一種抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv?C27及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv?C27及其應用。所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其編碼基因序列如SEQ ID NO.6所示。本發明成功構建了T1D scFv噬菌體庫，篩選并鑒定了ZnT8特異性scFv，該ZnT8特異性scFv可用于1型糖尿病診斷、治療和/或預后判斷試劑的制備。
【專利說明】
一種抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體SCFV-C27及其應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27及其應用。
【背景技術】
[0002] 鋅轉運體(ΖηΤ)是一組將鋅離子由胞內轉運出胞外的跨膜蛋白，與ZIP家族蛋白共 同維護細胞內外鋅離子的平衡。2004年，Cheimienti等首次在ΖηΤ家族中發現ZnT8蛋白，它 由SLC30A8基因編碼，高度特異的表達在胰腺中，后進一步研究發現ΖηΤ8特異的表達在胰島 β細胞上，在INS-1細胞中過表達ΖηΤ8可促使鋅離子的聚集并增強糖刺激后的胰島素釋放。 這些研究表明ΖηΤ8在胰島素的合成和分泌中發揮重要作用。
[0003] 1型糖尿病(T1D)是由Τ淋巴細胞介導，以選擇性破壞胰島辟田胞為特征的器官特異 性自身免疫性疾病。胰島β細胞上存在著多種自身抗原，如胰島素，谷氨酸脫羧酶(GAD)，酪 氨酸磷酸酶和ZnT8。其中，ZnT8被認為是T1DM的一個重要的自身抗原，Wenzlau等發現部分 T1D高危患者發病前2年即可檢測到ZnT8自身抗體且長期維持在較高水平。我們前期研究發 現ΖηΤ8存在著多個抗原表位可被1型糖尿病患者自身反應性Τ細胞識別，且ΖηΤ8抗體水平與 T1D的發展存在著顯著相關性。早期檢測ΖηΤ8抗體和ΖηΤ8特異性CD8+T細胞是預測和診斷 T1D的重要手段。針對ΖηΤ8靶點的特異性治療將成為阻止T1D進展的潛在方法。
[0004] 抗體研究迄今已有100多年歷史，1975年Kohler和Mi lstein創立Β淋巴細胞雜交瘤 技術，鼠源單克隆抗體被廣泛應用于疾病的診斷和治療，但由于鼠源單克隆抗體對人體有 免疫原性，易產生人抗鼠抗體反應(human anti-mouse antibody，HAMA和超敏反應，且由于 其分子量較大，難以穿膜等缺點，限制了其在疾病治療領域的應用。自20世紀八十年代中 期，隨著分子生物學的技術進展，國外學者建立了噬菌體抗體庫技術。由于噬菌體表達的 scFv抗體分子量較小，僅為完整抗體分子的六分之一，且具有較好的血管或組織屏障穿透 性、半衰期短、結構穩定、不含Fc段，減少了與體內Fc受體結合而帶來的不利影響等優勢，已 廣泛地應用于分子生物學及免疫學、藥理學等醫學領域，是目前的研究熱點。但目前尚未見 抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體的相關報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種抗1型糖尿病ΖηΤ8特異性單 鏈抗體。
[0006] 本發明的另一目的是提供該單鏈抗體的應用。
[0007] 本發明的目的可通過以下技術方案實現：
[0008] 抗1型糖尿病ΖηΤ8特異性單鏈抗體scFv_C27，包括重鏈和輕鏈，
[0009] 所述的輕鏈的可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0010] 所述的重鏈的可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體的氨基酸序列優選如SEQ ID NO.5所示。
[0012] 一種編碼本發明所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體SCFV-C27的基因，其中，
[0013] 編碼輕鏈的可變區的基因序列如SEQ ID N0.3所示；
[0014] 編碼重鏈的可變區的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015] 編碼本發明所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27的基因的核苷酸序 列優選如SEQ ID N0.6所示。
[0016] 本發明所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27在制備1型糖尿病診斷、 治療和/或預后判斷試劑中的應用。
[0017]本發明所述的編碼編碼權利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27的基因在制備1型糖尿病診斷、治療和/或預后判斷試劑中的應用。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發明首次從T1D病人外周血基因中構建了一個庫容達IX 108的scFv噬菌體抗體 庫。我們招募了 50例初發的T1D患者以保證庫的特異性、多樣性和代表性。從該庫中，我們可 以篩選T1D的各種自身抗體。
