324aa小分子多肽及其載體和應用
【專利摘要】本發明公開了324aa小分子多肽及其載體和應用。本發明利用生物工程技術基因重組一段324個氨基酸多肽對應的DNA序列到PCMV?HA真核表達載體。細胞學實驗表明此多肽具有抑制膠質瘤細胞活性和生長的重要抗癌功能。發明為腫瘤治療開發新的靶點提供實驗依據，對于應用于腫瘤的臨床治療具有十分重要的開發應用前景。
【專利說明】
324aa小分子多肽及其載體和應用
技術領域
[0001]本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及324aa小分子多肽及其載體和應用。
【背景技術】
[0002] 膠質瘤(Glioma)是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，其發病率約占顱內原發腫瘤 的50%，且近2/3的膠質瘤是高度惡性腫瘤，每年全球約有近60萬中青年人死于該疾病。由 于膠質瘤具有發病率、復發率及死亡率高、治愈率低的特點，成為神經外科領域臨床治療的 難題之一。因此，加強治療膠質瘤的研究，探索新的治療途徑具有十分重要的意義。
[0003] 在膠質瘤進展過程中，某些基因的表達發生變化，是膠質瘤發生發展的關鍵基因， 成為膠質瘤治療的潛在靶點。目前用于膠質瘤的臨床治療的潛在靶點鮮見報道。
【發明內容】
[0004] 發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種324aa小分子多 肽，具有抗膠質瘤的應用價值。本發明的另一目的是提供上述324aa小分子多肽的表達載 體。本發明還有一目的是提供上述324aa小分子多肽的應用。
[0005] 技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：
[0006] 324aa小分子多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007] 編碼所述的324aa小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0008]含有所述的324aa小分子多肽的編碼基因的DNA序列的載體。
[0009]所述的載體，將324aa小分子多肽的DNA序列連接進PCMV-HA真核表達載體，構建出 重組表達質粒。
[0010]所述的324aa小分子多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0011] 有益效果：與現有技術相比，本發明利用生物工程技術，基因重組一段324個氨基 酸(amino acid)多肽對應的DNA序列到PCMV-HA真核表達載體，經酶切和序列分析證明重組 成功后，將此真核表達重組多肽轉染到膠質瘤細胞中，免疫印跡證明多肽的蛋白表達，實現 了多肽的重組，接著對多肽的抗膠質瘤功能進行了研究，細胞學實驗表明此多肽具有抑制 膠質瘤細胞活性的重要抗癌功能。為腫瘤治療開發新的靶點提供實驗依據，對于應用于腫 瘤的臨床治療具有十分重要的開發應用前景。
【附圖說明】
[0012] 圖1是PCMV-HA真核表達載體的結構示意圖；
[0013]圖2是324aa多肽對應的DNA序列免疫印跡蛋白表達結果圖，大小為37KD;
[0014]圖3是PI染色流式細胞術檢測324aa多肽抑制U251細胞增殖結果圖；
[0015]圖4是CCK-8實驗檢測324aa多肽對U251活性的抑制結果圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯，科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0017] 實施例1 324aa多肽重組
[0018]抑制膠質瘤細胞活性的324aa多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼該蛋 白的DNA序列如SEQ ID N0.2所示。本實施例的多肽重組表達質粒是將SEQ ID N0.2序列連 接進PCMV-HA真核表達載體(圖1)。主要過程如下：
[0019] 1)重組肽的克隆載體構建
[0020] 提取人的mRNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，上游引物為5'-CGGAATTCGGGTGAGGAGCAGGCAAATGT (含EcoRl 酶切位點）；下游引物為5 ' -GGGGTACCTGTGATGGAAGGGGGGGA(含Kpnl酶切位點），應用PCR技術成功擴增出324aa對應的 972bp的mRNA序列。擴增得到的片段與PCMV-HA載體連接，將連接產物轉入感受態大腸桿菌 DH5a中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質粒后，以EC0R1酶切鑒定。主 要步驟如下：
[0021] (1)在冰浴中，將以下各成分加入一無菌0.2mL離心管中。
[0022] 總體積50uL:5uL lOXPfu Buffer，4uL dNTP(2mM)，luL模板，luL上游引物，luL下 游引物，〇.5uL Pfu酶，37.5uL ddH20。
[0023] (2)將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93°C預變性3-5min，進入循環擴增階段:93°C30s-58°C30s-72°C30s，循環30次，最后在72°C保溫7min。
[0024] (3)結束反應，PCR產物放置于4 °C待電泳檢測或-20 °C長期保存。
[0025] (4)PCR的電泳檢測:取PCR產物加6 X上樣緩沖液，電泳檢測。
[0026] 2)重組肽的真核表達載體構建及其表達鑒定
[0027]將含有324aa多肽核酸片段的PCMV-HA質粒經EC0R1酶切后，利用回收試劑盒獲得 該片段，同時用相同的酶處理質粒PCMV-HA，然后將回收多肽核酸片段和經酶切的載體 pcDNA3.1在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過夜。酶切鑒定重組體。將正確連接的324aa多 肽真核表達載體轉染U251細胞，48小時后搜集樣品，RIPA細胞裂解液裂解，免疫印跡結果證 明了多肽的表達，如圖2所示。
[0028]實施例2重組肽抗膠質瘤功能的檢測
[0029] 1)PI染色流式細胞術實驗證明重組肽細胞水平的抗膠質瘤效應 [0030] PI染色流式細胞分析術檢測細胞周期：在U251細胞中，轉染野生型、324aa片段截 短的MDM2載體48h后，胰酶消化細胞，完全培養基終止消化并收集到5mL EP管中離心后棄掉 培養基，用預冷的細胞PBS重懸洗滌3次，離心，棄掉PBS，用70 %乙醇重懸，置于-20 °C固定至 少24h。檢測前，離心收集的細胞，棄乙醇，用roS洗滌3次，并用含l%Triton X-100的roS，4 。(:通透，每管200yL。后加入RNaseA，避光4°C反應，每管300-400yL。加入200yL PI染色劑，避 光4°C染色20min，每管200yL，流式細胞儀檢測。結果如圖3,324aa多肽能夠抑制膠質瘤細胞 增殖。
[0031] 2)CCK-8實驗證明重組肽細胞水平的抗膠質瘤效應
[0032] CCK-8細胞增殖實驗:在U251細胞中，轉染野生型，324aa片段截短的MDM2載體48h 后收集細胞，每孔5000個細胞接種到96孔板，每孔體積100yL。待細胞完全貼壁后(根據實驗 目的和實際情況決定培養時間），每孔換液(CCK-8與培養液的比例為1:10)，37°C孵育2h，終 止培養，酶標儀以490nm波長測量各孔的吸光度值，每組設四復孔。每24h測定各組CCK-8吸 光度值一次，共檢測5天，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。結果如圖4， 324aa多肽能夠抑制膠質瘤細胞的活性。
【主權項】
1.324aa小分子多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 編碼權利要求l所述的324aa小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。3. 含有權利要求2所述的324aa小分子多肽的編碼基因的DNA序列的載體。4. 根據權利要求3所述的載體，其特征在于：將324aa小分子多肽的DNA序列連接進 PCMV-HA真核表達載體，構建出重組表達質粒。5. 權利要求1所述的324aa小分子多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK106084028SQ201610514367
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月30日
【發明人】沈愛國, 王燏嬋, 王東林, 許 鵬
【申請人】南通大學