治療的輔助手段。本公開表 明，可通過使用目標多肽治療劑來增強常規癌癥治療(例如，化療、放療、光療、免疫療法和 手術)的有效性。
[0090] 施用
[0091 ]本發明中的融合蛋白可以單獨施用，但優選地作為藥物組合物施用，其通常包括 根據施用的計劃方式所選的適合的藥物賦形劑、稀釋劑或載體。融合蛋白可以通過任何適 合的方式適用于需要治療的患者。精確的計量將取決于多個因素，包括該融合蛋白精確的 性質。
[0092] -些合適的使用方式包括(但不限于）口服、直腸、鼻部、局部(包括口腔和舌下）、 皮下、陰道或胃腸外的(包括皮下、肌肉、靜脈、皮內、鞘內和硬腦膜外)施用。
[0093]對于靜脈注射和在病痛位置的注射，活性成分將為一種胃腸外接受的水溶液形 式，其不含熱源并具有合適的pH值、等張性和穩定性。
[0094] 本領域中相關技術人員可使用適當的溶劑或制劑配制融合蛋白，例如：等張賦形 劑如氯化鈉注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根據要求，可以加入防腐劑、穩定 劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它一些添加劑。口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉 劑或口服液等形式。片劑可以包括固體載體，如明膠或輔劑。液體藥物組合物通常包括液體 載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。也可以包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其 它糖溶液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0095] 以上所提到的技術和方案的例子以及其它一些根據本發明所使用的技術和方案 可以在Remingtor/s Pharmaceutical Sciences，16th edition，0slo，A.(ed)，1980.中找 到。
[0096] 實施例1雙靶標融合蛋白重組表達質粒的構建
[0097] 1 ·制備VEGFR和FGFR的DNA片段
[0098] VEGF受體和FGF受體cDNA片段通過合成而獲得（由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成），序列見SEQ ID N0:14，SEQ IN勵：16。合成的〇0嫩片段是直接合成至?1^57-載體上 (所述載體可購自南京金斯瑞生物科技有限公司）。
[0099] 2 ·制備長接頭Fc的DNA片段
[0100]合成Fc-cDNA序列，所合成的Fc前后均帶有接頭（由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成），其合成至載體HX1上(所述載體可購自南京金斯瑞生物科技有限公司），從而得到帶 有長接頭的Fc DNA片段，在本文中也被稱為Fc long。具體地，前后接頭分別為： ASGGGGSGGGGA和GGGGSGGGGAJc的cDNA序列參見SEQ ID N0:5。
[0101] 3.制備短接頭Fc的DNA片段
[0102] 以Fc long為模板，設置不同的引物進行PCR擴增可獲得帶有不同接頭的Fc片段， 從而構建出帶有不同接頭的中間橋連結構域。
[0103] 以合成的Fc long為模板，使用下表1中所示引物(如SEQ ID N0:18和19所示)進行 PCR擴增，從而得到短接頭Fc的DNA序列，即-ASGA-Fc-ASGA-片段，其在本文中也被稱為Fc short。
[0104] 表1
[0105]

[0106] PCR擴增的條件為:98°C預變性5min，98°C變性15s，然后于72°C退火lmin，72°C延 伸5min，共進行32個循環。擴增完成后，使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司）純化回 收PCR擴增片段。用Nhel/Nael同時酶切PCR產物和HX1表達載體，置37°C進行酶切反應1小時 以上，使用QIAquick膠提取試劑盒(QIAGEN公司）回收目的片段。將回收的目的片段使用連 接酶(New England BioLabs)于室溫連接1小時，將連接產物通過熱激轉化的方法轉入大腸 桿菌感受態細胞中。挑菌進行DNA測序驗證，證實得到了上述片段。
