一種單環刺螠內臟蛋白源鋅螯合肽的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種單環刺螠內臟蛋白源鋅螯合肽，該鋅螯合肽的氨基酸序列為Phe?Pro?Tyr?Lys?His，ESI?MS檢測分子量為690.78 Da。制備時以單環刺螠內臟作為原料，經內臟的預處理、蛋白提取、酶解、凝膠純化和色譜制備而得；該鋅螯合肽為補鋅保健食品和藥物開發提供了一種技術支持，同時也為單環刺螠內臟的高值化利用提供了一條新思路。
【專利說明】
[0001] 一種單環刺螆內臟蛋白源鋅螯合肽
技術領域
[0002] 本發明涉及一種動物內臟活性多肽，尤其涉及單環刺縊內臟蛋白源鋅螯合肽。
【背景技術】
[0003] 活性生物肽以廣泛的生物活性及其在醫藥、保健品、食品和化妝品等應用上的獨 特功效被越來越多的消費者所青睞，使其成為食品行業和保健品行業、日化行業所競相關 注的焦點。鋅是人體必須的微量元素，其缺乏可導致兒童生長發育不良、智力發育落后、免 疫力降低等病癥。傳統的鋅補充劑(如葡萄糖酸鋅、檸檬酸鋅)吸收利用率低，腸胃刺激大， 不易長期服用。而鋅與金屬螯合肽形成的螯合鹽，即可促進微量元素的吸收，同時又能滿足 機體對活性肽、氨基酸等的需求，得到了國內外學者的廣泛關注。
[0004] 單環刺婦（Urechis unicinctus)，俗名海腸、海腸子，屬于婦蟲動物門、婦綱、無 管縊目、刺縊科。體粗大，長約100-300 mm，寬約25-27 mm，長200mm-250 mm，體表滿布大小 不等的粒狀突起，吻圓錐形;腹剛毛1對，粗大;肛門周圍有一圈9-13條褐色尾剛毛。分布于 俄羅斯、日本、朝鮮和我國黃渤海沿岸，是我國北方沿海泥沙岸潮間帶下區及潮下帶淺水區 底棲生物的常見種。它個體肥大，肉味鮮美，體壁肌富含蛋白質和多種人體必需氨基酸。 自古以來，在我國、日本和朝鮮沿海均作為名貴的海鮮食品，有較高的經濟價值。人們的傳 統做法只食用其體壁，而廢棄內臟，浪費的寶貴的漁業資源。
[0005] 基于此，
【申請人】以單環刺縊內臟為原料，利用現代生物技術制備一種具有金屬鋅 螯合活性的肽，既增加了單環刺縊資源的利用率，減少了內臟作為下腳料對環境的危害，同 時也為單環刺縊內臟的高值化利用提供了 一條新思路。
[0006]
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種單環刺縊內臟蛋白源鋅螯合肽。
[0008] 本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:一種單環刺縊內臟蛋白源鋅螯 合肽，其特征在于該鋅螯合肽的氨基酸序列為Phe-Pr〇-Tyr-Ly S-His(FPYKH)，ESI-MS檢測 分子量為690.78 Da。
[0009] 該鋅螯合肽的制備方法，可以通過以下方法制備： 1)單環刺縊內臟的預處理:將單環刺縊內臟剪碎后用組織攪碎器攪成勻漿。丙酮攪拌 脫脂過夜，離心棄去上清，沉淀在40 °C的鼓風干燥箱內烘干過夜后粉碎，得單環刺縊內臟 粉。
[0010])單環刺縊內臟蛋白的制備：取單環刺縊內臟粉按1: 20(質量體積比，50 g: 1000 mL)加入蒸餾水，于80°C的恒溫水浴鍋內加熱4h后，離心取上清液，重復三次上述步驟，最終 得到的上清液為實驗樣品，濃縮凍干。
[0011])單環刺縊內臟蛋白的酶解:將樣品按1:5(質量體積比，10 g:50 mL)加入蒸餾水， 然后調節pH 6.8,加入2%(質量分數)木瓜蛋白酶在60 °C水浴中加熱4 h，后用100°C水浴加 熱15 min滅酶，在離心機中4500 rpm離心20 min后取上清液。接著采用胰蛋白酶水解4 h， 提取溫度60 °C，pH: 10，加酶量0.5%(質量分數）。提取完成后調pH至中性后100°C水浴加熱 15 min滅酶，在離心機中4500 rpm離心20 min后取上清液。減壓濃縮至原體積的1/20后，使 用95%乙醇沉淀，使乙醇終濃度約為80%，于4 °C冰箱中放置過夜，上清濃縮冷凍干燥，得單 環刺縊內臟蛋白酶解產物 4)單環刺縊內臟鋅螯合肽的制備： ① Sephadex G-15凝膠色譜柱層析； 取單環刺婦內臟蛋白酶解產物用蒸餾水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝膠色 譜柱2.0 cmX 100 cm進行分離純化，流動相為蒸餾水，洗脫速度為0.5 ml/min，自動部分收 集器收集，每管收集3mL，280 nm測定吸光度，收集各峰，凍干備用 ② 高效液相色譜的分離純化； 用高效液相色譜進一步分離純化。色譜條件如下：色譜柱為反相C18鍵合硅膠柱 (Zorbax C18, 250 mmX4.6 mm, 5 μπι);流動相:A水，B乙腈，梯度洗脫條件見下表1;流速： 1.0 ml/min，柱溫30°C，檢測波長為254 nm和280 nm，收集主要色譜峰，凍干備用得到短肽 樣品。
[0012] 表1高效液相色譜分離條件
，根據對Zn的螯合活性得1個高活性的鋅螯合肽Phe-Pr〇-Tyr-Lys-His(FPYKH)，ESI/MS 檢測分子量為690.78 Da。
[0013] 本發明基于多肽與金屬離子螯合的理論基礎，以及多肽-Zn螯合物的獨特功效(可 同時補充多肽/氨基酸和Zn)，以單環刺縊內臟為原材料，通過對木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的 酶解條件控制，制備出具有高活性的鋅螯合肽。本發明即為補鋅保健食品和藥物開發提供 了一種技術支持，同時也為單環刺縊內臟的高值化利用提供了一條新思路。