[0020] ZnT8抗原是T1D的重要自身抗原，具有六次跨膜結構，它由SCL30A8基因編碼，定位 于人第8號染色體q24.11上，包含8個外顯子，編碼369個氨基酸。ΖηΤ8自身抗體在T1D的發生 發展中發揮了重要作用。目前，ΖηΤ8蛋白的氨基末端（l-74aa)和羧基末端(268-369aa)被認 為是自身反應性T細胞識別的主要區域。由于ZnT8蛋白影響著胰島素的合成與分泌，所以對 其抗體作用機制的深了解對治療T1D具有重大意義。本發明成功篩選了 ΖηΤ8特異性scFv。為 保證篩選結果的多樣性，我們選擇了 ZnT8蛋白的氨基羧基融合肽進行scFv的篩選。已經有 大量報道發現T1D患者中ZnT8抗原325位氨基酸存在著點突變，由精氨酸(Arg)突變為酪氨 酸（T r p )，該位點突變與Ζ η T 8抗體的識別密切相關，Ζ η T 8羧基末端的突變二聚體 (Arg325Trp)對檢測ΖηΤ8抗體具有高度的特異性和敏感性。所以我們進一步使用ΖηΤ8羧基 末端的二聚體(Arg325Trp)鑒定了 scFv-C27,結果表明scFv-C27能與該二聚體結合。免疫組 化結果進一步顯示scFv能特異性識別胰島細胞，具有良好的生物學活性。
[0021] 本發明成功構建了T1D scFv噬菌體庫，篩選并鑒定了ZnT8特異性scFv，該ZnT8特 異性scFv可用于1型糖尿病診斷、治療和/或預后判斷試劑的制備。
【附圖說明】
[0022]圖1.重組ZnT8基因構建.M:核酸標準品；泳道1: ZnT8氨基末端基因（l-74aa)約 250bp;泳道2: ZnT8羧基末端基因（268-369aa)約350bp;泳道3: ZnT8氨基羧基融合基因（1-74aa，268-369aa)約550bp;泳道4: ΖηΤ8羧基端二聚突變體基因（Arg325Trp)約650bp。圖2 · 重組ZnT8蛋白的表達純化及鑒定.
[0023] Α:ΖηΤ8氨基羧基融合蛋白的Western blotting檢測（泳道1:蛋白純化前；泳道2: 純化后的蛋白；泳道3:流穿）；B: ZnT8氨基羧基融合蛋白的SDS-PAGE檢測(M:蛋白標準品；泳 道1:蛋白純化前；泳道2:純化后的蛋白；泳道3:流穿）；C:ZnT8羧基端二聚突變體蛋白 Western blotting檢測（泳道1:蛋白純化前;泳道2:純化后的蛋白；泳道3:流穿）；D:ZnT8羧 基端二聚突變體蛋白SDS-PAGE檢測(M:蛋白標準品；泳道1:蛋白純化前;泳道2:純化后的蛋 白；泳道3:流穿）。
[0024] ZnT8氨基羧基融合蛋白和羧基端二聚突變體蛋白分子量分別約20kD和25kD。
[0025] 圖3 .ELISA檢測氨基羧基融合蛋白與商品化ZnT8抗體的結合能力。
[0026] 圖4. T1D scFv基因擴增.Μ:核酸標準品；泳道1: VAPCR產物（~350bp);泳道2: Vk PCR產物（~350bp);泳道3: VH PCR產物（~450bp);泳道4: scFv PCR產物（~800bp)。
[0027] 圖5.scFv-C27的純化及鑒定·
[0028] A. SDS-PAGE檢測scFv(M:蛋白標準品；泳道1: scFv-C27純化前；泳道2 :純化后的 scFv_C27;泳道3: scFv_C27流穿）；B.Western blotting analyze檢測scFv(泳道 1: scFv-C27純化前;泳道2:純化后的scFv-C27;泳道3: scFv-C27流穿）。
[0029] 圖6.Western blotting檢測scFv與ZnT8氨基羧基融合蛋白的結合能力·
[0030] 泳道1 :SCFv-C27檢測ΖηΤ8氨基羧基融合蛋白；泳道2:陰性對照。
[0031] 圖7 · SCFV-C27與ΖηΤ8氨基羧基融合蛋白的親和力檢測。
[0032]圖8上1^13六檢測8〇?￥-027對21^8羧基端二聚突變體蛋白的結合能力。
[0033]圖9.免疫組化檢測scFv抗體對人胰腺組織的識別能力(Α:胰島細胞HE染色結果； B: C27檢測胰島細胞結果。行1:放大40倍;行2:放大200倍）
【具體實施方式】
[0034] 實施例1重組ZnT8原核表達質粒的構建與表達
[0035]設計引物ZF和LR(表1)，以ΖηΤ8質粒（購自北京義翹神州生物技術有限公司， HG11621-M)為模板，擴增人ΖηΤ8氨基末端（l-74aa)基因，設計引物LF和CR(表1)，以ΖηΤ8質 粒為模板，擴增人ΖηΤ8羧基末端（269-368aa)基因，，PCR產物膠回收后用引物ZF和CR通過 overlap構建氨基羧基融合基因。
[0036] 參考US9023984(B2)序列表中的SEQ ID如.55設計21^8羧基末端二聚突變體基 因，如SEQ ID No.7所示，并委托生物公司合成，該二聚體含2個人ZnT8羧基末端基因，第一 個在325為氨基酸為精氨酸(Arg)，第二個在325位為酪氨酸(Trp)，該二聚體中2個人ΖηΤ8羧 基末端基因通過一段柔性肽鏈接。設計引物CF和CR用于擴增ΖηΤ8羧基端二聚突變體基因。 [0037] 表1.引物序列
[0038]