[0107] 4.引入第一靶向結合域
[0108] 將第3步獲得的質粒與第1步合成的PUC57-FGFR或者PUC57-FltKdr(即，VEGFR)同 時用Nhel和BSPQI進行酶切。酶切體系為質粒lyg/μL 40yl，10Xcutsmart 5yl，NheI-HF 1.5 μL，加水至50μ1，置37°C進行酶切反應1小時以上，再加1.5μ1的BSPQI反應1小時以上。用1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行分離純化，并用QIAquick膠提取試劑盒(QIAGEN公司）回收目的片 段。將回收的目的片段使用連接酶(New England BioLabs)于室溫連接1小時，將連接產物 通過熱擊轉化的方法轉入大腸桿菌感受態中。挑菌進行DNA測序驗證，證實得到了Fc分別與 FGFR或者VEGFR相連的片段。
[0109] 5.引入第二靶向結合域
[0110] 以HJC57-FGFR，PUC57-FltKdr為模板，使用下表中所示引物（如SEQ ID N0:20、21、 22和23所示），進行PCR擴增，PCR引物中引入了酶切位點，PspoMI和Nael。
[0111] 表2
[0112]
[0113] PCR反應條件與第3步相同。PCR反應完成后，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進行分離純 化，并用QIAquick膠提取試劑盒(QIAGEN公司）回收目的片段。
[0114] 使用內切酶PspoMI和Nael同時酶切PCR反應產物和上一步獲得的質粒，于室溫反 應lh，跑膠純化，并用QIAquick膠提取試劑盒(QIAGEN公司）回收目的片段。將回收的目的片 段使用連接酶(New England BioLabs)于室溫連接1小時，將連接產物通過熱擊轉化的方法 轉入大腸桿菌感受態中。挑菌進行DNA測序驗證，證實得到了Fc的兩端分別與FGFR或者 VEGFR相連的片段。
[0115] 根據以上方法分別構建得到融合蛋白31，52,53,54，其所對應的氨基酸序列和核 苷酸序列見下表3a，其結構如表3b所示。
[0116] 表3a融合蛋白對應的序列
[0117]
[0118]
[0119] 表3b融合蛋白的結構
[0120]
[0121] 實施例2融合蛋白的瞬時表達
[0122] 用MAX質粒提純試劑盒(QIAGEN)提純相應融合蛋白質粒DNA，用紫外分光光度計確 定質粒DNA的濃度，將重組質粒lyg和6yL脂質體(FuGENE 6 Transfection Reagent，Roche 公司）于100yL新鮮頂DM培養液(GIBC0公司）中混勻，靜置15分鐘后加入按細胞密度3 X 105/ mL接種于6孔板過夜培養的CH0細胞(ATCC)中，細胞完全培養液含88%MDM、10%的FBS、1 % HT和1 %谷氨酰胺（均為GIBC0公司產品），于37°C，5%⑶2培養箱中培養48小時后收集上清， 用人IgG ELISA蛋白定量試劑盒(BETHYL公司）確定CH0分泌表達融合蛋白的相對含量。 [0123]實施例3融合蛋白的結合親和力測定
[0124] 使用ELISA法檢測以上構建的融合蛋白與VEGF和FGF-2的結合能力。用20ng/孔的 VEGF或50ng/孔FGF-2包板，100μ1/孔，2-8°C過夜。洗板機洗板3次。3 % BSA-PBST溶液封閉， 37度2h。洗板機洗板3次。加樣：用PBST溶液稀釋標線從10000ng/ml(VEGF包板時）或 50000ng/ml (FGF包板時)起梯度稀釋9個點，100μ1/孔，37度lh。洗板機洗板3次。用PBST溶液 稀釋二抗（Goat anti-human IgG-Fc-HRP)5000倍，。加入TMB顯色液顯色，室溫避光顯色 5min。用2M H2S〇4終止試驗，450nm酶標儀讀取光密度吸收值。其中，以VEGFR-FGFR-Fc融合蛋 白構建體作為對照，即中國專利CN102219859B中的#28構建體。