[0014]
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明的葡聚糖凝膠G-15層析圖。
[0016] 圖2是本發明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物的RP-HPLC分析圖。
[0017] 圖3是本發明的多肽的質譜圖。
[0018] 圖4是本發明的多肽的結構式。
[0019]
【具體實施方式】
[0020] 以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0021] -種單環刺縊內臟蛋白源鋅螯合肽，其制備工藝流程如下:單環刺縊內臟"蛋白提 取〃酶解〃酶解物〃凝膠純化〃高效液相色譜制備〃鋅螯合肽。
[0022] 實施例： 1)單環刺縊內臟的預處理:將單環刺縊內臟剪碎后用組織攪碎器攪成勻漿。丙酮攪拌 脫脂過夜，離心棄去上清，沉淀在40 °C的鼓風干燥箱內烘干過夜后粉碎，得單環刺縊內臟 粉。
[0023])單環刺縊內臟蛋白的制備：取單環刺縊內臟粉按1:20(質量體積比，50 g: 1000 mL)加入蒸餾水，于80°C的恒溫水浴鍋內加熱4h后，離心取上清液，重復三次上述步驟，最終 得到的上清液為實驗樣品，濃縮凍干。
[0024])單環刺縊內臟蛋白的酶解:將樣品按1:5(質量體積比，10 g:50 mL)加入蒸餾水， 然后調節pH 6.8,加入2%(質量分數)木瓜蛋白酶在60 °C水浴中加熱4 h，后用100°C水浴加 熱15 min滅酶，在離心機中4500 rpm離心20 min后取上清液。接著采用胰蛋白酶水解4 h， 提取溫度60 °C，pH: 10，加酶量0.5%(質量分數）。提取完成后調pH至中性后100°C水浴加熱 15 min滅酶，在離心機中4500 rpm離心20 min后取上清液。減壓濃縮至原體積的1/20后，使 用95%乙醇沉淀，使乙醇終濃度約為80%，于4 °C冰箱中放置過夜，上清濃縮冷凍干燥，得單 環刺縊內臟蛋白酶解產物 4)單環刺縊內臟鋅螯合肽的制備： ① Sephadex G-15凝膠色譜柱層析； 取單環刺婦內臟蛋白酶解產物用蒸餾水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝膠色 譜柱2.0 cmX 100 cm進行分離純化，流動相為蒸餾水，洗脫速度為0.5 ml/min，自動部分收 集器收集，每管收集3mL，280 nm測定吸光度，收集各峰，凍干備用 ③高效液相色譜的分離純化； 用高效液相色譜進一步分離純化。色譜條件如下：色譜柱為反相C18鍵合硅膠柱 (Zorbax C18, 250 mmX4.6 mm, 5 μπι);流動相:A水，B乙腈，梯度洗脫條件見下表1;流速： 1.0 ml/min，柱溫30°C，檢測波長為254 nm和280 nm，收集主要色譜峰，凍干備用得到短肽 樣品。
[0025]表1高效液相色譜分離條件
，根據對Zn的螯合活性得1個高活性的鋅螯合肽Phe-Pr〇-Tyr-LyS-His(FPYKH)。
[0026] 鋅螯合肽對鋅離子的螯合作用采用EDTA滴定法測定:取螯合物100 mg于100 mL 小燒杯中，加水50 mL，滴入HC1(6 mol/L)數滴。搖勻后在水浴上加熱使之完全溶解，冷卻后 定容至100 mL，從中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入pH 10的NH3-NH4C1緩沖液10 mL，鉻 黑T指示劑適量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴定至藍色;記錄消耗EDTA的毫升數，計算 螯合物含鋅量。
[0027] 測定結果表明：純化得到的鋅螯合肽Phe-Pr〇-Tyr-Lys-His(FPYKH)，ESI/MS檢測 分子量為690.78 Da，對鋅離子的螯合能力為78.51 yg/mg，與蛋白酶解產物(26.32 yg/mg) 相比其對Zn的螯合能力有了較大提高。
[0028]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不 限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接 導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種單環刺縊內臟蛋白源鋅螯合肽，其特征在于該鋅螯合肽的氨基酸序列為？1^_ Pro-Tyr-Lys-His，ESI-MS檢測分子量為690 · 78 Da〇
【文檔編號】C07K7/06GK106084000SQ201610239257
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月18日 公開號201610239257.1, CN 106084000 A, CN 106084000A, CN 201610239257, CN-A-106084000, CN106084000 A, CN106084000A, CN201610239257, CN201610239257.1
【發明人】李佩佩, 張小軍, 陳思, 龍舉, 陳蔭
【申請人】浙江省海洋水產研究所