[0039]引物ZF和LR用于擴增ΖηΤ8氨基末端基因（l-74aa)，引物LF和CR用于擴增ΖηΤ8羧基 末端基因（268-369aa)，引物ZF和CR用于overlap擴增ΖηΤ8氨基羧基融合基因，引物CF和CR 用于擴增ΖηΤ8羧基端二聚突變體基因。
[0040] 上述兩個重組基因分別經SacI和Xbal雙酶切后插入pcoldll質粒中。連接產物轉 化入大腸桿菌BL21(DE3)培養后挑選陽性克隆進行測序。將測序正確的克隆在LB培養基中 37°C擴增至D(600)值達1.0后加入IPTG誘導劑至終濃度為ImM/L，15°C誘導表達2處。4°(：，10 000Xg離心后收集菌體-80°C保存。
[0041 ]將純化的人ZnT8氨基羧基融合蛋白包被ELISA板，從1.6ug/孔倍比稀釋至0. lug/ 孔，檢測融合蛋白與商品化的ZnT8抗體結合的量效變化。
[0042] ΖηΤ8氨基羧基融合基因約550bp，羧基二聚突變體基因約650bp，PCR產物電泳結果 見圖1，均成功插入pcold Π 載體，測序結果與理論相符。
[0043]抗原經表達純化復性后電泳結果見圖2,可見純化后ZnT8氨基羧基融合肽分子量 約20kD，羧基二聚突變體分子量約25kD。
[0044] ELISA檢測顯示ZnT8氨基羧基融合蛋白能與商品化的ZnT8抗體特異性結合，可用 于ΖηΤ8特異性scFv的篩選(圖3)。
[0045] 實施例2T1D scFv噬菌體抗體庫的構建
[0046]實驗標本為50位初發的T1D志愿者的外周血。其中31位志愿者血清ZnT8抗體陽性。 血清ΖηΤ8抗體水平通過放射免疫配體法進行檢測（詳細方法參見Gu Y，Zhang Μ，Chen Η， Wang Z,Xing C,Yang H,et al.Discordant association of islet autoantibodies with high-risk hla genes in Chinese type ldiabetes.Diabetes/metabolism research and reviews 2011;27:899-905)。所有患者均簽署知情同意書。分選T1D志愿者 外周血PBMC。提取T1D志愿者外周血PBMC RNA，接著反轉錄合成cDNA，具體操作步驟按說明 書進行。通過RT-PCR方法，用人源單鏈抗體（scFv)通用引物（表2)擴增重鏈和輕鏈，通過 overlap PCR鏈接成scFv,經Sfi I酶切后插入pcomb3XSS質粒(購自BioVector NTCC保藏中 心）中。連接產物經過多次電轉化入大腸桿菌XLl-Blue(購自Stratagene，Cat · #200228)，用 SB培養基擴大培養后加輔助噬菌體VCSM13超感染。次日收集上清經PEG-8000/NaCl沉淀后 獲得T1D scFv噬菌體抗體庫。
[0047] 表2.人源scFv通用引物序列
[0048]
[0049；
[0050] 注：R = A or G Y = C or C M = A or C K = G or T S = C or G W = A or T H = A or C or T B = C or G or T V=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T
[0051] 擴增VH鏈引物組合如下：
[0058]上述經RT-PCR后成功擴增抗體重鏈及輕鏈，大小約400bp，單鏈抗體基因條帶在 750bp左右（圖4)，膠回收后插入pcomb3XSS載體中，電轉化入大腸桿菌XLl-Blue，經VCSM13 超感染后獲得噬菌體抗體庫，經檢測庫容為1 X 1〇8。
[0059] 1 · 2 · 4ZnT8 特異性 scFv 的篩選
[0060] 將純化的ZnT8氨基羧基融合蛋白按lyg/孔包被ELISA板，經過4輪的"吸附"、"洗 脫"、"擴增"后（Zhang X，Qi X，Zhang Q，Zeng X，Shi Z，Jin Q，et al.Human 4f5single_ chain fv antibody recognizing a conserved halepitope has broad neutralizing potency against h5nlinfluenza a viruses of different clades.Antiviral research 2013; 99:91-9)，phage-ELISA進行檢測。挑選0D值高的陽性克隆提取質粒并送測 序，測序結果與人類免疫球蛋白序列（IMGT數據庫）（Ehrenmann F，Kaas Q，Lefranc MP.Imgt/3dstructure~db and imgt/domaingapalign:A database and a tool for immunoglobulins or antibodies ,T cell receptors,mhc,igsf and mhcsf.Nucleic acids research 2010 ； 38 : D301-7.Lefranc MP,Giudicel1i V,Duroux P,Jabad〇-Michaloud J,Folch G,Aouinti S,et al.Imgt(r),the international immunogenetics information system(r)25years on.Nucleic acids research 2015;43:D413_22.)進行 比對并進行CDR區的劃分。