[0125] 本發明的融合蛋白與VEGF的結合能力見下表5。結果顯示，本發明的融合蛋白與 VEGF的結合能力均顯著好于對照。
[0126] 表5與VEGF的結合能力
[0127]
[0128] 本發明融合蛋白與FGF-2的結合能力見下表6及圖1。由結果可知，本發明的融合蛋 白SI、S3與FGF-2的結合能力均好于對照(#28構建體）。
[0129] 表6與FGF-2的結合能力
[0130]
[0131] 實施例4融合蛋白的細胞活性試驗
[0132] 人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)分裂試驗檢驗融合蛋白抑制血管內皮細胞的分 裂能力。
[0133] 使用HUVEC完全培養基(購自上海澳賽爾斯生物技術有限公司）于37°C，5%C02培 養箱中培養HUVEC細胞(購自上海澳賽爾斯生物技術有限公司）至細胞對數生長期。用胰酶 消化計數HUVEC細胞，將HUVEC細胞懸液分別用含VEGF 40ng/mL稀釋至70000個/mL。將稀釋 好的細胞懸液以每孔l〇〇yL加入到96孔板中（每孔細胞數為7000個）。37°〇、0)2培養箱孵育 過夜。
[0134] 按下表7中的藥物濃度進行稀釋，以lOOyL/孔的量加入到96孔板中，每個濃度3個 復孔，設置空白對照(加等量培養基）。置于37°C二氧化碳恒溫培養箱中培養72h。藥物作用 72h后，加入含CCK-810 %的無血清1640培養基(D0JIND0公司）100μL7孔。37°C、C02培養箱孵 育lh，使用酶標儀測450nm處0D值。根據吸光度的差異確定融合蛋白抑制VEGF或FGF-2誘導 的血管內皮細胞分裂的能力。
[0135] 表7 VEGF端測活藥物加樣濃度梯度
[0136]
[0137] 結果見圖2，S3VEGF端的細胞活性要明顯高于對照。
[0138] 實施例5融合蛋白的穩定性試驗
[0139] a)HPLC 法檢測
[0140] 將制備好的樣品放置在37°C中進行加速穩定性試驗，分別加速0天、1天、3天、7天、 15天，加速樣品取出后置于_80°C保存待檢。然后用HPLC(安捷倫1200液相色譜儀)檢測融合 蛋白的純度，色譜柱為TSK-G3000。
[0141] 具體操作步驟如下：1)流動相配制20mM磷酸鈉溶液，0.3M NaCl，pH6.8，0.45μπι微 孔過濾膜濾過，待用。2)樣品準備樣品稀釋至lmg/mL，上樣量25μΜ3)色譜條件見表8,按峰 面積歸一化法進行計算，結果見下表9。
[0142] 表8 HPLC色譜條件
[0143]
[0144] 表9 HPLC法測得的樣品純度
[0145]
[0146] 由表9可知，對照樣品37°C放置15天后，純度下降非常明顯。不論是下降幅度還是 最終純度，本發明的融合蛋白均顯著優于對照。具體地，對照的純度下降了12.3%(95%_ 82.7% = 12.3%)，而本發明制備的樣品S1-S4在37°C放置15天后，純度下降非常輕微，僅為 約0.5%-1.5%。由此可知，本發明制備的樣品穩定性得到了極大的改善。
[0147] b)SDS_PAGE 法檢測
[0148] 將制備好的S1樣品與對照樣品同時放在-80°c、4°C、25°C、37°C中進行加速，14天 后取出，SDS-PAGE法檢測。檢測結果見圖5。
[0149] 由圖5可知，S1樣品明顯比對照樣品穩定，降解條帶少，特別是在25°C、37°C放置14 天后，對照樣品降解非常明顯，而S1樣品仍非常穩定，幾乎無降解。由此可知，本發明制備的 S1樣品穩定性得到了極大的改善。
[0150] 本發明已通過各個具體實施例作了舉例說明。但是，本領域普通技術人員能夠理 解，本發明并不限于各個【具體實施方式】，普通技術人員在本發明的范圍內可以作出各種改 動或變型，并且在本說明書中各處提及的各個技術特征可以相互組合，而仍不背離本發明 的精神和范圍。這樣的改動和變型均在本發明的范圍之內。
[0151] 參考文獻
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[0154] [3]Ferrara N.Vascular endothelial growth factor as a target for anticancer therapy.Oncologist.2004?1：2-10.
【主權項】
1. 雙特異性融合蛋白，其從N端到C端依次包含:特異性結合血管新生因子的第一靶向 結合域、中間橋連結構域和特異性結合血管新生因子的第二靶向結合域，其中 所述第一靶向結合域包含:一個或更多個VEGF受體或FGF受體的免疫球蛋白樣結構域； 所述中間橋連結構域為免疫球蛋白Fc區；和 所述第二靶向結合域包含:一個或更多個VEGF受體或FGF受體的免疫球蛋白樣結構域。2. 權利要求1的融合蛋白，其中所述一個或更多個VEGF受體的免疫球蛋白樣結構域獨 立地選自：VEGFR1或VEGFR2的第一免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二 免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域或其一部分、 VEGFR1或VEGFR2第四免疫球蛋白樣結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五免疫球蛋白樣 結構域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六免疫球蛋白樣結構域或其一部分、和VEGFR1或 VEGFR2第七免疫球蛋白樣結構域或其一部分。3. 權利要求1的融合蛋白，其中所述一個或更多個FGF受體的免疫球蛋白樣結構域獨立 地選自：FGFR1第一免疫球蛋白樣結構域或其一部分、FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域或其 一部分和FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域或其一部分。4. 權利要求1的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc區是人I gG 1 Fc區。5. 權利要求1-4中任一項的融合蛋白，其中 所述第一靶向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含）：VEGFR1第二免疫球蛋白樣 結構域和VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域，以及所述第二靶向結合域包含(優選地，從N端 至丨JC端依次包含）：FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域； 或者 所述第一靶向結合域包含(優選地，從N端到C端依次包含）：FGFR1第二免疫球蛋白樣結 構域和FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域，以及所述第二靶向結合域包含(優選地，從N端到C 端依次包含）:VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域和VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域。6. 權利要求5的融合蛋白，其中： 所述VEGFR1第二免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID NO: 1第151至214位相對應的氨 基酸序列， 所述VEGFR2第三免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID NO:2第224至320位相對應的氨 基酸序列， 所述FGFR1第二免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID NO:3第163至247位相對應的氨基 酸序列，和 所述FGFR1第三免疫球蛋白樣結構域具有：與SEQ ID NO:3第270至359位相對應的氨基 酸序列。7. 前述任一項權利要求的融合蛋白，所述蛋白具有抑制血管新生的活性。8. 前述任一項權利要求的融合蛋白，所述蛋白包含或由其組成： (1) SEQ ID N0:6、8、10和12中任一項所示氨基酸序列，或由SEQ ID N0:7、9、ll和13中 任一項所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列； (2) 與SEQ ID N0:6、8、10和12中任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序 列，優選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性;或者 (3) 由與SEQ ID N0:7、9、ll和13中任一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸 序列所編碼的氨基酸序列，優選地至少80 %、90 %、93 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性。9. 編碼前述任一項權利要求的融合蛋白的分離的核酸分子。10. 包含權利要求9的核酸分子的載體。11. 用權利要求10的載體轉染的細胞，優選CHO細胞。12. -種藥物組合物，其包含權利要求1-8中任一項的融合蛋白，以及可藥用載體。13. 權利要求1-8中任一項的融合蛋白或權利要求12的藥物組合物在制備用于在哺乳 動物中抑制血管新生的藥物中的用途。14. 權利要求1-8中任一項的融合蛋白或權利要求12的藥物組合物在制備用于治療或 預防腫瘤和/或眼科血管新生性疾病的藥物中的用途，優選地所述腫瘤是實體瘤，所述眼科 血管新生性疾病選自年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜病變等。
【文檔編號】C07K16/46GK106084062SQ201610144347
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年3月14日 公開號201610144347.2, CN 106084062 A, CN 106084062A, CN 201610144347, CN-A-106084062, CN106084062 A, CN106084062A, CN201610144347, CN201610144347.2
【發明人】房健民, 姜靜, 李偉偉
【申請人】煙臺榮昌生物工程有限公司