[0061] 經過4輪的篩選，ZnT8特異性scFv得以富集。每一輪噬菌體滴度見表3。將最后一輪 洗脫的噬菌體感染大腸桿菌XLl-Blue后，隨機選擇160個克隆。Phage ELISA結果顯示有23 個陽性克隆，其中有11個克隆0D值較高，經測序得至1」7株scFv。我們對這7株scFv進行了⑶R 區的劃分，均符合人源scFv抗體特征。其中，scFv-C27和C220D值最高，因此我們選擇scFv-C27進行了進一步研究。
[0062]表3. ZnT8特異性噬菌體抗體的富集
[0063]
[0064]得率（％ )=洗脫后的噬菌體密度(pfu) X 100/吸附前的噬菌體密度(pfu)
[0065] 將測序正確的陽性克隆轉化入大腸桿菌ToplOF'，挑單克隆菌落接種于含20mM MgC12的SB培養基中，37°C振搖8h后加入IPTG至終濃度lmM，37°C誘導表達2處。4°(：，10 000* g離心后收集菌體-80°C保存。
[0066] 細菌沉淀用含8M尿素的磷酸鹽緩沖液重懸，置于冰上，用超聲破碎細胞儀進行裂 解。10000*g 4°C離心30min，上清經0.22μηι濾膜過濾后用HisTrap親和層析柱純化蛋白。洗 脫下的目的蛋白通過濃度梯度透析復性至尿素小于〇. 125mM，超濾濃縮后得到高濃度蛋白。 Western與SDS-PAGE結果表明我們成功表達并純化了 scFv-C27，其分子量約30kD(圖5) [0067] 實施例3ZnT8特異性scFv的特性分析
[0068] Western blot檢測：將純化的重組ZnT8氨基羧基融合蛋白經12%蛋白質膠電泳后 轉至PVDF膜上，5%牛奶封閉后，用純化的scFv作為一抗，HRP標記的ΗΑ抗體作為二抗，檢測 scFv-C27與ZnT8的結合活性。結果顯示scFv-C27可檢測到氨基羧基融合蛋白，在20kD左右 可見明顯條帶，與預期相符，而陰性對照未見條帶，說明scFv-C27與ZnT8蛋白具有良好的結 合能力（圖6)。
[0069] 親和力檢測：由蘇州百拓生物技術有限公司完成。親和力結果顯示scFv-C27與 ZnT8氨基羧基融合蛋白具有較高的親和力，親和力為5 · 397 X l(T8kD(M)(圖7)。
[0070] ELISA檢測：將純化的ZnT8羧基末端二聚突變體蛋白按0.5yg/孔包被ELISA板， scFv-C27從1:10倍比稀釋至1:20480，檢測scFv-C27與ZnT8結合的量效變化。如圖8所示，隨 著scFv-C27濃度的倍比稀釋，其與ΖηΤ8羧基端二聚突變體蛋白的結合能力逐漸降低，說明 scFv-C27以濃度依賴方式與ΖηΤ8抗原肽結合。
[0071] 免疫組化:我們將C27抗體作為一抗，通過間接標記的方法進行免疫組化實驗，抗 體孵育后的人胰腺組織切片的胰島細胞呈強陽性，說明C27抗體具有良好的生物活性，能夠 特異的識別人胰島辟田胞表達的ΖηΤ8蛋白。
[0072]以上結果均表明scFv_C27能夠與人ΖηΤ8特異性結合。
【主權項】
1. 抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體SCFV-C27，包括輕鏈和重鏈，其特征在于： 所述的輕鏈的可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述的重鏈的可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根據權利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27,其特征在于所述 的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。3. -種編碼權利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27的基因，其特 征在于： 編碼輕鏈的可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 編碼重鏈的可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4. 根據權利要求3所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。5. 權利要求1或2所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27在制備1型糖尿病 診斷、治療和/或預后判斷試劑中的應用。6. 權利要求3或4所述的編碼權利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特異性單鏈抗體scFv-C27的基因在制備1型糖尿病診斷、治療和/或預后判斷試劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/13GK106084051SQ201610523803
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】張梅, 張曉 , 楊濤, 吳倩, 陳恒, 秦瑤
【申請人】張梅